Medição de BK-Polyomavirus não-codificação região controle driven transcriptional atividade via citometria de fluxo

Os poliomavírus representam uma família independente de pequenos vírus de DNA duplo-encalhado (dsDNA) com o vírus Simian 40 (SV40) como uma espécie de protótipo. A infecção primária ocorre principalmente durante a infância, que geralmente prosseguem sem sintomas de doença e geralmente causam infecções latentes em hospedeiros competentes imunológicos. O BK-Polyomavirus (BKPyV) persiste principalmente em células tubulares renais sem causar nefropatologia, no entanto, em caso de comprometimento da imuno-competência após o transplante renal, o vírus pode reativar e causar danos graves e comprometimento do enxerto função ao atingir uma viremia alta (1 x 10⁴ bkpyv DNA cópias/ml)^1,2. Em aproximadamente 10% dos receptores de transplante renal, a reativação do BK-Polyomavirus (bkpyv) resulta em uma nefropatia associada ao poliomavírus (pyvan), que foi de até 80% associada a um alto risco de falhas renais do aloenxerto^3,4 . Desde que nenhum agente antiviral aprovado está disponível, a terapia atual é baseada na redução do immunosuppression. Curiosamente, os inibidores de mTOR parecem ter um efeito antiviral; assim, comutar a terapia imunossupressores ao imunossupressão mTOR-baseado pôde representar uma aproximação alternativa para impedir a progressão do bkpyv viremia^5,6,7. No entanto, o mecanismo antiviral baseado em mTOR é atualmente ainda incompletamente compreendido. Assim, são necessários métodos que medem o impacto de potenciais agentes antivirais em concentrações clinicamente relevantes.

O genoma circular do BKPyV consiste em aproximadamente 5 KB abrigando uma região de controle não-codificante (NCCR) que serve como uma origem de replicação e concomitantemente um promotor bidirecional dirigindo a expressão de transcrições de mRNA de fase precoce e tardia. Desde que ocorra espontâneamente nccr-rearranjos, deleções, e duplicações são encontrados no bkpyv patogénico⁸ e acumulado significativamente nos pacientes que sofrem de pvan^5,9, uma comparação de arquetípico (WT) e Re-arranjado (RR) NCCR-atividades são úteis para caracterizar a aptidão replicativa viral.

Como resumido na Figura 1, este protocolo descreve um método comumente usado para medir a atividade transcricional de BKPyV nccr quantificando a fluorescência de dois fluoróforos tdTomato e EGFP expressos a partir de um repórter plasmídeo^{5, 9,10,11}. O procedimento é realizado na presença do antígeno T SV40 grande (lTAg), que permite analisar o impacto de potenciais agentes antivirais na atividade de NCCR precoce e tardia separadamente⁵. Este ensaio analisa ainda mais o impacto dos rearranjos sobre a atividade da nccr e a comparação com o WT-nccrs^5,9. O plasmídeo do repórter abriga o sinal atrasado da poliadenilação SV40 a jusante de cada frame de leitura aberto do fluoróforo para assegurar o processamento comparável e eficiente de ambos os transcritos para tdtomato e EGFP, respectivamente. Comparado aos métodos baseados em qRT-PCR^5,12, esta aproximação FACS-baseada representa uma alternativa compatível do baixo custo e da taxa de transferência elevada desde nenhuns protocolos complicados da extração para a cultura de pilha contaminada e nenhum caro os anticorpos para a mancha imune da fluorescência são necessários. Além disso, uma vez que uma quantidade definida de células fluorescentes é analisada através da citometria de fluxo, a análise dos agentes inibidores do ciclo celular também é possível de forma quantitativa.