环境细颗粒物小鼠组织中三种 DNA 损伤的质谱定量及水平评价

一些活性氧物种 (ROS) 能够氧化 DNA 碱基的碳双键和脱氧核糖中的一些碳键, 产生氧化碱基和 DNA 链断裂¹。作为一种富含氮和氧原子的负电荷分子, DNA 也是与亲核位点 (氮和氧) 共价反应的亲电基团的靶标, 其产物被称为 DNA 加合物²。因此, DNA 加合物和氧化 DNA 碱基是 DNA 病变的例子, 这些病变是对亲电物质的毒性评估、生物转化时产生活性电泳或诱导氧化应激1的有用生物标志物^{, 2}。虽然修改后的 DNA 碱基可以通过碱基或核苷酸切除修复 (BER 或 NER) 从 DNA 中去除, 但诱导 DNA 病变的产生和去除之间的不平衡有利于前者导致他们的 DNA 加班^{水平净增加 3 。结果是 dna 突变率的增加, 基因表达的减少, 蛋白质活性降低2,4,5,6, 7,与疾病的发展。DNA 突变可能会影响多种细胞功能, 如细胞信号转导、细胞周期、基因组完整性、端粒稳定性、表观基因组、染色质结构、RNA 拼接、蛋白质稳态、代谢、凋亡和细胞分化 8 ,9。减缓细胞突变率和慢性病发展 (如癌症、神经退行性疾病) 的策略通过突变来源的知识, 其中包括 DNA 病变及其原因。}

由于接触污染物、持续炎症、疾病病理生理学 (如糖尿病) 等原因, 内生异常过度, 是生物分子损伤的重要原因, 包括 DNA 和脂质损伤¹。例如, 由过渡金属离子 (Fe^{2 +}, cu⁺) 还原的 h2o2 形成的高反应羟基自由基 (oh) 氧化扩散控制下的 DNA 碱基、dna 糖层和多不饱和脂肪酸率¹⁰。在已经有特征的80种氧化核酸酶³中, 研究最多的是 8-oxo-7, 8-二氢鸟嘌呤 (8-oxoGua) 或 8-oxo-7-二氢-2 ‘-脱氧鸟苷 (8-奥科德戈戈,图 1), 这种病变能够诱导 gt 转化。哺乳动物细胞^10,11。它是由鸟嘌呤的单电子氧化或 dna 1 中的羟基自由基或鸟嘌呤的单氧攻击而形成的。多不饱和脂肪酸是高活性氧化剂的其他重要靶点, 如·oh , 它启动了脂质过氧化^1,12的过程。它产生脂肪酸过氧化氢, 可能分解为亲电醛和环氧醛, 如丙二醛, 4-羟基-2-非烯, 2, 4-十二烷基, 4, 5-py-(2e)-十二烯, 六烯, 阿克罗林, 氯酮醛, 这些能够形成诱变的外环 dna 加合物, 如丙二醛、丙醇或乙二醇加合物^1,12,¹³。乙二醇加合物 1,n²-乙二 ‘-脱氧鸟苷 (1,n2-dguo,图 1) 和 1,n⁶-乙二-2 ‘-脱氧腺苷 (1,n⁶-dado,图1) 已被认为是炎症病理生理学^中潜在的生物标志物 14^,15。

图 1.本研究量化的 DNA 病变的化学结构.dR = 2 脱氧核糖。奥利维拉等^人对这一数字作了修改。请点击这里查看此图的较大版本.

20世纪80年代初进行的研究使其能够通过高效液相色谱结合电化学检测 (HPLC-ECD) 对 8-氧郭进行灵敏检测。在氧化条件下, hplc-ecd 对 8-氧果进行定量, 使人们认识到, 8-氧果是 dna^1,16中氧化诱导碱基损伤的生物标志物。虽然在低 fmol 范围¹⁷中, Hplc-ecd 测量具有鲁棒性, 并允许对 8-氧郭进行量化, 但它依赖于分析物保留时间的准确性进行分析物的识别, 并依靠色谱分辨率来避免干扰。其他样品成分。由于电化学检测需要在流动阶段使用盐 (例如, 磷酸钾、醋酸钠), 因此维持适当的分析条件需要常规的柱和设备清洗时间。

或者, 使用细菌 DNA 修复酶甲胺吡啶 dna 糖基酶 (FPG) 和人类8-oxoguanine 糖基酶 1 (Gggg1), 从 DNA 中检测和去除 8-Xooga, 作为诱导 DNA 碱的一种方法网站。碱基不稳定位点转化为 DNA 链断裂, 并允许非常敏感的间接定量 8-奥克瓜通过碱性单细胞凝胶电泳 (“彗星检测”)。高灵敏度和完成的分析, 而不需要细胞 DNA 提取是这种类型的检测的主要优点。它给出了 DNA 中 8-氧瓜的最低稳态水平, 通常比基于高效液相色谱的生物分析方法获得的水平低7-10 倍。然而, 它是一个间接测量的8-oxoGua 和一些缺点是缺乏特异性或未知的效率, 使用^{的修复酶 1,16},¹⁸。

免疫检测是用于检测 8-oxoGua 1 和外环 DNA 加合物^的其他方法, 如 1,n⁶-Dado 和 1,n2-dowo¹²。尽管灵敏度很高, 但使用抗体检测 dna 病变的一个缺点是, 由于与生物样本的其他成分 (包括正常 dna 碱基^1,12)的交叉反应, 缺乏特异性。外环 DNA 加合物, 包括 1,n-dAdo 和 1,n²-dguo, 也可以检测和量化高度敏感的³²p 后标记检测12。³²p 后贴标的高灵敏度允许使用极少量的 dna (例如, 10 微克) 来检测每10个正常碱基中大约1个加合物 19.然而, 放射性化学品的使用、缺乏化学特异性和精度低是一些缺点 19^、20。

上述方法的一个共同局限性是检测所需分子的选择性或特异性较低。在这种情况下, HPLC 与电喷雾电离串联质谱 (HPLC-ESI-MSMS 和 HPLC-MS³) 相结合, 发展成为在 dna、尿液、血浆和唾液等生物基质中定量修饰核苷的黄金标准^1,19,20. hplc-esi-mmsms 方法的优点是灵敏度 (通常在低 fmol 范围内) 和高特异性提供的 i) 色谱分离, ii) 在质量内分子分裂的特征和已知模式分光计碰撞室, 以及 iii) 在多反应监测模式^1,19中准确测量所选质量电荷比 (m/z)。使用同位素标记的内部标准增加了在 DNA 水解和分析物富集步骤中更正分子损失的优势, 以及样品之间分析物电离的差异。当一个峰出现 1^{、12、19、20}时, 它还有助于识别正确的色谱峰。

在从不同生物样本 12^、15、20中提取的 dna 中, 采用了几种基于 hplc-esi-mmsms 的方法对其进行了定量. ^{, 21,22,23,24,25, 26,27, 28,29}.细颗粒 (PM_2.5) 携带有机和无机化学物质, 如多环芳烃 (pahs)、硝基多环芳烃、醛、酮、羧酸、奎诺、金属和水溶性离子, 这些化学物质可能会引起炎症和氧化应激, 有利于生物分子损伤发生的条件和疾病^30,31,32,33。我们在这里验证了 HPLC-ESI-MMSMS 方法, 成功地应用于定量的 8-oxodGuo, 1,n^6-do和 1,n2-dguo 在肺, 肝脏和肾脏 do^对阿美鼠的评估环境 PM_2.5曝光的影响³⁴。