JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
العربية

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

استخدام عنصر Alu الذي يحتوي على جينات صغيرة لتحليل الحمض النووي الريبي الدائري

Published: March 10, 2020
doi:
10.3791/59760
, , ,
1Institute for Molecular and Cellular Biochemistry,University of Kentucky

Summary

نحن نسخ وتحليل الجينات مراسل توليد الحمض النووي الريبي دائرية. هذه الجينات المراسل ة أكبر من الإنشاءات لتحليل الربط الخطي وتحتوي على عناصر Alu. للتحقيق في الحمض النووي الريبي الدائري ، يتم نقل المنشئات إلى الخلايا ويتم تحليل الحمض النووي الريبي الناتج باستخدام RT-PCR بعد إزالة الحمض النووي الريبي الخطي.

Abstract

بالإضافة إلى mRNAs الخطية، العديد من الجينات eukaryotic توليد الحمض النووي الريبي دائرية. يتم إنشاء معظم الحمض النووي الريبي الدائري عن طريق الانضمام إلى موقع لصق 5 ‘مع موقع لصق 3 ‘المنبع داخل ما قبل مرنا، وهي عملية تسمى الربط الخلفي. ومن المرجح أن يكون هذا التعميم بمساعدة الهياكل الثانوية في فترة ما قبل مرنا التي تجلب مواقع التوصيل إلى مكان قريب. في الجينات البشرية، ويعتقد أن عناصر ألو لتعزيز هذه الهياكل الحمض النووي الريبي الثانوية، وعناصر ألو وفيرة ويحمل التكامل قاعدة مع بعضها البعض عندما تكون موجودة في اتجاهات معاكسة في ما قبل مرنا. هنا، ونحن نصف توليد وتحليل كبير، Alu عنصر يحتوي على الجينات المراسل التي تشكل الحمض النووي الريبي الدائري. من خلال التحسين من بروتوكولات الاستنساخ ، يمكن إنشاء جينات المراسل مع ما يصل إلى 20 كيلوبايت طول الإدراج. ويتيح تحليلها في تجارب التعامَل المشترك تحديد العوامل التنظيمية. وهكذا، يمكن لهذه الطريقة تحديد تسلسل الحمض النووي الريبي والمكونات الخلوية المشاركة في تشكيل الحمض النووي الريبي دائرية.

Introduction

الحمض النووي الريبي الدائري
الحمض النووي الريبي الدائري (circRNAs) هي مغلقة بشكل التكافؤ واحد RNAs الذين تقطعت بهم السبل التي يتم التعبير عنها في معظم الكائنات الحية. يتم إنشاؤها من خلال الانضمام إلى موقع لصق المصب 5 ‘إلى موقع لصق المنبع 3 ‘، وهي عملية تسمى الربط الخلفي(الشكل 1A)1. متواليات في مرحلة ما قبل مرنا التي تعرض قاعدة تكميلية قصيرة مثل 30-40 NT جلب المواقع مرة أخرى لصق في محاذاة مناسبة لتشكيل circRNA2. في البشر، عناصر ألو 1، تمثل حوالي 11٪ من الجينوم3، تشكل هياكل الحمض النووي الريبي المزدوجة واسعة في مرحلة ما قبل مرنا بسبب تكاملها الذاتي4،5 ، وبالتالي تعزيز تشكيل circRNAs1.

وفي الوقت الراهن، تم وصف ثلاث وظائف رئيسية للوظائف المتعلقة بالنُسُر. بعض circRNAs ربط microRNAs (ميرناس) ومن خلال عزل قانون مثل الإسفنج ميرنا6. وقد تورطت CircRNAs في النسخ وبعد تنظيم النسخ، من خلال المنافسة مع الربط الخطي7 أو تعديل نشاط عامل النسخ8. وأخيرا، circRNAs تحتوي على إطارات القراءة المفتوحة قصيرة وإثبات من حيث المبدأ تظهر الدراسات التي يمكن ترجمتها9،10. ومع ذلك ، فإن وظيفة معظم circRNAs لا تزال غامضة. تم الكشف عن معظم RNAs دائرية باستخدام الجيل التالي من أساليب التسلسل11. وتكشف التحليلات التفصيلية للجينات الفردية التي تستخدم نُهج RT-PCR المستهدفة أن عدداً كبيراً من الحمض النووي الريبي الدائري لا يزال يتعين اكتشافه12.

استخدام جينات المراسل لتحليل معالجة ما قبل مرنا
تحليل مرنا المستمدة من الحمض النووي المراسل يبني تنتقل العدوى إلى الخلايا هو وسيلة راسخة لدراسة بديل ما قبل مرنا الربط، والتي يمكن تطبيقها على الحمض النووي الريبي دائرية. بشكل عام ، يتم تضخيم الإكسون البديل ، والإنترونالمحيط به ، والطاردين التأسيسيين واستنساخهم في متجه تعبير eukaryotic. في كثير من الأحيان، يتم تقصير الـ introns. يتم نقل الهياكل إلى خلايا eukaryotic وعادة ما يتم تحليلها من قبل RT-PCR13،14. وقد استخدم هذا النهج على نطاق واسع لرسم خريطة مواقع الربط التنظيمية والعوامل العابرة للبالنيابة في تجارب الإرسال المشترك13،15،16،17،18. وبالإضافة إلى ذلك، سمح توليد من البروتين التعبير عن الجينات الصغيرة لفحص المواد التي تغير الربط البديل19،20.

وقد تم تطبيق الأسلوب على الحمض النووي الريبي الدائري. وفي الوقت الراهن، تم وصف ما لا يقل عن 12 عموداً فقرياً صغيراً في الأدبيات وملخصة في الجدول 1. باستثناء نظام التعبير القائم على tRNA21،22، فإنهم يعتمدون جميعًا على مروجي البوليميراز الثاني. هنا ، ونحن نصف طريقة لتوليد minigenes مراسل الإنسان لتحديد رابطة الدول المستقلة والعوامل العابرة للتمثيل المشاركة في توليد الحمض النووي الريبي الدائري. يتم عرض نظرة عامة على الطريقة التي تستخدم متواليات من جين مراسل منشور23 في الشكل 1.

Protocol

1. تصميم الهياكل استخدم متصفح الجينوم UCSC24 لتحديد العناصر المتكررة اللازمة لتشكيل الحمض النووي الريبي الدائري ودمجها في الإنشاءات. الأهم من ذلك ، يجب أن تكون الالتمهيديات للتضخيم خارج العناصر المتكررة. لصق تسلسل الحمض النووي الريبي دائرية(الشكل التكميلي 1 …

Representative Results

تسمح جينات المراسل بتحديد العوامل التنظيمية التي تؤثر على تكوين الحمض النووي الريبي الدائري. ومع ذلك ، فإن هذه الجينات المراسلة كبيرة وتحتوي على عناصر متكررة غالباً ما تجعل الحمض النووي غير مستقر. نظرا لحجمها الكبير ، غالبا ما يكون من الضروري حذف أجزاء من الإنترونات ، وهو ما يتحقق عن طريق …

Discussion

بشكل عام ، الحمض النووي الريبي الدائري منخفضة وفيرة1، مما يعقد دراسة وظيفتها وتشكيلها. على غرار RNAsالخطية 13، واستخدام minigenes مراسل يسمح لتحديد رابطة الدول المستقلة والعوامل عبر المفعول التي تنظم تشكيل الحمض النووي الريبي الدائري. وهكذا، يولد هذا النهج فرضيات يمكن …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل وزارة الدفاع وزارة الدفاع منحة AZ180075. ستيفان ستام يشكر جاكلين نونان الوقف. آنا Pawluchin كان مدعوما من قبل DAAD، الألمانية برنامج التبادل الأكاديمي، جوستين R. ويلدن كان حاصلا على جائزة جامعة كنتاكي ماكس ستيكلر.

Materials

(PEI) Hydrochloride Polysciences 24765-1
Builder tool NEB https://nebuilder.neb.com/#!/
Dark Reader Transilluminator. Clare Chemical Research
Enzymatic DNA assembly kit NEB E2621S
Gel and PCR cleanup kit Promega A9282
Glyco Blue Thermo Fisher AM9516
pcDNA3.1 cloning site Polycloning site https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_1_man.pdf
Polymerase 1 NEB M0491L Q5 DNA polymerase
Polymerase 2 Biorad 1725310 Long range polymerase (NEB), iproof (BioRad)
Polymerase 2 Qiagen 206402 Qiagen long range polymerase kit
Reverse Transcriptase Thermo Fisher 18080044
RNA isolation kit Life Technologies 12183025 Ambion by Life Technologies
RNAse R Lucigen RNR07250 Epicenter/Lucigen
Stable competent cells NEB C3040H NEB stable cells
Standard cloning bacteria NEB C2988J NEB5-alpha competent
Web tool to design primers NEB https://nebuilder.neb.com/#!/
Web-based temperature calculations NEB https://tmcalculator.neb.com/#!/main
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jeck, W. R., et al. Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats. RNA. 19 (2), 141-157 (2013).
  2. Zhang, X. O., et al. Complementary sequence-mediated exon circularization. Cell. 159 (1), 134-147 (2014).
  3. Deininger, P. Alu elements: know the SINEs. Genome Biology. 12 (12), 236 (2011).
  4. Bazak, L., Levanon, E. Y., Eisenberg, E. Genome-wide analysis of Alu editability. Nucleic Acids Research. 42 (11), 6876-6884 (2014).
  5. Levanon, E. Y., et al. Systematic identification of abundant A-to-I editing sites in the human transcriptome. Nature Biotechnology. 22 (8), 1001-1005 (2004).
  6. Hansen, T. B., et al. Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges. Nature. 495 (7441), 384-388 (2013).
  7. Kelly, S., Greenman, C., Cook, P. R., Papantonis, A. Exon Skipping Is Correlated with Exon Circularization. Journal of Molecular Biology. 427 (15), 2414-2417 (2015).
  8. Li, Z., et al. Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (3), 256-264 (2015).
  9. Yang, Y., et al. Extensive translation of circular RNAs driven by N(6)-methyladenosine. Cell Research. 27 (6), 626-641 (2017).
  10. Abe, N., et al. Rolling Circle Translation of Circular RNA in Living Human Cells. Scientific Reports. 5, 16435 (2015).
  11. Salzman, J., Chen, R. E., Olsen, M. N., Wang, P. L., Brown, P. O. Cell-type specific features of circular RNA expression. PLOS Genetics. 9 (9), 1003777 (2013).
  12. Ottesen, E. W., Luo, D., Seo, J., Singh, N. N., Singh, R. N. Human Survival Motor Neuron genes generate a vast repertoire of circular RNAs. Nucleic Acids Research. 47 (6), 2884-2905 (2019).
  13. Stoss, O., Stoilov, P., Hartmann, A. M., Nayler, O., Stamm, S. The in vivo minigene approach to analyze tissue-specific splicing. Brain Research Protocols. 4, 383-394 (1999).
  14. Mardon, H. J., Sebastio, G., Baralle, F. E. A role for exon sequences in alternative splicing of the human fibronectin gene. Nucleic Acids Research. 15, 7725-7733 (1987).
  15. Gaildrat, P., et al. Use of splicing reporter minigene assay to evaluate the effect on splicing of unclassified genetic variants. Methods in Molecular Biology. 653, 249-257 (2010).
  16. Cooper, T. A. Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements. Methods. 37 (4), 331-340 (2005).
  17. Baralle, D., Baralle, M. Splicing in action: assessing disease causing sequence changes. Journal of Medical Genetics. 42 (10), 737-748 (2005).
  18. Percifield, R., Murphy, D., Stoilov, P. Medium throughput analysis of alternative splicing by fluorescently labeled RT-PCR. Methods in Molecular Biology. 1126, 299-313 (2014).
  19. Stoilov, P., Lin, C. H., Damoiseaux, R., Nikolic, J., Black, D. L. A high-throughput screening strategy identifies cardiotonic steroids as alternative splicing modulators. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (32), 11218-11223 (2008).
  20. Shen, M., et al. Pyrvinium pamoate changes alternative splicing of the serotonin receptor 2C by influencing its RNA structure. Nucleic Acids Research. 41 (6), 3819-3832 (2013).
  21. Noto, J. J., Schmidt, C. A., Matera, A. G. Engineering and expressing circular RNAs via tRNA splicing. RNA Biology. , 1-7 (2017).
  22. Schmidt, C. A., Noto, J. J., Filonov, G. S., Matera, A. G. A Method for Expressing and Imaging Abundant, Stable, Circular RNAs In Vivo Using tRNA Splicing. Methods in Enzymology. 572, 215-236 (2016).
  23. Welden, J. R., van Doorn, J., Nelson, P. T., Stamm, S. The human MAPT locus generates circular RNAs. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Basis of Disease. , 2753-2760 (2018).
  24. Casper, J., et al. The UCSC Genome Browser database: 2018 update. Nucleic Acids Research. 46, 762-769 (2018).
  25. Grozdanov, P. N., MacDonald, C. C. Generation of plasmid vectors expressing FLAG-tagged proteins under the regulation of human elongation factor-1alpha promoter using Gibson assembly. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
  26. Wang, Y., et al. A novel strategy to engineer DNA polymerases for enhanced processivity and improved performance in vitro. Nucleic Acids Research. 32 (3), 1197-1207 (2004).
  27. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  28. Conn, S. J., et al. The RNA binding protein quaking regulates formation of circRNAs. Cell. 160 (6), 1125-1134 (2015).
  29. Jeck, W. R., Sharpless, N. E. Detecting and characterizing circular RNAs. Nature Biotechnology. 32 (5), 453-461 (2014).
  30. Pamudurti, N. R., et al. Translation of CircRNAs. Molecular Cell. 66 (1), 9-21 (2017).
  31. Kramer, M. C., et al. Combinatorial control of Drosophila circular RNA expression by intronic repeats, hnRNPs, and SR proteins. Genes & Development. 29 (20), 2168-2182 (2015).
  32. Starke, S., et al. Exon circularization requires canonical splice signals. Cell Reports. 10 (1), 103-111 (2015).
  33. Suzuki, H., Tsukahara, T. A view of pre-mRNA splicing from RNase R resistant RNAs. International Journal of Molecular Sciences. 15 (6), 9331-9342 (2014).
  34. Zhang, X. O., et al. Diverse alternative back-splicing and alternative splicing landscape of circular RNAs. Genome Research. 26 (9), 1277-1287 (2016).
  35. Liang, D., Wilusz, J. E. Short intronic repeat sequences facilitate circular RNA production. Genes & Development. 28 (20), 2233-2247 (2014).
  36. Wang, Y., Mandelkow, E. Tau in physiology and pathology. Nature Reviews Neuroscience. 17 (1), 5-21 (2016).
  37. Fejes-Toth, K., et al. Post-transcriptional processing generates a diversity of 5′-modified long and short RNAs. Nature. 457 (7232), 1028-1032 (2009).
  38. Gao, Q. S., et al. Complex regulation of tau exon 10, whose missplicing causes frontotemporal dementia. Journal of Neurochemistry. 74 (2), 490-500 (2000).
  39. Hartmann, A. M., et al. Regulation of alternative splicing of human tau exon 10 by phosphorylation of splicing factors. Molecular and Cellular Neuroscience. 18 (1), 80-90 (2001).
  40. Wang, Y., Wang, Z. Efficient backsplicing produces translatable circular mRNAs. RNA. 21 (2), 172-179 (2015).
  41. Yang, Y., Wang, Z. Constructing GFP-Based Reporter to Study Back Splicing and Translation of Circular RNA. Methods in Molecular Biology. 1724, 107-118 (2018).
  42. Zheng, Q., et al. Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs. Nature Communications. 7, 11215 (2016).
  43. Jia, W., Xu, B., Wu, J. Circular RNA expression profiles of mouse ovaries during postnatal development and the function of circular RNA epidermal growth factor receptor in granulosa cells. Metabolism. 85, 192-204 (2018).
  44. Liang, D., et al. The Output of Protein-Coding Genes Shifts to Circular RNAs When the Pre-mRNA Processing Machinery Is Limiting. Molecular Cell. 68 (5), 940-954 (2017).
  45. Legnini, I., et al. Circ-ZNF609 Is a Circular RNA that Can Be Translated and Functions in Myogenesis. Molecular Cell. 66 (1), 22-37 (2017).
  46. Li, X., et al. Coordinated circRNA Biogenesis and Function with NF90/NF110 in Viral Infection. Molecular Cell. 67 (2), 214-227 (2017).
  47. Zhang, Y., et al. The Biogenesis of Nascent Circular RNAs. Cell Reports. 15 (3), 611-624 (2016).

Tags

Circular RNAAlternative SplicingGenomic Expression SystemAlu ElementPCR OptimizationUCSC Genome BrowserRepetitive ElementsPrimer DesignExon-intron BordersReverse Complement

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Welden, J. R., Pawluchin, A., van Doorn, J., Stamm, S. Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs. J. Vis. Exp. (157), e59760, doi:10.3791/59760 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image