Измерение BK-полиомавируса Некодирования Контроль региона Driven транскрипционной активности через поток цитометрии
Summary
В этой рукописи представлен протокол для выполнения FACS-измерения транскрипционной активности BK-полиомавируса с помощью клеток HEK293T, трансфицированных двунаправленным репортером плазмидом, выражающим tdTomato и eGFP. Этот метод позволяет дополнительно количественно определить влияние новых соединений на вирусную транскрипцию.
Abstract
Полиомавирусы, такие как BK-полиомавирус (BKPyV), могут вызывать тяжелые патологии у пациентов с ослабленным иммунитетом. Однако, поскольку высокоэффективные противовирусные препараты в настоящее время отсутствуют, необходимы методы измерения воздействия потенциальных противовирусных препаратов. Здесь, двойной флуоресценции репортер, который позволяет анализ BKPyV не-кодирования контроля региона (NCCR) инициативе ранней и поздней активности промоутера был построен для количественной оценки воздействия потенциальных противовирусных препаратов на экспрессию вирусных генов через tdTomato и eGFP Выражение. Кроме того, путем клонирования BKPyV-NCCR ампликонов, которые в этом протоколе были образцово получены из крови полученных ДНК иммунокомпромиссных пациентов пересадки почек, влияние NCCR-перестановки на экспрессию вирусного гена может быть определено. После клонирования пациента, полученных ампликонов, HEK293T клетки были трансфицированы с репортером плазмиды, и лечение с потенциальными противовирусными агентами. Впоследствии клетки были подвергнуты FACS-анализ для измерения средней интенсивности флуоресценции 72 ч после трансфекции. Для проверки анализа препаратов, которые имеют потенциальный клеточный цикл ингибирующего эффекта, используются только трансфицирующие и, таким образом, флуоресцентные клетки. Так как этот анализ проводится в больших T Антигена выражая клетки, влияние раннего и позднего выражения могут быть проанализированы в взаимно независимым образом.
Introduction
Полиомавирусы представляют собой независимое семейство небольших двухцепочечных вирусов ДНК (DsDNA) с вирусом Simian 40 (SV40) в качестве прототипа вида. Первичная инфекция в основном происходит в детстве, которые обычно проходят без симптомов заболевания и обычно вызывают скрытые инфекции у иммунных компетентных хозяев. BK-полиомавирус (BKPyV) в основном сохраняется в клетках почек труб, не вызывая нефропатологии, однако, в случае нарушения иммунокомпетентности после пересадки почек вирус может реактивироваться и вызвать серьезные повреждения и нарушения трансплантата функции при достижении высокой виремии (1 х 104 BKPyV копии ДНК / мл)1,2. Примерно в 10% реципиентов пересадки почки реактивация BK-полиомавируса (BKPyV) приводит к полиомавирусу, связанному с нефропатией (PyVAN), которая была до 80% связана с высоким риском отказов почечного аллотрансплантата3,4 . Поскольку утвержденных противовирусных препаратов нет, текущая терапия основана на снижении иммуносупрессии. Интересно, что ингибиторы mTOR, кажется, имеют противовирусный эффект; Таким образом, переключение иммуносупрессивной терапии на основе mTOR иммуносупрессии может представлять собой альтернативный подход для предотвращения прогрессирования виремии BKPyV5,6,7. Тем не менее, на основе mTOR противовирусный механизм в настоящее время все еще не полностью поняты. Таким образом, требуются методы измерения воздействия потенциальных противовирусных препаратов в клинически значимых концентрациях.
Круговой геном BKPyV состоит примерно из 5 кб укрывательство некодирования области управления (NCCR), который служит источником репликации и одновременно двунаправленный промоутер вождения выражение ранней и поздней фазы мРНК стенограммы. Так как спонтанно происходящие NCCR-перестановки, удаления и дублирования находятся в патогенных BKPyV8 и значительно накопленные у пациентов, страдающих от PVAN5,9, сравнение архетипических (WT) и переорганизованы (rr) NCCR-деятельности полезны для характеристики вирусных репликационных фитнес.
Как резюмируется на рисунке 1, этот протокол описывает широко используемый метод для измерения BKPyV NCCR транскрипционной активности путем количественной оценки флуоресценции двух фторофоров tdTomato и eGFP, выраженный от репортера плазмид5, 9,10,11. Процедура проводится в присутствии большого T-антигена SV40 (lTAg), который позволяет анализировать влияние потенциальных противовирусных препаратов на ранние и поздние NCCR-активности отдельно5. Этот анализ далее анализирует влияние перестановок на деятельность НККР и сравнение с wt-NCCRs5,9. Репортер плазмид гавани SV40 конце полиаденилации сигнала вниз по течению каждого флюорофора открытой рамки чтения для обеспечения сопоставимой и эффективной обработки как стенограммы для tdTomato и eGFP, соответственно. По сравнению с qRT-PCR на основе методов5,12, этот подход на основе FACS представляет собой низкую стоимость и высокую пропускную плату совместимой альтернативой, поскольку нет сложных протоколов экстракции для инфицированной культуры клеток и не дорого антитела для иммунной флуоресценции окрашивания необходимы. Кроме того, поскольку определенное количество флуоресцентных клеток анализируются с помощью цитометрии потока, анализ ингибирующих клеточного цикла также возможен в количественном выражении.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой статье представлен широко используемый метод, позволяющий проводить анализ некодирующего контроля региона BKPyV (NCCR), ориентированного на раннюю и поздняя активность промоутера. Активность NCCR может быть измерена одновременно и не нуждается в лизисе трансинфицированных клеток. Кр…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят Барбару Бликманн за отличную техническую помощь. Эти исследования были поддержаны IFORES-программой Медицинской школы Университета Дуйсбурга-Эссена и riMUR-программой Университетского альянса Рур и Научно-исследовательского центра Меркатора Рура (MERCUREl). Авторы благодарят юрген-Маншот-Стифтунг за докторскую стипендию Хелен Елене Серцниг и постоянную поддержку. Сбор и использование материалов для пациентов утверждены комитетом по этике медицинского факультета Университета Дуйсбург-Эссен (14-6028-BO).
Materials
| 100 bp ladder | NEB | N3231 | Any ladder with a range up to 1 kb can be substituted |
| 2-log ladder | NEB | N0550 | Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted |
| Agar-Agar, Kobe I | Carl Roth | 5210.3 | |
| AgeI-HF | NEB | R3552 | |
| Ampicillin Natriumsalz Cellpure | Carl Roth | HP62.1 | |
| Aqua ad iniectabilia | Bbraun | 2351744 | can be substituted by any manufacturer |
| BD FACSCanto™ II | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva | BD Biosciences | ||
| DAPI | Sigma | 10236276001 | |
| DFC450C camera module | Leica | Any camera can be used | |
| DMEM | Gibco | 41966-029 | can be substituted by any manufacturer |
| DMIL LED microscope | Leica | Any fluorescence microscope can be used | |
| DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51104 | can be substituted by any manufacturer |
| E.coli DH5alpha Competent Cells | Thermo Scientific | 18258012 | |
| FBS Superior | MerckMillipore | 50615 | Any FBS can be used |
| FlowJo v10.5.3 | FlowJo, LLC | Any flow cytometry software FBS can be used | |
| Gel Loading Dye, Purple (6X) | NEB | B7024 | Any 6x loading dye can be substituted |
| HEK293T cells | ATCC | 11268 | These cells constitutively express the simian virus 40 (SV40) large T antigen, and clone 17 was selected specifically for its high transfectability. |
| HERAcell® 240i CO2 Incubator | Thermo Scientific | can be substituted by any manufacturer | |
| HotStar PCR kit | Qiagen | 203203 | |
| Intas Gel documentation system | Intas | Any visualisation system for stained DNA containing agarose gels can be used | |
| Low Melt Agarose | Biozym | 850081 | can be substituted by any manufacturer |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985070 | can be substituted by any manufacturer |
| pBKV (34-2) | ATCC | 45025 | Plasmid harboring the full-length genome of BKPyV strain Dunlop; was used as a positive control; DNA Seq. Acc.: KP412983 |
| PBS | Gibco | 14190-136 | |
| PCR Cycler MJ Mini 48-Well Personal Cycler | Bio-Rad | discontinued product | Any thermocycler can be used |
| PCR Nucleotide Mix, 10 mM | Promega | #C1145 | can be substituted by any manufacturer |
| PCR1 and PCR2 Primers | metabion | not applicable | Desalted. Dilute to (10 µM) with PCR grade water |
| PenStrep (100x) | Gibco | 15140-122 | can be substituted by any manufacturer |
| Roti®-GelStain | Carl Roth | 3865 | A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration |
| SpeI-HF | NEB | R3133 | |
| T4-DNA Ligase | NEB | M0202 | |
| TransIT LT1 | Mirus | MIR2300 | |
| Trypsin 0.05% – EDTA | Gibco | 25300-054 | can be substituted by any manufacturer |
| ZymoPURE II Plasmid Kit | Zymo | D4201 | can be substituted by any manufacturer |
References
- Drachenberg, C. B., et al. Histological patterns of polyomavirus nephropathy: correlation with graft outcome and viral load. American Journal of Transplant. 4 (12), 2082-2092 (2004).
- Korth, J., et al. Impact of low-level BK polyomavirus viremia on intermediate-term renal allograft function. Transplant Infectious Disease. 20 (1), (2018).
- Hirsch, H. H., et al. European perspective on human polyomavirus infection, replication and disease in solid organ transplantation. Clinical Microbiology and Infection. 20 Suppl 7, 74-88 (2014).
- Masutani, K., et al. The Banff 2009 Working Proposal for polyomavirus nephropathy: a critical evaluation of its utility as a determinant of clinical outcome. American Journal of Transplantation. 12 (4), 907-918 (2012).
- Korth, J., et al. Impact of immune suppressive agents on the BK-Polyomavirus non coding control region. Antiviral Research. 159, 68-76 (2018).
- Hirsch, H. H., Yakhontova, K., Lu, M., Manzetti, J. BK Polyomavirus Replication in Renal Tubular Epithelial Cells Is Inhibited by Sirolimus, but Activated by Tacrolimus Through a Pathway Involving FKBP-12. Amerian Journal of Transplantation. 16 (3), 821-832 (2016).
- Sanchez Fructuoso, A. I., et al. Mammalian target of rapamycin signal inhibitors could play a role in the treatment of BK polyomavirus nephritis in renal allograft recipients. Transplant Infectious Disease. 13 (6), 584-591 (2011).
- Moens, U., Johansen, T., Johnsen, J. I., Seternes, O. M., Traavik, T. Noncoding control region of naturally occurring BK virus variants: sequence comparison and functional analysis. Virus Genes. 10 (3), 261-275 (1995).
- Gosert, R., et al. Polyomavirus BK with rearranged noncoding control region emerge in vivo in renal transplant patients and increase viral replication and cytopathology. Journal of Experimental Medicine. 205 (4), 841-852 (2008).
- Bethge, T., et al. Sp1 sites in the noncoding control region of BK polyomavirus are key regulators of bidirectional viral early and late gene expression. Journal of Virology. 89 (6), 3396-3411 (2015).
- Gosert, R., Kardas, P., Major, E. O., Hirsch, H. H. Rearranged JC virus noncoding control regions found in progressive multifocal leukoencephalopathy patient samples increase virus early gene expression and replication rate. Journal of Virology. 84 (20), 10448-10456 (2010).
- Bernhoff, E., Gutteberg, T. J., Sandvik, K., Hirsch, H. H., Rinaldo, C. H. Cidofovir inhibits polyomavirus BK replication in human renal tubular cells downstream of viral early gene expression. American Journal of Transplantation. 8 (7), 1413-1422 (2008).
- Widera, M., et al. HIV-1 persistent viremia is frequently followed by episodes of low-level viremia. Medical Microbiology Immunology. , (2017).
- Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. Journal of Visualized Experiment. (6), 247 (2007).
- Drew, R. J., Walsh, A., Laoi, B. N., Crowley, B. Phylogenetic analysis of the complete genome of 11 BKV isolates obtained from allogenic stem cell transplant recipients in Ireland. Journal of Medical Virology. 84 (7), 1037-1048 (2012).
- Dorries, K., Vogel, E., Gunther, S., Czub, S. Infection of human polyomaviruses JC and BK in peripheral blood leukocytes from immunocompetent individuals. Virology. 198 (1), 59-70 (1994).
- Teutsch, K., et al. Early identification of renal transplant recipients with high risk of polyomavirus-associated nephropathy. Medical Microbiology Immunology. 204 (6), 657-664 (2015).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiment. (41), (2010).
- Korth, J., et al. The detection of BKPyV genotypes II and IV after renal transplantation as a simple tool for risk assessment for PyVAN and transplant outcome already at early stages of BKPyV reactivation. Journal of Clinical Virology. 113, 14-19 (2019).
- Caputo, A., Barbanti-Brodano, G., Wang, E., Ricciardi, R. P. Transactivation of BKV and SV40 early promoters by BKV and SV40 T-antigens. Virology. 152 (2), 459-465 (1986).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
