Summary

Ensayo de incubación de monedas para cuantificar las interacciones competitivas entre aislados de Vibrio fischeri

Published: July 22, 2019
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Summary

Las bacterias codifican diversos mecanismos para participar en la competencia interbacteriana. Aquí, presentamos un protocolo basado en el cultivo para caracterizar las interacciones competitivas entre los aislados bacterianos y cómo afectan a la estructura espacial de una población mixta.

Abstract

Este manuscrito describe un ensayo de incubación de monedas basado en el cultivo para detectar y caracterizar interacciones competitivas entre dos poblaciones bacterianas. Este método emplea plásmidos estables que permiten que cada población sea etiquetada diferencialmente con distintas capacidades de resistencia a los antibióticos y proteínas fluorescentes para la selección y discriminación visual de cada población, respectivamente. Aquí, describimos la preparación y la incubación de monedas de cepas Vibrio fischeri competidores, imágenes por microscopía de fluorescencia y análisis cuantitativo de datos. Este enfoque es simple, produce resultados rápidos y se puede utilizar para determinar si una población mata o inhibe el crecimiento de otra población, y si la competencia se media a través de una molécula difusible o requiere contacto directo con células celulares. Debido a que cada población bacteriana expresa una proteína fluorescente diferente, el ensayo permite la discriminación espacial de las poblaciones competidoras dentro de una colonia mixta. Aunque los métodos descritos se realizan con la bacteria simbiótica V. fischeri utilizando condiciones optimizadas para esta especie, el protocolo se puede adaptar para la mayoría de los aislados bacterianos culturables.

Introduction

Este manuscrito describe un método basado en el cultivo para determinar si dos aislados bacterianos son capaces de interacciones competitivas. Al estudiar poblaciones mixtas, es importante evaluar en qué medida interactúan los aislados bacterianos, particularmente si los aislados compiten directamente a través de mecanismos de interferencia. La competencia de interferenciase se refiere a las interacciones en las que una población inhibe directamente el crecimiento o mata a una población competidora1. Estas interacciones son importantes de identificar porque pueden tener efectos profundos en la estructura y funcióndeuna comunidad microbiana 2,3.

Se han descubierto ampliamente mecanismos para la competencia microbiana en genomas de bacterias de diversos entornos, incluidas las bacterias asociadas al huésped y las bacterias de vida libre4,5,6,7, 8,9. Se han descrito una variedad de estrategias de competencia10,11 incluyendo mecanismos difusibles, tales como productos químicos bactericidas1,12 y péptidos antimicrobianos secretados13 , así como mecanismos dependientes del contacto que requieren contacto de células celulares para transferir un efector inhibitorio a las células diana9,14,15,16,17 ,18.

Aunque las coincubadoras basadas en el cultivo se utilizan comúnmente en microbiología5,8,19, este manuscrito describe cómo utilizar el ensayo para caracterizar el mecanismo de competencia, así como sugerencias para adaptarse el protocolo para su uso con otras especies bacterianas. Además, este método describe múltiples enfoques para analizar y presentar los datos para responder a diferentes preguntas sobre la naturaleza de las interacciones competitivas. Aunque las técnicas descritas aquí se utilizaron anteriormente para identificar el mecanismo de matanza interbacteriana subyacente a la competencia intraespecífica entre cepas simbióticas de bacterias vibrio fischeri coaisladas19,son adecuadas para muchas especies bacterianas, incluidos los aislados ambientales y los patógenos humanos, y pueden utilizarse para evaluar los mecanismos competitivos difusibles y dependientes del contacto. Los pasos en el protocolo pueden requerir optimización para otras especies bacterianas. Dado que más sistemas modelo están ampliando sus estudios más allá del uso de organismos isogénicos para incluir diferentes genotipos10,16,20,21, este método será un recurso valioso para los investigadores que buscan entender cómo la competencia afecta a los sistemas multi-strain o multi-especie.

Protocol

1. Preparar cepas para la incubación de monedas Elija una cepa de referencia adecuada que sirva como objetivo para la competencia bacteriana durante el ensayo de incubación de monedas. Consulte Discusión para conocer las prácticas recomendadas al seleccionar una deformación unitaria de referencia y cómo afectará la deformación unitaria de referencia a los resultados. En este protocolo, la cepa V. fischeri ES114 servirá como cepa de referencia. Determinar qu?…

Representative Results

Con el fin de evaluar las interacciones competitivas entre las poblaciones bacterianas, se desarrolló y optimizó un protocolo de ensayo de acuñación de monedas para V. fischeri. Este método utiliza plásmidos estables que codifican genes de resistencia a antibióticos y proteínas fluorescentes, lo que permite la selección diferencial y la discriminación visual de cada cepa. Mediante el análisis de los datos recogidos del ensayo de incubación de monedas, se puede identif…

Discussion

El ensayo de incubación de monedas descrito anteriormente proporciona un método potente para descubrir la competencia interbacteriana. Este enfoque permitió la identificación de la competencia intraespecífica entre los aislados v. fischeri y la caracterización del mecanismo competitivo19. Aunque el método descrito fue optimizado para la bacteria marina V. fischeri, se puede modificar fácilmente para adaptarse a otras especies bacterianas, incluyendo aislados clínicos y a…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nos gustaría agradecer a los revisores por sus comentarios útiles. A.N.S. fue apoyado por la Fundación Gordon y Betty Moore a través de Grant GBMF 255.03 a la Fundación de Investigación en Ciencias de la Vida.

Materials

1.5 mL Microcentrifuge Tubes Fisher 05-408-129
10 μL multichannel pipette
100 μL multichannel pipette
300 μL multichannel pipette
10 μL single channel pipette
20 μL single channel pipette
200 μL single channel pipette
1000 μL single channel pipette
24-well plates Fisher 07-200-84 sterile with lid
96-well plates VWR 10062-900 sterile with lid
Calculator
Chloramphenicol Sigma C0378 stock (20 mg/mL in Ethanol); final concentration in media (2 μg /mL LBS)
Fluorescence dissecting microscope with camera and imaging software
forceps Fisher 08-880
Kanamycin Sulfate Fisher BP906-5 stock (100 mg/mL in water, filter sterilize); final concentration in media (1 μg/mL LBS)
Nitrocellulose membrane (FS MCE, 25MM, NS) Fisher SA1J788H5 0.22 μm nitrocellulose membrane (pk of 100)
petri plates Fisher FB0875713 sterile with lid
Spectrophotometer
Semi-micro cuvettes VWR 97000-586
TipOne 0.1-10 μL starter system USA Scientific 1111-3500 10 racks
TipOne 200 μL starter system USA Scientific 1111-500 10 racks
TipOne 1000 μL starter system USA Scientific 1111-2520 10 racks
Vortex
Name Company Catalog Number Comments
LBS media
1M Tris Buffer (pH ~7.5) 50 mL 1 M stock buffer (62 mL HCl, 938 mL DI water, 121 g Trizma Base)
Agar Technical Fisher DF0812-17-9 15 g (Add only for plates)
DI water 950 mL
Sodium Chloride Fisher S640-3 20 g
Tryptone Fisher BP97265 10 g
Yeast Extract Fisher BP9727-2 5 g

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Cite This Article
Speare, L., Septer, A. N. Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates. J. Vis. Exp. (149), e59759, doi:10.3791/59759 (2019).

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