Medición de la actividad transcripcional impulsada por la región de control no codificante BK-polioomavirus a través de la citometría de flujo

Los poliomavirus representan una familia independiente de pequeños virus de ADN de doble cadena (ADN DSDNA) con el virus Simian 40 (SV40) como especie prototipo. La infección primaria ocurre principalmente durante la infancia, que generalmente procede nacones sin síntomas de la enfermedad y generalmente causan infecciones latentes en huéspedes inmunes competentes. El BK-polioomavirus (BKPyV) persiste principalmente en las células de los túbulos renales sin causar nefropatías, sin embargo, en caso de deterioro de la competencia inmunitaria después del trasplante renal, el virus puede reactivarse y causar daños graves e insuficiencia del injerto función al alcanzar una viremia alta (1 x 10⁴ copias de ADN BKPyV/ml)^1,2. En aproximadamente el 10% de los receptores de trasplante de riñón, la reactivación del BK-poliomavirus (BKPyV) da como resultado una nefropatía asociada al poliomavirus (PyVAN), que se asoció hasta un 80% con un alto riesgo de fallos de aloinjerto renal^3,4 . Dado que no se dispone de agentes antivirales aprobados, el tratamiento actual se basa en la reducción de la inmunosupresión. Curiosamente, inhibidores de mTOR parecen tener un efecto antiviral; por lo tanto, cambiar la terapia inmunosupresora a la inmunosupresión basada en mTOR podría representar un enfoque alternativo para prevenir la progresión de la viremia BKPyV^5,6,7. Sin embargo, el mecanismo antiviral basado en mTOR todavía se entiende incompletamente. Por lo tanto, se requieren métodos que midan el impacto de posibles agentes antivirales en concentraciones clínicamente relevantes.

El genoma circular del BKPyV consiste en aproximadamente 5 kb que albergan una región de control no codificante (NCCR) que sirve como origen de la replicación y concomitantemente un promotor bidireccional que impulsa la expresión de transcripciones de ARNm de fase temprana y tardía. Dado que los reordenamientos, deleciones y duplicaciones del NCCR de origen espontáneo se encuentran en el BKPyV⁸ patógeno y se acumulan significativamente en pacientes que sufren de PVAN 5,⁹, una comparación de arquetípicos (wt) y re-arreglado (rr) Las actividades del NCCR son útiles para caracterizar la aptitud replicativa viral.

Como se resume en la Figura 1, este protocolo describe un método comúnmente utilizado para medir la actividad transcripcional BKPyV NCCR cuantificando la fluorescencia de dos fluoróforos tdTomato y eGFP expresadas a partir de un reportero plásmido^{5, 9,10,11}. El procedimiento se realiza en presencia del antígeno T grande SV40 (lTAg), que permite analizar el impacto de los posibles agentes antivirales en la actividad temprana y tardía del NCCR por separado⁵. Este ensayo analiza más a fondo el impacto de los reordenamientos en la actividad del NCCR y la comparación con los WT-NCCRs^5,9. El plásmido reportero alberga la señal de poliadenilación tardía SV40 aguas abajo de cada marco de lectura abierto de fluoróforo para asegurar un procesamiento comparable y eficiente de ambas transcripciones para tdTomato y eGFP, respectivamente. En comparación con los métodos basados en qRT-PCR^5,12, este enfoque basado en FACS representa una alternativa compatible de bajo costo y alto rendimiento, ya que no hay protocolos de extracción complicados para el cultivo celular infectado y no costoso se necesitan anticuerpos para la tinción de fluorescencia inmune. Además, dado que una cantidad definida de células fluorescentes se analizan a través de la citometría de flujo, el análisis de los agentes inhibidores del ciclo celular también es posible de manera cuantitativa.