Kwantificering van drie DNA-laesies door massaspectrometrie en beoordeling van de niveaus in weefsels van muizen die worden blootgesteld aan omgevings fijne deeltjes

Sommige reactieve zuurstofsoorten (ROS) kunnen koolstof dubbele banden van de basissen van DNA en sommige koolstof in deoxyribose moiety oxideren, die geoxideerde basissen en de bundel onderbrekingen van DNA produceert¹. Als een negatief geladen molecuul rijk aan stikstof-en zuurstofatomen, DNA is ook een doelwit voor elektrofiele groepen die covalente reageren met de nucleofiele sites (stikstof en zuurstof), het geven van producten die worden genoemd DNA adducten². Dus, DNA-adducten en geoxideerde DNA-bases zijn voorbeelden van DNA-laesies die nuttig zijn biomarkers voor de toxiciteit beoordeling van stoffen die zijn elektrofiele, het genereren van reactieve elektrofielen op biotransformatie, of induceren oxidatieve stress^{1, 2}. Hoewel de gewijzigde DNA-bases kunnen worden verwijderd uit DNA door base of nucleotide accijns reparatie (BER of NER), de inductie van een onbalans tussen de generatie en verwijdering van DNA-laesies in het voordeel van de voormalige leidt tot een netto stijging van hun niveau in DNA overwerk^{3 . Resultaten zijn de toename van de DNA-mutatie, verminderde genexpressie, en verminderde eiwit activiteit2,4,5,6,7, effecten die nauw verwant zijn aan de ontwikkeling van ziekten. De veranderingen van DNA kunnen diverse cellulaire functies, zoals cel signalering, cel cyclus, de integriteit van het genoom, Telomere stabiliteit, de epigenome, chromatin structuur, het verbinden van RNA, eiwit homeostase, metabolisme, apoptosis, en de differentiatie van de cel beïnvloeden8 ,9. Strategieën om de mutatie tarieven van cellen en de ontwikkeling van chronische ziekten (bijv. kanker, neurodegeneratieve ziekten) te vertragen passeren de kennis van de mutatie bronnen, onder hen, DNA laesies en hun oorzaken.}

ROS gegenereerd endogene in overmaat, als gevolg van blootstelling aan verontreinigende stoffen, aanhoudende ontsteking, ziekte Pathofysiologie (bijv. diabetes), enz., zijn belangrijke oorzaken van Biomolecuul schade, met inbegrip van DNA en lipide schade¹. Als voorbeeld, de zeer reactieve hydroxyl radicale (OH) gevormd uit H₂O₂ reductie door overgang metaalionen (FE^{2 +}, Cu⁺) oxideert de DNA-bases, DNA-suiker moiety en meervoudig onverzadigde vetzuren bij diffusie-gecontroleerde tarieven¹⁰. Onder de 80 reeds gekenmerkt geoxideerd nucleobasen³, de meest bestudeerde is een 8-Oxo-7, 8-dihydroguanine (8-oxoGua) of 8-Oxo-7, 8-dihydro-2′-deoxyguanosine (8-OxodGuo, Figuur 1), een laesie die in staat is om te induceren gt-transversies in zoogdiercellen^10,11. Het wordt gevormd door de mono elektronische oxidatie van guanine, of door hydroxyl radicale of singlet zuurstof aanval van Guanine in DNA¹. Meervoudig onverzadigde vetzuren zijn andere belangrijke doelstellingen van zeer reactieve oxidanten, zoals ^•Oh, die het proces van lipide peroxidatie^1,12te initiëren. Het geeft aanleiding tot vetzuur waterstof peroxiden die kunnen ontbinden aan elektrofiele aldehyden en epoxyaldehydes, zoals malondialdehyde, 4-hydroxy-2-nonenal, 2, 4-decadienal, 4,5-epoxy-(2E)-Decena, hexenal, acroleïne, Crotonaldehyde, die bekwaam om mutagene exocyclic te vormen DNA adducten, zoals malondialdehyde-, Propano-, of etheno adducten^1,12,13. De etheno adducten 1,n²-etheno-2′-Deoxyguanosine (1,n²-εdGuo, Figuur 1) en 1,n⁶-etheno-2′-deoxyadenosine (1,n⁶-εdAdo, Figuur 1 ) zijn voorgesteld als potentiële biomarkers in de pathofysiologie van ontsteking^14,15.

Figuur 1. Chemische structuren van de DNA-laesies gekwantificeerd in de huidige studie. dR = 2 ´-deoxyribose. Dit cijfer is gewijzigd van Oliveira et al.³⁴. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

De studies die in de vroege jaren ‘ 80 worden uitgevoerd lieten de gevoelige opsporing van 8-oxodGuo door hoge prestaties vloeibare chromatografie toe die aan elektrochemische opsporing wordt gekoppeld (HPLC-ECD). De kwantificering van 8-oxodGuo door HPLC-ECD in verscheidene biologische systemen die aan oxiderende voorwaarden worden onderworpen leidde tot de erkenning van 8-oxodGuo als biomarker van oxidatively veroorzaakte basis schade in DNA^1,16. Hoewel robuust en waardoor de kwantificering van 8-oxodGuo in de lage fmol bereik¹⁷, HPLC-ECD metingen vertrouwen op de nauwkeurigheid van de analyt retentietijd voor de identificatie van de analyt en op de chromatografie resolutie om interferenties te voorkomen van andere monster bestanddelen. Aangezien de elektrochemische opsporing het gebruik van zout (b.v., kaliumfosfaat, natriumacetaat) in de mobiele fase vereist, vergt het behoud van adequate analytische voorwaarden routine kolom en materiaal het schoonmaken tijd.

Als alternatief, het gebruik van de bacteriële DNA-reparatie enzym formamidopyrimidine DNA glycosylase (FPG) en, daarna, menselijke 8-oxoguanine glycosylase 1 (hOGG1), voor de opsporing en verwijdering van 8-oxoGua van DNA, ontstond als een manier voor de inductie van DNA-alkali labiele Sites. De alkali labiele plaatsen worden omgezet in de bundel onderbrekingen van DNA en laten de zeer hoge gevoelige indirecte kwantificering van 8-oxoGua door alkalische enige Elektroforese van het gel (de “komeet assay”) toe. De hoge gevoeligheid en de verwezenlijking van de analyses zonder de behoefte aan cellulaire DNA-extractie zijn de belangrijkste voordelen van dit type van analyse. Het geeft de laagste steady-state niveaus van 8-oxoGua in DNA, meestal 7-10 keer lager dan de niveaus verkregen door bioanalytische methoden op basis van HPLC. Het is echter een indirecte meting van 8-oxoGua en sommige nadelen zijn het gebrek aan specificiteit of de onbekende efficiëntie van de reparatie-enzymen gebruikt^1,16,18.

Immunoassays zijn andere set van methoden die worden gebruikt voor de detectie van 8-oxoGua¹ en exocyclic DNA adducten, zoals 1,n⁶-dAdo en 1,n²-dGuo¹². Ondanks de gevoeligheid, is een tekortkoming van het gebruik van antilichamen voor opsporing van de letsels van DNA het gebrek aan specificiteit toe te schrijven aan cross-reactiviteit aan andere componenten van biologische steekproeven, met inbegrip van de normale DNA-basissen^1,12. De exocyclic DNA adducten, met inbegrip van 1,n⁶-Dado en 1,n²-dGuo, kan ook worden gedetecteerd en gekwantificeerd door zeer gevoelige ³²P-postlabeling assays¹². De hoge gevoeligheid van ³²P-postlabeling staat het gebruik van zeer kleine hoeveelheden DNA toe (b.v., 10 µ g) voor opsporing van ongeveer 1 adduct per 10¹⁰ normale basissen¹⁹. Echter, het gebruik van radio-chemicaliën, gebrek aan chemische specificiteit en lage nauwkeurigheid zijn enkele nadelen^19,20.

Een gemeenschappelijke beperking van de hierboven aangehaalde methoden is de geringe selectiviteit of specificiteit voor de detectie van de gewenste moleculen. In dit scenario, HPLC gekoppeld aan electrospray ionisatie tandem massaspectrometrie (HPLC-ESI-MS/MS en HPLC-MS³) geëvolueerd als de gouden standaard voor de kwantificering van gemodificeerde nucleosiden in biologische matrices, zoals DNA, urine, plasma en speeksel ^{1 , 19 , 20}. voordelen van HPLC-ESI-MS/MS methoden zijn de gevoeligheid (meestal in de lage fmol bereik) en de hoge specificiteit die door i) de chromatografie scheiding, II) de karakteristieke en bekende patroon van molecule fragmentatie in de massa de botsings kamer van de spectrometer, en III) de nauwkeurige meting van de geselecteerde massa aan lasten verhouding (m/z) in veelvoudige reactie controle wijze^1,19. Het gebruik van isotopically gelabeld interne normen voegt het voordeel van correcties voor molecule verliezen tijdens de DNA-hydrolyse en analyt verrijking stappen, alsmede voor de verschillen van de analyt ionisatie tussen de monsters. Het helpt ook bij de identificatie van de juiste chromatografie piek wanneer meer dan een piek aanwezig is^1,12,19,20.

Verschillende methoden op basis van HPLC-ESI-MS/MS zijn gebruikt voor de kwantificering van 8-oxodGuo, 1,n⁶-dAdo en 1,n²-dGuo in DNA geëxtraheerd uit verschillende biologische monsters^{12,15,20 ,21},²²,^23,24,25,26,^27,28,29 . De fijne deeltjes (PM_2,5) dragen organische en anorganische chemische producten, zoals polycyclische aromatische koolwaterstoffen (pak’s), Nitro-pak’s, aldehyden, ketonen, carbonzuren, quinolines, metalen, en in water oplosbare ionen, die ontsteking kunnen veroorzaken en oxidatieve stress, voorwaarden die het voorkomen van biomolecule schade en ziekte^30,31,32,33gunst. We presenteren hier gevalideerd HPLC-ESI-MS/MS methoden die met succes werden toegepast voor de kwantificering van 8-oxodGuo, 1,n⁶-Dado en 1,n²-dGuo in Long-, lever-en nier-DNA van A/J muizen voor de beoordeling van de effecten van ambient PM_2,5 exposure³⁴.