Messung der BK-Polyomavirus Non-Coding Control Region Driven Transcriptional Activity Via Flow Cytometry
Summary
In diesem Manuskript wird ein Protokoll zur FACS-basierten Messung der Transkriptionsaktivität des BK-Polyomavirus unter Verwendung von HEK293T-Zellen vorgestellt, die mit einem bidirektionalen Reporter-Plasmid transfiziert werden, das tdTomato und eGFP exzessiiert. Diese Methode ermöglicht es ferner, den Einfluss neuartiger Verbindungen auf die virale Transkription quantitativ zu bestimmen.
Abstract
Polyomaviren, wie das BK-Polyomavirus (BKPyV), können schwere Pathologien bei immungeschwächten Patienten verursachen. Da jedoch derzeit keine hochwirksamen antiviralen Mittel verfügbar sind, sind Methoden erforderlich, die die Wirkung potenzieller antiviraler Wirkstoffe messen. Hier wurde ein Dual-Fluoreszenz-Reporter konstruiert, der die Analyse der BKPyV-Nicht-Kodierungs-Kontrollregion (NCCR) ermöglicht, die früh und spät epromoternde Aktivität angetrieben hat, um die Auswirkungen potenzieller antiviraler Medikamente auf die virale Genexpression über tdTomato und eGFP zu quantifizieren. ausdruck. Darüber hinaus können durch das Klonen von BKPyV-NCCR-Amplonikern, die in diesem Protokoll exemplarisch aus der blutabgeleiteten DNA immungeschwächter renaltransplantierter Patienten gewonnen wurden, die Auswirkungen von NCCR-Umlagerungen auf die virale Genexpression bestimmt werden. Nach dem Klonen der vom Patienten abgeleiteten Amplika wurden HEK293T-Zellen mit den Reporter-Plasmiden transfiziert und mit potenziellen antiviralen Wirkstoffen behandelt. Anschließend wurden die Zellen einer FACS-Analyse unterzogen, um die mittleren Fluoreszenzintensitäten 72 h nach der Transfektion zu messen. Um auch die Analyse von Medikamenten zu testen, die eine potentielle zellzyklushemmende Wirkung haben, werden nur transfizierte und damit fluoreszierende Zellen verwendet. Da dieser Test in großen T-Antigen-Expressionszellen durchgeführt wird, können die Auswirkungen der frühen und späten Expression auf gegenseitig unabhängige Weise analysiert werden.
Introduction
Polyomaviren stellen eine unabhängige Familie kleiner doppelsträngiger DNA-Viren (dsDNA) dar, wobei das Simian-Virus 40 (SV40) als Prototypart existiert. Die primäre Infektion tritt vor allem während der Kindheit, die in der Regel ohne Krankheitssymptome und in der Regel latente Infektionen bei immunkompetenten Wirten verursachen. Das BK-Polyomavirus (BKPyV) bleibt hauptsächlich in Nierentubulizellen ohne Nephropathologien fort, kann jedoch im Falle einer Beeinträchtigung der Immunkompetenz nach einer Nierentransplantation reaktivieren und schwere Schäden und beeinträchtigte Transplantate verursachen. bei Erreichen einer hohen Virämie (1 x 104 BKPyV DNA-Kopien/ml)1,2. Bei etwa 10% der Nierentransplantationsempfänger führt die Reaktivierung des BK-Polyomavirus (BKPyV) zu einer Polyomavirus-assoziierten Nephropathie (PyVAN), die mit einem hohen Risiko für Renal-Allograft-Ausfällen verbunden war3,4 . Da keine zugelassenen antiviralen Wirkstoffe verfügbar sind, basiert die aktuelle Therapie auf der Reduktion der Immunsuppression. Interessanterweise scheinen mTOR-Hemmer eine antivirale Wirkung zu haben; Daher könnte die Umstellung der immunsuppressiven Therapie auf mTOR-basierte Immunsuppression einen alternativen Ansatz darstellen, um das Fortschreiten der BKPyV-Virämie5,6,7zu verhindern. Der mTOR-basierte antivirale Mechanismus ist derzeit jedoch noch nicht vollständig verstanden. Daher sind Methoden zur Messung der Wirkung potenzieller antiviraler Wirkstoffe in klinisch relevanten Konzentrationen erforderlich.
Das kreisförmige Genom des BKPyV besteht aus ca. 5 kb, die eine nicht-kodierende Kontrollregion (NCCR) beherbergen, die als Ursprung der Replikation dient und gleichzeitig als bidirektionaler Promotor, der die Expression von mRNA-Transkripten der frühen und späten Phase antreibt. Da spontan auftretende NCCR-Umlagerungen, Deletionen und Duplizierungen bei pathogenen BKPyV8 gefunden und bei Patienten mit PVAN5,9signifikant angesammelt werden, wird ein Vergleich von archetypischen (wt) und neu arrangierte (rr) NCCR-Aktivitäten sind hilfreich, um virale reproduziertive Fitness zu charakterisieren.
Wie in Abbildung 1zusammengefasst, beschreibt dieses Protokoll eine häufig verwendete Methode zur Messung der BKPyV NCCR-Transkriptionsaktivität durch Quantifizierung der Fluoreszenz von zwei Fluorophoren tdTomato und eGFP, ausgedrückt aus einem Reporterplasmid5, 9,10,11. Das Verfahren wird in Gegenwart des SV40 large T Antigens (lTAg) durchgeführt, das es ermöglicht, die Auswirkungen potenzieller antiviraler Wirkstoffe auf die frühe und späte NCCR-Aktivität separat zu analysieren5. Dieser Assay analysiert weiter die Auswirkungen von Umlagerungen auf die NCCR-Aktivität und vergleicht mit wt-NCCRs5,9. Das Reporter-Plasmid enthält das SV40-Spätpolyadenylierungssignal nach jedem offenen Leserahmen des Fluorophors, um eine vergleichbare und effiziente Verarbeitung beider Transkripte für tdTomato bzw. eGFP zu gewährleisten. Im Vergleich zu den qRT-PCR-basierten Methoden5,12stellt dieser FACS-basierte Ansatz eine kostengünstige und hohe Durchsatz-kompatible Alternative dar, da keine komplizierten Extraktionsprotokolle für infizierte Zellkultur und keine teuren Antikörper für Immunfluoreszenzfärbung sind erforderlich. Da darüber hinaus eine definierte Menge an fluoreszierenden Zellen mittels Durchflusszytometrie analysiert wird, ist die Analyse von Zellzyklushemmungsmitteln auch quantitativ möglich.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Artikel wird eine häufig verwendete Methode vorgestellt, die die Analyse der BKPyV-Nicht-Kodierungssteuerungsregion (NCCR) ermöglicht, die von einer frühen und späten Promotoraktivität getrieben wird. Die NCCR-Aktivität kann gleichzeitig gemessen werden und benötigt keine Lyse der transfizierten Zellen. Darüber hinaus kann eine relativ große Anzahl von Zellen analysiert werden und die Ko-Transfektion zusätzlicher Marker zur Normalisierung der Fluoreszenzwerte ist nicht notwendig.
<p class="jove_co…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Barbara Bleekmann für die hervorragende technische Unterstützung. Unterstützt wurden diese Studien durch das IFORES-Programm der Medizinischen Hochschule Duisburg-Essen und das RIMUR-Programm der Universitätsallianz Ruhr und das Mercator Research Center Ruhr (MERCUR). Die Autoren danken der Jürgen-Manchot-Stiftung für das Promotionsstipendium von Helene Sertznig und die ständige Unterstützung. Die Sammlung und Verwendung von Patientenmaterial wurde von der Ethikkommission der Medizinischen Fakultät der Universität Duisburg-Essen (14-6028-BO) genehmigt.
Materials
| 100 bp ladder | NEB | N3231 | Any ladder with a range up to 1 kb can be substituted |
| 2-log ladder | NEB | N0550 | Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted |
| Agar-Agar, Kobe I | Carl Roth | 5210.3 | |
| AgeI-HF | NEB | R3552 | |
| Ampicillin Natriumsalz Cellpure | Carl Roth | HP62.1 | |
| Aqua ad iniectabilia | Bbraun | 2351744 | can be substituted by any manufacturer |
| BD FACSCanto™ II | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva | BD Biosciences | ||
| DAPI | Sigma | 10236276001 | |
| DFC450C camera module | Leica | Any camera can be used | |
| DMEM | Gibco | 41966-029 | can be substituted by any manufacturer |
| DMIL LED microscope | Leica | Any fluorescence microscope can be used | |
| DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51104 | can be substituted by any manufacturer |
| E.coli DH5alpha Competent Cells | Thermo Scientific | 18258012 | |
| FBS Superior | MerckMillipore | 50615 | Any FBS can be used |
| FlowJo v10.5.3 | FlowJo, LLC | Any flow cytometry software FBS can be used | |
| Gel Loading Dye, Purple (6X) | NEB | B7024 | Any 6x loading dye can be substituted |
| HEK293T cells | ATCC | 11268 | These cells constitutively express the simian virus 40 (SV40) large T antigen, and clone 17 was selected specifically for its high transfectability. |
| HERAcell® 240i CO2 Incubator | Thermo Scientific | can be substituted by any manufacturer | |
| HotStar PCR kit | Qiagen | 203203 | |
| Intas Gel documentation system | Intas | Any visualisation system for stained DNA containing agarose gels can be used | |
| Low Melt Agarose | Biozym | 850081 | can be substituted by any manufacturer |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985070 | can be substituted by any manufacturer |
| pBKV (34-2) | ATCC | 45025 | Plasmid harboring the full-length genome of BKPyV strain Dunlop; was used as a positive control; DNA Seq. Acc.: KP412983 |
| PBS | Gibco | 14190-136 | |
| PCR Cycler MJ Mini 48-Well Personal Cycler | Bio-Rad | discontinued product | Any thermocycler can be used |
| PCR Nucleotide Mix, 10 mM | Promega | #C1145 | can be substituted by any manufacturer |
| PCR1 and PCR2 Primers | metabion | not applicable | Desalted. Dilute to (10 µM) with PCR grade water |
| PenStrep (100x) | Gibco | 15140-122 | can be substituted by any manufacturer |
| Roti®-GelStain | Carl Roth | 3865 | A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration |
| SpeI-HF | NEB | R3133 | |
| T4-DNA Ligase | NEB | M0202 | |
| TransIT LT1 | Mirus | MIR2300 | |
| Trypsin 0.05% – EDTA | Gibco | 25300-054 | can be substituted by any manufacturer |
| ZymoPURE II Plasmid Kit | Zymo | D4201 | can be substituted by any manufacturer |
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