Mesure de bk-polyomavirus Non-Coding Control Region Driven Transcriptional Activity Via Flow Cytometry

Les polyométavirus représentent une famille indépendante de petits virus de l’ADN à double brin (ADN) avec le virus Simian 40 (SV40) comme espèce prototype. L’infection primaire se produit principalement pendant l’enfance, qui procèdent habituellement sans symptômes de maladie et causent habituellement des infections latentes dans les hôtes immunisés compétents. Le BK-polyomavirus (BKPyV) persiste principalement dans les cellules rénales de tubules sans causer des nephropathologies, cependant, en cas de affaiblissement de la immuno-compétence après transplantation rénale le virus peut réactiver et causer des dommages graves et la greffe altérée fonction lors de l’atteinte d’une virémie élevée (1 x 10⁴ copies d’ADN BKPyV/mL)^1,2. Chez environ 10 % des receveurs de greffe sinain, la réactivation du BK-polyomavirus (BKPyV) entraîne une néphropathie associée au polyomavirus (PyVAN), qui était jusqu’à 80 % associée à un risque élevé d’échecs d’allogreffe rénale^3,4 . Comme aucun antiviral approuvé n’est disponible, le traitement actuel est basé sur la réduction de l’immunosuppression. Fait intéressant, les inhibiteurs de mTOR semblent avoir un effet antiviral ; ainsi, le passage de la thérapie immunosuppressive à l’immunosuppression mTOR-basée pourrait représenter une approche alternative pour empêcher la progression de la virémie de BKPyV^5,6,7. Cependant, le mécanisme antiviral à base de mTOR est actuellement encore incomplet. Ainsi, des méthodes mesurant l’impact d’agents antiviraux potentiels dans des concentrations cliniquement pertinentes sont nécessaires.

Le génome circulaire du BKPyV se compose d’environ 5 kb abritant une région de contrôle non codante (NCCR) qui sert d’origine de la réplication et, en même temps, un promoteur bidirectionnel conduisant à l’expression des transcriptions de l’ARNm de phase précoce et tardive. Puisque les réarrangements, les suppressions et les duplications spontanément se produisant NCCR se trouvent dans LE BKPyV⁸ pathogène et significativement accumulés dans les patients souffrant de PVAN^5,9, une comparaison de l’archétype (wt) et les activités du NCCR réarrangées (rr) sont utiles pour caractériser la condition physique répliquif virale.

Comme résumé à la figure 1, ce protocole décrit une méthode couramment utilisée pour mesurer l’activité transcriptionnelle DU RNC DE BKPyV en quantifiant la fluorescence de deux fluorophores tdTomato et eGFP exprimées à partir d’un plasmide de journaliste^{5, 9,10,11}. La procédure est effectuée en présence de l’antigène T sV40 grand (lTAg), qui permet d’analyser l’impact des agents antiviraux potentiels sur le début et la fin NCCR-activité séparément⁵. Cet analyse analyse davantage l’impact des réarrangements sur l’activité du NCCR et la comparaison avec les Wt-NCCRs^5,9. Le plasmide de journaliste héberge le signal de polyadenylation en retard de SV40 en aval de chaque cadre de lecture ouvert de fluorophore pour assurer le traitement comparable et efficace des deux transcriptions pour tdTomato et eGFP, respectivement. Comparé e aux méthodes qRT-PCR^5,12, cette approche basée sur le FACS représente une alternative compatible à faible coût et à haut débit puisqu’aucun protocole d’extraction compliqué pour la culture cellulaire infectée et aucun coût des anticorps pour la coloration de fluorescence immunisée sont nécessaires. En outre, puisqu’une quantité définie de cellules fluorescentes sont analysées par cytométrie de flux, l’analyse des agents inhibiteurs du cycle cellulaire est également possible d’une manière quantitative.