Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Alexander  K. H. Weiss; Max Holzknecht; Elia Cappuccio; Ilaria Dorigatti; Karin Kreidl; Andreas Naschberger; Bernhard Rupp; Hubert Gstach; Pidder Jansen-D&#252;rr

doi:10.3791/59729

JoVE Journal > Biochemistry

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Biochemistry

Выражение, очищение, кристаллизация и ферментные анализы Fumarylacetoacetate Hydrolase Домен-содержащих белков

Published: June 20, 2019

doi:

10.3791/59729

Alexander K. H. Weiss^1,2, Max Holzknecht^1,2, Elia Cappuccio^1,2, Ilaria Dorigatti¹, Karin Kreidl¹, Andreas Naschberger³, Bernhard Rupp³, Hubert Gstach⁴, Pidder Jansen-Dürr^1,2

¹Research Institute for Biomedical Aging Research,University of Innsbruck Austria, ²Center for Molecular Biosciences Innsbruck (CMBI),University of Innsbruck Austria, ³Division of Genetic Epidemiology,Medical University of Innsbruck Austria, ⁴Faculty of Chemistry, Department of Organic Chemistry,University of Vienna Austria

Summary

Выражение и очищение фумарилацетата гидролазы доменных белков описывается на примерах (выражение в E. coli,FPLC). Очищенные белки используются для кристаллизации и производства антител и используются для ферментных анализов. Избранные фотометрические анализы представлены для отображения многофункциональности FAHD1 как оксалоацетат декарбоксилаза и ацилпируватгидроза.

Abstract

Фумарицетоацетат гидролаза (FAH) доменных белков (FAHD) идентифицируются членами суперсемейства FAH в эукариотах. Ферменты этой суперсемейки обычно отображают многофункциональность, включающую в основном гидролазы и декарбоксилазы. В этой статье представлен ряд последовательных методов выражения и очистки белков ФАХД, в основном белков ФАХД 1 (FAHD1) ортологов среди видов (человек, мышь, нематод, растения и т.д.). Покрытыми методами являются экспрессия белка в E. coli,хроматография сродства, ионный обмен хроматографии, препаративная и аналитическая фильтрация геля, кристаллизация, рентгеновская дифракция и фотометрические анализы. Концентрированный белок с высоким уровнем чистоты (Nogt;98%) может быть использован для кристаллизации или производства антител. Белки аналогичного или более низкого качества могут быть использованы в ферментных анализах или использованы в качестве антигенов в системах обнаружения (Western-Blot, ELISA). При обсуждении этой работы, выявленные ферментативные механизмы FAHD1 изложены для описания его гидролазы и декарбоксилазы би-функциональности более подробно.

Introduction

Гидролазаце ао фумариацетата (FAH)¹^,² суперсемейства ферментов описывает группу ферментов, которые разделяют высоко консервированный каталитический домен FAH³^,⁴^,⁵^,⁶ ^, ^{7 (г.} ^, ⁸ ^, ^{9 До 9} ^, ¹⁰. Несмотря на их общий каталитический центр, эти ферменты являются многофункциональными, и большинство из них находятся в прокариот, где они используются для расщепчения соединений, извлеченных из сложных источников углерода³. Только три члена этой семьи были определены в эукариоты до сих пор: имя дает FAH², а также FAH домена, содержащего белок 1 (FAHD1)¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴ ^,¹⁵ и FAH домен-содержащий белок 2 (FAHD2). Истощение FAHD1 было связано с нарушением митохондриального дыхания^13,¹⁶ и связано с обратимым типом клеточного фенотипа сенотипа^14, который связан с промежуточным потенциалом недостатки в электронной транспортной системе. Человек FAHD1 и его ортологии в модельных системах (мышь, нематод, линии раковых клеток, растения и т.д.), а также отдельные варианты точечных мутаций стали зависимыми мишенями потенциального интереса. Для этого исследования жизненно важны рекомбинантный белок при высоких уровнях чистоты, а также информация о каталитических механизмах, управляемых кристаллическими структурами и селективными антителами.

Данная рукопись описывает методы экспрессии белка ФАХД в E. coli,хроматографию сродства, хроматографию ионного обмена, осадки в сульфат аммония, препаративную и аналитическую фильтрацию геля, кристаллизацию, рентгеновскую дифракцию и фотометрические анализы. Цель описанных здесь методов и протоколов состоит в том, чтобы дать рекомендации ученым, работающим в различных областях, таких как бактериология, биология растений, а также исследования на животных и людях, чтобы охарактеризовать членов сверхсемейства FAH, в том числе нехарактерные члены суперсемьи, если они становятся актуальными в конкретной области. Описанные здесь протоколы могут обеспечить ценную поддержку для проектов, направленных на характеристику других прокариотических или эукариотических членов суперсемейства FAH.

Обоснованием описанных здесь методов является тот факт, что для характеристики плохо описанных белков (в частности, метаболических ферментов неизвестной физиологической значимости) подход к началу с очищенных рекомбинантных белков позволяет разработка бесценных, высококачественных исследовательских инструментов, таких как активные ферментные препараты in vitro, высококачественные антитела, а также мощные и специфические фармакологические ингибиторы для отдельных ферментов. Описанные методы требуют быстрой белковой жидкой хроматографии (FPLC) и рентгеновской кристаллографии. Альтернативные методы (например, для выражения белка без химической индукции, или для отображения очистки белка путем центрифугации после тепловой обработки с последующей опреснения и хроматографии исключения размера), можно найти в другом месте¹⁷. В то время как более широкий спектр методов доступен длявыражения и очищения ферментов суперсемейства FAH 2,^7,^9,^17,¹⁸, эта работа фокусируется на экспрессии и очистки белков FAHD, в частности.

В разделе обсуждения данной рукописи более подробно описаны каталитические механизмы, идентифицированные для белка FAHD1 (гидролаза, декарбоксилаза)^15, с тем чтобы продемонстрировать химический характер катализованных реакций. Данные, полученные на основе предыдущей работы⁷^,¹⁵^,¹⁸ (PDB: 6FOG, PDB:6FOH) подразумевает третью активность фермента, как кето-энол изомеразы.

Protocol

1. Выражение белков FAHD в компетентной кишечной палочке Преобразование E. Coli с переносчиками для выражения белка FAHDПРИМЕЧАНИЕ: Шаги, обсуждаемые в следующем разделе, обобщены в эскизе на рисунке 1A,B. Тот же протокол применяется для любого белка FAHD, включая точечные варианты мутантов. Такие варианты могут быть получены с помощью сайта направлены мутагенеза и ПЦР методы19 (например, двусторонний SOE PCR20) из дикого типа кДНК.Рисунок 1 : Усиление компетентной кишечной палочки и индукция экспрессии белка.(A) Введение вектора PET в компетентные бактерии BL21(DE3) pLysS E. coli, описанные в разделе 1. (B) Протокол теплового шока и покрытие PET преобразованы бактерии кишечной палочки, описанные в шаге 1 протокола. Преобразованные бактерии покрываются на пластинах агара LB антибиотиками для отбора. (C) Усиление PET преобразовало бактерии кишечной палочки, описанные в разделе 1. Колонии собирают из агаровой пластины LB и усиливаются в питательной среде (LB или N’CYM) до тех пор, пока бактериальная плотность не достигнет эмпирического порога 0,4. (D) Индукция экспрессии белка через систему DE3-IPTG-pET, описанную в разделе 1 и нарисованный на рисунке 2. Производство белка начинается с применения химического IPTG. В конце раздела 1 собирают бактериальные гранулы, содержащие белок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Получить компетентные BL21 (DE3) pLysS E. coli бактерий и вектора экспрессии PET (см. Таблица материалов). Предпочтительно выбрать вектор pET, который также кодирует N-терминал Его-тег или связанные захвата тега для удобства, чтобы упростить следующие шаги очистки. Получить cDNA белка FAHD выбора и вставить его в активном месте клонирования вектора экспрессии PET, между T7 промоутер и T7 терминатор сайтов, соответственно. После успешного плазмидного усиления и проверки «через секвенирование коммерческим поставщиком (Т7 грунтовки могут быть использованы с системой pET для удобства: T7 промоутер, передний грунт: TAATACGACTCACTATAGGG; Терминатор T7, обратный грунт: GCTAGTTTTTGCTCAGCGG) ) » вставить 5-10 нг плазмида в 100 л компетентных бактерий BL21 (DE3) pLysS E. coli на льду. Не аспирировать вверх и вниз, но слегка нажмите трубку с для того, чтобы смешать содержимое. Держите бактерии на льду в течение 30 минут, осторожно нажав трубку каждые несколько минут. Нагрейте нагревательное устройство или водяную ванну до 42 градусов по Цельсию (точно). Положите трубку, содержащую бактерии в аппарат и держать их в течение 90 с (точно). Положите их на лед немедленно(рисунок 1A). После 5-10 мин на льду, добавить 600 л среды NC’YM (см. Таблица материалов) и положить трубку в инкубатор бактерий. Встряхните трубку на средней скорости, ориентированной вдоль направления встряхивания при 37 градусах по Цельсию в течение 1 ч. Плита 200 л бактериальной культуры на 10 см LB-агарпластинке (см. ТаблицаМатериалов), содержащая отборные антибиотики выбора, например, специфичную для резистентности BL21(DE3) pLysS (хлорамфеникол), и одну для резистентности закодирован на векторе PET (канамицин или ампициллин, рисунок 1B). Культура бактерий на пластине LB-агар в бактериальном инкубаторе на 37 градусов по Цельсию в одночасье. Выражение белков FAHD индукцией IPTGПРИМЕЧАНИЕ: Первые шаги, обсуждаемые в следующем разделе, суммируются как эскиз на рисунке 1C, D. Система экспрессии T7 с помощью комбинации бактериальной кассеты DE3 и векторной системы PET обобщена на рисунке 2.Рисунок 2 : DE3 кассета / PET вектор двойной системы объяснил.(A) Набросанный геном вектора PET преобразовал бактерии BL21(DE3) pLysS E. coli. Родной бактериальный геном несет кассету DE3 (см. панель B), а также лаковой ген, который постоянно выражает блоки лакового репрессора. Неродной вектором pET несет вставку ген абелка, вставленного между промоторазой T7 и последовательностью терминатора. Более подробная информация в панели B. (B) Кассета DE3 родного бактериального генома кодирует информацию для T7 полимеразы с точки зрения E. coli РНК полимеразы оперон. Этот белок, однако, не выражается, потому что блок лака репрессор предотвращает РНК-полимеразы белка от связывания. Поэтому не T7 полимераза выражается и не экзогенный белок выражается. (C) Применение химической IPTG(Таблицаматериалов) искажает структуру блоков лаковых репрессоров и предотвращает их привязку к кассете DE3. В результате, РНК-полимераза теперь может связываться с кассетой, для которой T7 полимеразы выражается, как и экзогенный белок в конечном итоге. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. После успешного формирования колонии, выбрать одну колонию (без каких-либо спутниковых колоний) и разогнать его в 5 мл НЗКИМ или LB среды с антибиотиками, выбранных как раньше (шаг 1.1.7). Культура в бактериальном инкубаторе на 37 градусов по Цельсию на ночь(рисунок 1C). После успешного роста бактерий, усиливать бактерии в 250 мл, 500 мл, или 1 л партий среднего, в зависимости от спроса на количество белка. Приспосабливаются к объему, применяют антибиотики, выбранные в шаге 1.1.7 и добавляйте около 1%-2% плотной бактериальной предкультуры (т.е. от 2,5-5,0 мл до 250 мл среднего объема и т.д.). Возьмите образец для использования в шаге 1.2.5 (1 мл или более) и проверьте оптическую плотность (OD) на 600 нм. Культурная бактерия в бактериальном инкубаторе при 37 градусах по Цельсию при 2-3 ч(рисунок 1С). После 2-3 ч нарисуйте образец для фотометрического анализа. Если ОД на уровне 600 нм достиг 0,4, примените 200 мкм до 1 мМ изопропил-З-Д-тиогалактопираносид (IPTG, см. Таблицаматериалов).ПРИМЕЧАНИЕ: Фактическое значение эмпирическое для каждого белка FAHD или варианта точечной мутации, где 1 мМ IPTG является максимальным, который должен быть применен. Это индуцирует экспрессию белка(Рисунок 1D, Рисунок 2C). После 3-5 часов в бактериальном инкубаторе при 37 градусах Цельсия экспрессия белка исчерпана.ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите раздел обсуждения для комментариев по контролю температуры. Дольше, чем 5 ч встряхивания после индукции не рекомендуется. Возьмите образец для использования в шаге 1.2.5 (1 мл или более) и проверьте оптическую плотность (OD) на 600 нм. Урожай бактериальных гранул с помощью центрифугации при 5000 х г в течение 5 мин. Отбросьте супернатант и заморозьте гранулы при -80 градусов по Цельсию для более длительного хранения или -20 градусов по Цельсию для краткого хранения (рисунок1D). Проверить индукцию с помощью двух извлеченных фотометрических образцов, которые помечены “-I” (до индукции) и “ЗИ” (после индукции). После центрифугации и повторной приостановки бактериальных гранул, анализировать два образца SDS-PAGE, загружая одинаковое количество общего белка.ПРИМЕЧАНИЕ: В образце «Зи» должна быть показана сильная полоса, связанная с молекулярным весом выбранного белка, в то время как образец «-I» не должен содержать эту полосу. Низкий уровень индукции является общей проблемой для производства белков, но уровень выраженного белка часто достаточен для следующих шагов. Высокий уровень индукции является преимуществом, но не является обязательным. 2. Лиза бактериальных гранул и фильтрации мусора В зависимости от того, является ли выбранный белок Егопомеченным или немаркированным, выберите ni-NTA бегущий буфер (Его -теги, см. ТаблицаМатериалов) или ледяной буфер БЕГА HIC (untagged). На каждые 250 мл оригинальной бактериальной суспензии нанесите 5 мл выбранного буфера на бактериальный гранулы (5 мл на 250 мл, 10 мл на 500 мл и т.д.). Добавьте 10 л-меркаптоэтанола (к-МЭ) на 5 мл прикладного буфера. Используйте 10 мл Пастер пайпет механически заставить гранулы в подвеску, царапая и pipetting (избежать образования пузырьков воздуха во время pipetting). В конце концов передать все подвески в одну трубку 50 мл. Предпочтительно sonicate (6x для 15 s на средней силе) подвеска. Центрифуга в течение 30 мин на высокой скорости (10 000 х г)при 4 градусах По цельсию. Фильтр супернатант последовательно с фильтром единиц (например, 0,45 мкм, 0,22 мкм) на льду.ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от предыдущего шага центрифугации, фильтрация непосредственно через небольшой размер поры фильтра может быть утомительной и обычно требует предварительной фильтрации через больший размер поры. DNAse может быть добавлен для улучшения результатов. Храните образец на льду и немедленно приступить либо с разделом 3 или 4, в зависимости от того, белок егопомечены или untagged. 3. Очищение егопомеченных белков FAHD с использованием хроматографии сродства Ni-NTA ПРИМЕЧАНИЕ: Ni2 “ионы связаны через нитрилотриацетической кислоты (NTA) к агарозной мисиной, которая используется в хроматографии сродства (иммобилизованная металлическая ионная хроматография, IMAC, Рисунок 3A). Поли-гистидин аминокислоты метки сильно связываются с этим Ni-chelate, и его помеченные белки могут быть отделены от большинства оставшихся белков. Альтернативой описанной подготовке столбцов Ni-NTA является использование расфасованных столбцов Ni-NTA и системы FPLC. Рисунок 3 : Эскизные иллюстрации распространенных типов хроматографии.(A) Восдоштья колонки Ni-NTA. NTA содержит двухвалентные ионы никеля, которые используются с точки зрения обездвиженной хроматографии сродства металла иона (IMAC). Поли-гистидин теги связывают предпочтительно к этому мотиву и может быть eluted имидазол. (B) Типичное покрытие частиц кремнезема в фенилосновевной гидрофобной хроматографии (HIC-фенил). Гидрофобные белки взаимодействуют с материалом покрытия и задерживаются в их миграции, в то время как другие нет. (C) Типичное покрытие частиц кремнезема в хроматографии ионной взаимодействия. Поляризованные и заряженные белки взаимодействуют с материалом покрытия и задерживаются в их миграции, в то время как другие нет. (D) Мизина кремнезема геля в хроматографии для исключения размера (SEC). На основе определенных пор в материале кремнезема, белки могут быть разделены по их размеру (в первом приближении, соответствующем их молекулярной массе). Небольшие белки пронизывают пористую колонку материала и отсталые, в то время как крупные белки мигрируют быстрее вокруг пористих частиц. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Исходя из шага 2.5 (т.е. белок находится в ni-NTA работает буфер и фильтруется 0,22 мкм фильтра единиц на льду). Подготовьте пустую пластиковую или стеклянную колонку, промыв пустой столбец и прикрепив ее к стабильному фиксатору. Выберите размер столбца в зависимости от объема белковой подвески. Для каждого 10 мл белковой суспензии, применять 500 л ни-NTA агарозового суспензии в колонке (встряхнуть сильно перед использованием). Нанесите наслаженный медленно и капельно на нижний фильтр колонки с помощью пипетки. Пусть столбец оседает, что занимает несколько секунд. Заполните столбец полностью с Ni-NTA работает буфер, гарантируя, чтобы не нарушить агароуз асины. Пусть буфер проходит через гравитацию. Процесс может быть ускорен, применяя давление большого пальца на жидкость (с помощью крышки или перчатки и давления большого пальца), но позаботьтесь, чтобы не исказить агарозную мизину. Нанесите белковую подвеску. Как и прежде, пусть образец проходит через гравитацию. Ускорение этого шага с помощью давления большого пальца не рекомендуется, так как привязка белков к столбце усиливается, если скорость потока низкая. Соберите поток через трубку(Таблица материалов). После того, как образец прошел, заполните всю колонку снова с Ni-NTA работает буфер. Позаботьтесь, чтобы не нарушить агарозную оси. Пусть образец проходит через под действием силы тяжести, но в отличие от предыдущего шага, ускорение процесса с помощью давления большого пальца рекомендуется, так как потенциальные загрязнения из-за неспецифических взаимодействий могут быть нарушены таким образом. Соберите стиральный раствор в трубку. Повторите этот шаг. Поместите УФ-прозрачный кювет под столбец и нанесите 1 мл буфера elution Ni-NTA. Соберите образец, не применяя давление большого пальца на мизину. Проверьте оптическую плотность (OD) образца на 280 нм против пустого образца (т.е. буфера элуции Ni-NTA). Оптимально, образец отображает OD больше, чем 2,5. OD ниже 0,5 означает, что в образце нет значительного количества белка.ПРИМЕЧАНИЕ: Как указано в разделе обсуждения, концентрации соли и имидазола в буфере элуции, возможно, должны быть адаптированы для каждого белка FAHD индивидуально. Повторите шаги 3.1.7 и 3.1.8 до тех пор, пока OD не опустится ниже 0.5. Объедините все образцы с более высоким ОД в трубке на льду. Начните сначала с шага 3.1.4, используя поток через шаг 3.1.5 в качестве нового ввода для этого повторения шага 3.1.5. Повторяйте этот процесс до тех пор, пока первый образец, собранный в шаге 3.1.6, не покажет OD ниже 0,5.ПРИМЕЧАНИЕ: Как указано в части устранения неполадок в разделе обсуждения, его помеченные белки могут связываться недостаточно с Ни2”-ресиной. В таких случаях требуется повторение этого шага или альтернативных методов (например, ионный обмен хроматографией). Возьмите образцы всех промежуточных фракций для анализа SDS-PAGE. Белки FAHD в буфере elution Ni-NTA будут осаждаться при замораживании и оттаивании. Таким образом, диализировать белок против другого буфера (ночь на льду, используя 1 Зл DTT на 100 мл диализа буфера). Используйте низкосолевой буфер, основанный на том, какой тип ионно-обменной хроматографии следует выполнять после этого шага. Используйте общие целлюлозные трубки с типичным молекулярным отсеченым весом 14 kDa(Таблицаматериалов). После ночного диализа, дополнительно сконцентрировать белок с помощью ультра-центрриффации фильтр единиц. Выполните sDS-PAGE анализ (12,5% работает гель, 4% укладки геля), чтобы проверить на потенциальную потерю белка, недостаточное elution, и чистота белка в целом. Если все в порядке, перейдите к разделу 5. 4. Очистка немаркированных белков FAHD с помощью гидрофобной хроматографии взаимодействия (HIC) ПРИМЕЧАНИЕ: Фенил-группы на поверхности покрытия кремнезема гель в колонне HIC для FPLC(Рисунок 3B) позволяют разделение белков в соответствии с гидрофобным характером. Описанные шаги должны выполняться с помощью системы FPLC, оснащенной 5 мл колонны HIC-фенил. Колонны можно мыть с помощью 1 M NaOH для повторного использования для различных белков. Тем не менее, столбцы, когда-то использовавшийся для одного типа белка FAHD, следует повторно использовать только для этого типа белка. Сульфат аммония (AS) Исходя из шага 2.5. Белок находится в ледяном hic бегущий буфер(Таблица материалов). Оцените объем подготовленного белкового раствора точнодо микролитра (V начальный). Медленно и дроп-мудрый добавить предварительно охлажденный HIC работает буфер AS решение, пока 35 объем-% AS насыщения не будет достигнуто: VAS добавил и Vпервоначальный 0,538. Аккуратно перемешайте раствор в течение 30 мин. Центрифуге в течение 15 мин на высокой скорости (10 000 х г) при 4 градусах Цельсия. Фильтр супернатант с помощью 0,22 мкм фильтр ам блок на льду. Дополнительно возьмите образец для анализа SDS-PAGE: разбавить 1:4 и нагреть сразу при температуре 95 градусов по Цельсию в течение 5 минут, иначе образец будет комок. Образец может быть заморожен в этой точке (-20 градусов по Цельсию), чтобы продолжить другой день. FPLC с помощью колонки HIC Настройка системы FPLC и уравновешить 5mL HIC-фенил колонки с 5 объемов колонки (CV) 20% EtOH (в H2O), а затем 5 CV H2O. Смешайте 260 мл бегового буфера HIC (точно) с 140 мл бегового буфера HIC AS (точно). Это приводит к 35 том-% AS решение. Проверьте рН (7.0); это буфер A. Буфер B составляет 250 мл бегущего буфера. Добавьте 1 мМ DTT в оба буфера A и B, а затем держите их на льду. Равновесие столбца с 8 мл буфера A, 8 мл буфера B и 8 мл буфера А в этой последовательности. Примените образец, подготовленный в протокольном шаге 4.1. Вымойте буфером А, пока базовое оптическое поглощение на уровне 280 нм не достигнет 1000-500 мАЧ. Нанесите смесь буферов A и B, так что концентрация AS составляет 33% (w/v). Вымойте 1 CV, в результате чего плато в хроматограмме. Навеяжь градиент буфера B (до 100% буфера B с течением времени): 1,5 мл буфера B за 3,8 мин (т.е. 5,7% буфера B с 1% b/mL наклоном). Когда УФ-сигнал на высоте 280 нм поднимется, начните собирать фракцию и немедленно поместите ее на лед. В конце концов, промыть столбец буфером B. Возьмите образцы всех фракций для анализа SDS-PAGE. Заморозить все образцы с помощью жидкого азота, и хранить их при -80 градусов по Цельсию. Выполните SDS-PAGE (и западный подись) анализ, чтобы обнаружить белок FAHD в собранных фракциях. Фракции, содержащие белок, объединяются и применяются для дальнейшего очищения, как указано в следующих шагах протокола. Вымойте колонку с H2O и 20% EtOH (в H2O). 5. Очистка белков ФАДН с помощью ионной обменной хроматографии ПРИМЕЧАНИЕ: Молекулы с заряженными функциональными группами связаны с столбцом частиц кремнезема для FPLC(рисунок 3C). Это позволяет дифференциру белков в зависимости от их ионного характера, таких как поверхностный заряд. Описанные шаги должны выполняться с помощью машины FPLC и связанных с ней ноу-хау, соответственно. Описанный метод одинаков для катионной или анионической биржевой хроматографии, но буферы, которые необходимо использовать, немного отличаются. Выбрать катионную или анионическую систему хроматографии обмена. Этот выбор является эмпирическим и может варьироваться среди белков FAHD. Оптимально, оба метода могут быть использованы последовательно. Настройка системы FPLC и мыть колонку с 5 CV 20% EtOH (в H2O), а затем 5 CV H2O. Equilibrate колонку с 1 CV низкосолевой буфер, буфер с высоким содержанием соли, и снова низкосолевой буфер в этой последовательности. Нанесите образец (диализированный против правильного буфера низкой соли от шага 3.1.11) на столбец. Соберите поток через. Вымойте столбец для 1 CV с низким буфером соли. Установка градиентного выдвижения: 100% буфер с высоким содержанием соли в 30 мин при скорости потока 1 мл/мин, или 60 мин при скорости потока 0,5 мл/мин. Это может быть переизбран на основе уже известных FPLC хроматограммы, в целях оптимизации очистки. Соберите все пиковые фракции.ПРИМЕЧАНИЕ: Высокосолевой условия могут варьироваться среди белков FAHD, как указано в разделе обсуждения. После того, как градиент закончился, бегите с буфером с высоким содержанием соли, пока не будут обнаружены больше пиков в диапазоне 1 CV (соберите фракции). Возьмите образцы всех собранных фракций и проведите анализ SDS-PAGE (12,5% работает гель, 4% укладки геля). Заморозить отдельные образцы в жидком азоте и хранить их при -80 градусов по Цельсию. После завершения анализа SDS-PAGE объедините образцы, содержащие белок FAHD, и отбросьте остальные. Дополнительно, сконцентрировать белок с помощью ультра-центрриффирования фильтр единиц. Применить 1 мл 25% SDS в 0,5 М НаОГ (или других моющих средств) для очистки колонки. Вымойте колонку с H2O и 20% EtOH (в H2O). Дополнительно повторите раздел 5 с альтернативной колонкой (катионная или анионическая обменная хроматография). Белок, полученный из этого метода, достаточно чист для выполнения основных анализов активности или может быть использован в скрининговых анализах для кристаллографии. Для продвинутых приложений приступаните к разделу 6. 6. Очистка белков ФАХД с помощью хроматографии исключения размера (SEC) ПРИМЕЧАНИЕ: Пористые частицы в колонке кремнезема гель для FPLC позволяют дифференциации белков в зависимости от молекулярного размера, таких как гидродинамический радиус(рисунок 3D). Описанные шаги должны выполняться с помощью системы FPLC с использованием столбцов SEC. Выберите колонку SEC, зависящая от молекулярных весов загрязнений, которые все еще присутствуют, как это обнаружено с помощью SDS-PAGE и окрашивания серебра. Нарисованная методика подходит для обеих столбцов. Вымойте столбец на ночь с 400 мл H2O и уравновешить с SEC работает буфер. Рекомендуется написать программу для системы FPLC, чтобы автоматизировать этот шаг. Добавьте 1 мМ DTT в 300 мл бегового буфера SEC и положите его на лед. Это запущенный буфер. Нанесите 60 мл этого буфера на столбец. Centrifuge образец белка (10000 х г в течение 10 мин), чтобы удалить любые микро-осадков. Нанесите супернатант на столбец. Как правило, рекомендуется фильтровать супернатант перед FPLC. Нанесите бегущий буфер на столбец до тех пор, пока весь белок не будет выдавлен. Соберите все пики в долях подходящего объема (например, 2 мл). Возьмите пробы для SDS-PAGE и заморозить все фракции с использованием жидкого азота. Храните замороженные фракции при -80 градусов по Цельсию. После анализа SDS-PAGE (и западного побелки) соберите и объедините все фракции, содержащие белок FAHD. Серебряное окрашивание рекомендуется для обнаружения незначительных загрязнений, которые все еще могут присутствовать. Используйте ультра-центрифугации фильтр единиц для того, чтобы сконцентрировать белок. Хотя это и не является обязательным для белков ФАХД, в целом опреснительный шаг (например, диализ) рекомендуется для анализов ферментов и кристаллизации. Повторите шаги 6.3-6.6 несколько раз с различными темпами потока и концентрациями соли (эмпирические) для того, чтобы повысить чистоту белка FAHD. Вымойте колонку на ночь с H2O и 20% EtOH (в H2O). 7. Основные анализы активности FAHD с субстратамами оксалоацетата и ацетилпирувата ПРИМЕЧАНИЕ: FAHD белок 1 (FAHD1) отображает оксалоацетат декарбоксилазы (ODx) и ацилпируват гидролазы (ApH) деятельности. Это более подробно изложено в разделе обсуждения. Из-за дестабилизации путем кето-энола таутомеризации в aqueous растворе (т.е., enolization), oxaloacetate распадается собой с течением времени (авто-декарбоксиляция) как функция концентрации кофактора и рН. При температуре рН 7 и температуре 25 градусов по Цельсию этот эффект не является драматичным, но анализы должны быть пустыми для учета как автоматического декарбоксиляции и концентрации ферментов. Схема трубаций изложена на рисунке 4A. В общем, рекомендуется использовать хорошо откалиброванные пипетки для этого асссе, так как он довольно чувствителен к мелким ошибкам трубачирования. Рисунок 4 : Эскизная схема трубача для ферментных анализов.(A) Набросал схему трубаций для основных субстратов на основе ФАСД белковых ферментов анализов. Субстрат пустой: -S/-E; подстратный образец: S/-E; фермент пустой: -S / E; образец фермента: S/’E (S: субстрат, E: фермент). Более подробную информацию можно узнать в протоколе “Шаг 7”. (B) Набросированная схема трубоукладчика для оценки кинетики Микаэлис-Ментена белка ФАХД. Субстрат пустой: -S/-E; подстратный образец: S/-E; фермент пустой: -S / E; образец фермента: S/’E (S: субстрат, E: фермент). Более подробная информация приводится в разделе 8 протокола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Запустите считыватель микроплит и уравновешивают 30 мин при 25 градусах Цельсия. Настройка программы для чтения 12 скважин (как указано на рисунке 4A) на 255 нм. Рекомендуется использовать 25 несколько считывателей с задержкой времени 5 мс. Настройка цикла для измерения 15x каждые 2 мин (30 мин всего). По умолчанию подготовьте буфер асссеа фермента (см. ТаблицаМатериалов) с 1 мМ ММ МГКл2 при рН 7,4. Вариант белков FAHD может потребовать различных кофакторов или уровней рН. Mg2 “и Mn2” известны кофакторы для FAHD13,11,12,21. Создайте 1 мкг/Л белковый раствор, разбавляя ферментным буфером анализов(ТаблицаМатериалов). Настройка 1 мл 20 мМ раствор субстрата для тестирования (до сих пор определены субстраты белков FAHD перечислены в другом месте3) в фермента анализ буфера. В соответствии с схемой трубаций, отображаемой на рисунке 4A,подготовьте ферментные пустые и образец скважин: пипетка 90 злицита ферментного буфера (ТаблицаМатериалов)в скважины с 5 qL (5 мкг) ферментного раствора. В соответствии с схемой трубаций, отображаемой на рисунке 4A,подготовьте заготовку субстрата и образец скважин: пайпет 95 л ферментного ассеа буфера в скважины. Прямо перед измерением, применить 5 зЛ фермента ассеидбуфер асссе в шесть пустых скважин. Нанесите 5 кЛ из 20 мМ подстепового раствора на образцы скважин. Рекомендуется использовать многоканальный пипетку. Используйте многоканальный пипетку при настройках 50 л, чтобы аккуратно смешать все скважины. Начните с заготовок и приступить к образцу скважин. Позаботьтесь, чтобы не создавать никаких пузырьков. Вставьте пластину в микроплиту и измерьте каждый из них на уровне 255 нм (как описано в шаге 7.1). Выполните анализ в электронной таблице. Копируйте исходные данные с фотометра в электронную таблицу и записывайте все настройки (т.е. всю документацию) в другой лист. Среднее значение данных по трем скважинам каждой из четырех подготовительных работ. Вычтите пробел из образца. Также вычислить стандартные отклонения и суммировать отклонения пробела и образца. Участок эти данные (y: оптическая плотность, x: время в мин). Экспоненциально уменьшающаяся кривая должна отображаться. В зависимости от вида использования субстрата может наблюдаться первоначальное увеличение в течение первых 10 минут, после чего сигнал уменьшается. Это приписывается кето-энол таутомеризации субстрата, как описано более подробно в разделе обсуждения. Разделите данные оптического сигнала с течением времени на максимальное значение участка, чтобы масштабировать данные вниз в диапазоне »0, 1» (пример приводится на рисунке 5A). Определите линейный диапазон кривой, начиная с начального снижения, и вычислите отрицательный наклон (1/мин). Временной ход снижения ОД связан с субстратом через его начальную концентрацию: 100 нмоль/колодец. Используя оцененную концентрацию белка c0, вычисляется специфическая активность: 100 нмоль/ну , наклон 1/c0. Выражая c0 в мкг/хорошо, специфическая активность, вычисленные таким образом, выражается с помощью блока nmol/min/мкг, который равен змол/мин/мг. 8. Оценка кинетики микаэлис-Ментен белков ФАХД ПРИМЕЧАНИЕ: Оценка микаэлис-Ментен кинетики белков FAHD утомительно, так как специфическая активность белка зависит как от относительной концентрации белково-субстрата, так и от физического объема, в котором происходит реакция. Для получения надежных результатов необходимо создать кинетику устойчивого состояния. Испытанный протокол на прозрачной пластине 96 скважин уф-уф-излучения изложен в следующих шагах. Каждый шаг нужно выполнять с большой осторожностью, так как мелкие ошибки обычно портят эксперимент. Рекомендуется освоить анализы, изложенные в разделе 7, прежде чем пытаться более сложный анализ, описанный ниже. Рисунок 5 : Примерные результаты ферментных анализов.(A) Образцовая кривая поглощения УФ,полученная для анализов основных субстратов на основе белкового фермента FAHD (нормализованных в диапазонот от 0 до 1) со стандартным отклонением. Соотношение оптической плотности (OD) (OD)/OD(0) в любой момент времени т (т)) нормализуется до первоначального OD no 0; OD (0)». Более подробная информация приводится в разделе 7 протокола. (B) Образцовая микаэлис-ментен кинетика человеческого белка FAHD1 со стандартным отклонением. Более подробная информация приводится в разделе 8 протокола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Запустите считыватель микроплит и уравновешивать в течение 30 минут при 25 градусах Цельсия. Настройка программы для чтения 72 скважин (как указано на рисунке 4B) на 255 нм. Рекомендуется использовать 25 несколько считывателей с задержкой времени 5 мс. Навеяйте цикл, чтобы измерить 15x каждые 2 мин (всего 30 мин). Выполните шаги 7.2 и 7.3. Затем навяжете 1 мл субстрата по 100 мМ в буфере ферментного асссеа. Приготовьте разбавления раствора субстрата в ферментном ассеационном буфере: 40 мМ, 20 мМ, 10 мм, 6 мм, 4 мм, 2 мм. Ассеи проводится с парной (“скорректированной”) концентрацией фермента/субстрата. Для этого подготовьте следующие разбавления ферментного раствора в ферментном ассеевом буфере: 0,5 мкг/Л, 0,4 мкг/Л, 2,5 мкг/Л, 2 мкг/Л, 1,5 мкг/л, 1 мкг/Л. Во все скважины, изображенные на рисунке 4B, применяется 180 qL ферментного буфера асссеа. Нанесите 10 зЛ ферментного буфера асссеа во все скважины для субстрата (пустой и образец). Нанесите 10 зл и ток серии разбавления подготовленного белка в скважины для фермента (пустого и образца). Нанесите 10 зЛ ферментного буфера асссеа во все скважины для скважин для ощеточного субстрата и фермента пустого. Непосредственно перед измерением нанесите 10 злиц подготовленной серии разбавления субстрата в скважины для образца субстрата и фермента. Используйте многоканальный пипетку в настройках 50 л, чтобы аккуратно смешать все скважины, начиная с заготовок, переходя к образец скважин. Позаботьтесь, чтобы не создавать никаких пузырьков. Вставьте пластину в микроплиту и измерьте каждый из них на уровне 255 нм, как описано в шаге 8.1. Выполните анализ в электронной таблице. Копируйте исходные данные с фотометра в электронную таблицу, записывайте все настройки (т.е. всю документацию) в другой лист. Выполняйте индивидуальный анализ данных на одну точку в серии разбавления, как указано в шагах 7.11. до 7,14. В конце концов, получить все конкретные мероприятия и участок против первоначальной концентрации субстрата: 2 мМ, 1 мМ, 0,5 мМ, 0,3 мМ, 0,2 мм, 0,1 мм. Отображение всех точек данных с индивидуальными стандартными отклонениями. Компьютерная кинетика Микелис-Ментен с помощью нелинейной кривой фитинга, или с помощью анализа Lineweaver-Burk. Это может потребоваться для повторного измерения отдельных точек, а также адаптировать отдельные белковые концентрации / субстрата-концентрации парных соотношений в шагах 8,5 и 8,6. Диаграмма Михаэлиса-Ментена для человека FAHD1 представлена на рисунке 5B. 9. Кристаллизация белков ФАХД ПРИМЕЧАНИЕ: Кристаллизация белков FAHD (человек FAHD1 описано ранее15) может быть достигнуто путем висит падение паров диффузии метод в 24 хорошо формате(рисунок 6A). Пошагонный протокол по кристаллизации человека FAHD1 с помощью этой техники представлен ниже15. Более подробное описание приведено в разделе обсуждения. Рисунок 6 : Кристаллизация белков ФАХД.(A) Кристаллизация пластин в стандартных 24 хорошо или 96 хорошо SBS след. Более подробная информация читайте в разделе 9. (B) Основной процесс установки пластинв в кристаллизации белков FAHD. Эта цифра перерисовывается с разрешения23. Более подробная информация читайте в разделе 9. (C) человеческие кристаллы FAHD1 и соответствующие дифракционные узоры (небольшие вставки). Ближайший интервал решетки указан в вставках в качестве меры для дифракции качества кристаллов. Более низкие цифры указывают на более высокое разрешение и, таким образом, более информативные данные. Более подробная информация приводится в разделе 9 протокола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Убедитесь, что белок диализируется против буфера SEC. Белок FAHD1 должен быть доступен при высоких концентрациях (2-5 мг/мл). При более низких концентрациях белок может не кристаллизоваться из-за отсутствия спонтанного ядра. Подготовьте 20 мл раствора резервуара для кристаллизации. Сделать три фондовых раствора, используя дистиллированную или деионизированную воду в качестве растворителя: 1 M Na-HEPES (минимум 25 мл, скорректированы до pH 7.5), 50% (w/v) полиэтиленгликоль 4000 (PEG4k) (минимум 65 мл) и 1 M MgCl2 (10 мл). Настройка сетки 4 х 6 (24 всего) различных 15 мл труб. Пометьте их в соответствии с соответствующими позициями на пластине (например, строка (A, B, C, D) против столбца (1-6), как “A1”, “B5”, “D6” и т.д.. . Пипетка 1 мл 1 M Na-HEPES в каждой трубке. Пипетка 1 мл 50% (w/v) PEG4k в ряд A труб, 2 мл в ряд B, 3 мл в ряд C, и 4 мл в ряд D. Pipette 100 л 1 M MgCl2 в колонку 1 из труб, 250 л в колонку 2 , 500 л в столбец 3, 1,0 мл в столбец 4, 1,5 мл в столбец 5 и 2,0 мл в столбец 6. Заполните все трубы объемом до 10 мл дистиллированной или деионизированной водой, где шкала на трубах достаточно точна. Возьмите человеческий образец белка FAHD1 (5 мг/мл) из холодильника (или со льда) и вращайтесь на максимальной скорости с центрифугой столешницы при 4 градусах По Цельсию в течение по крайней мере 10 мин. Если желать кок-кристаллизации с оксалатом, добавьте оксалат из запасного раствора так, чтобы образец белка содержит окончательную концентрацию оксалата 2 мМ. Нанесите 1 мМ DTT и храните на льду. В то же время, распаковать 24 хорошо кристаллизации пластины, в идеале внутри температуры контролируемой комнате при температуре контролируемых при температуре. Распределите тонкий слой парафина на ободе поверх каждой скважины 24 пластины с помощью тонкого стекла или пластикового стержня. Добавьте 800 юл подготовленных коктейлей кристаллизации (A1 к D6) в каждый соответствующий колодец пластины кристаллизации. Поместите свежие 22 мм крышки на чистую поверхность. Избегайте загрязнения крышки скользит грязью или пылью. При необходимости удалите любые обломки с крышки скольжения с помощью сжатого воздуха или спрей для тряпки. После центрифугирования завершена, избегайте встряхивания протеинового образца так, чтобы вращающиеся вниз агрегаты и мусор в нижней части трубки не плавают снова. В следующих шагах, пипетка из протеина образца чуть ниже поверхности раствора, чтобы избежать разжигания агрегатов и отложений со дна. Для каждого колодца (см. рисунок 6В)пипетка 1 злитель белкового раствора на центр крышки скольжения и добавить 1 злиц соответствующего резервуара коктейль в протеиновые капли, избегая пузырьков. Поверните coverslip вверх дном и поместите его на верхней части скважины так, что нефть уплотнения хорошо с крышкой герметично. Повторяйте до тех пор, пока 24 скважины пластины не будет завершена. Храните пластину при температуре 18 градусов по Цельсию и наблюдайте за каплями по прогрессивному графику с помощью надлежащего микроскопа. Человеческие кристаллы FAHD1 обычно появляются на ночь (см. Рисунок 6C).

Representative Results

Начиная с подготовленного вектора клонирования и приобретенного BL21 (DE3) pLysS E. coli,плазмида вставляется в бактерии через тепло-шок или любой подходящий альтернативный метод (рисунок1). После короткого периода усиления, преобразованные бактерии покрываются на пластинах агара LB, для того, чтобы расти в одночасье. Плиты на данный момент могут выглядеть по-разному, в зависимости от различных потенциальных источников ошибки. Плиты могут быть пустыми (т.е. без колоний), полностью заросшими бактериями, или что-то между ними, соответственно. Два примера пластин LB агара после оптимальной и неоптимальной трансформации изображены на рисунке 7A. Слишком много бактериальных колоний указывают либо на то, что слишком много бактерий были покрыты (вероятно), либо что антибиотики в использовании могут быть истек (вряд ли). Слишком мало бактериальных колоний может указывать на то, что либо не хватает плазмида был использован для преобразования (использовать больше в следующий раз), или что слишком много антибиотиков были использованы для выбора бактерий. В любом случае, если колонии присутствуют, они должны быть в порядке, так как использование двух селективных антибиотиков подразумевает довольно незначительный шанс непреобразованных бактерий расти. Нет колоний на всех, однако, указывает на то, что либо бактерии потеряли свою компетенцию преобразования (из-за неправильного хранения или хранения в течение более длительных периодов, повторяющиеся замораживания и оттепели и т.д.), тепло-шок не был успешным (не плазмид поглощения или бактериальных смерть слишком много тепла), вектор клонирования поврежден, или по ошибке неправильный набор селективных антибиотиков был использован (проверить ген сопротивления на плазмидный вектор). Рисунок 7 : Репрезентативные результаты для преобразования бактерий и IMAC.(A) Представитель LB агар пластины с преобразованной BL21 (DE3) E. coli, полученные следующим протоколом шаг 1.1. Слева: табличка с хорошо распределенными колониями (положительный пример). Справа: пластина только с одной колонией (отрицательный пример). Белые круги отмечают хорошие колонии. Красный круг отмечает колонии, которые растут слишком близко друг к другу и не должны быть выбраны до тех пор, как изолированные колонии доступны. b) анализ 12,5% акриламида SDS-PAGE серии индукционных мер контроля (“-” указывает на введение IPTG; “К” указывает после индукции IPTG, перед сбором гранул), скорректированной на равное количество общего белка. Это описано в шаге 1.2. (C) Образцовый 12,5% акриламида SDS-PAGE анализ Ni-NTA очистки егопомечены FAHD1 белка. Это описано в разделе 3 протокола. Сродство хроматографии дает белок высокой чистоты (Зgt;70%, черная стрелка), однако, несколько небольших загрязнений также наблюдается (красные стрелки). Эти загрязнения состоят из белков, не связанных с ФАХД, которые связываются с колонкой, и из белков, которые связываются с белком FAHD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Отобраны и отобраны проверенные колонии. После усиления в питательной среде экспрессия белка вызывается применением химического IPTG. Бактериальные гранулы, содержащие выраженный белок в миллиграммовых количествах, собирают, а экспрессия проверяется через SDS-PAGE (см., например, рисунок 7B). Некоторые проблемы могут возникнуть во время этого в противном случае простой процесс. Во-первых, некоторые белки образуют включение органов, потому что они, видимо, каким-то образом вмешиваться в естественный метаболизм бактерий-хозяев. Это наблюдалось для некоторых точек мутаций человека FAHD1 и FAHD2. В таких случаях, другие системы выражения, такие как клетки насекомых, могут быть более подходящими и должны быть рассмотрены. После сбора гранул из клеток насекомых, например, очистка белков следует тем же шагам, что описано в этом протоколе. Во-вторых, система DE3-pET иногда оказывается “неудающейся” (т.е. белок уже в некоторой степени выражен до индукции IPTG). Потенциальная причина этого не очень хорошо понята, но это может помочь выразить белок медленно на ночь в холодном инкубаторе комнаты. В-третьих, не выражается ни один белок. Это, вероятно, наихудший сценарий, так как он, вероятно, указывает на поврежденный вектором плазмида и, таким образом, целесообразно секвенировать плазмид. Если его-тег был использован для пометки белка, сродство хроматографии с Ni-NTA агарозявляется является простым и дешевым методом захвата устранения большинства загрязнений (Рисунок 7C). Аналогичные методы существуют и для других систем тегов (например, STREP-II). Если не был использован тег, сочетание осадков сульфата аммония и последовательных гидрофобных хроматографии обмена может также отделить белок от большинства других белков(Рисунок 8A). Однако, сравнивая два метода(рисунок 7C против рисунка 8A),превосходство методов Ni-NTA может быть продемонстрировано анализом SDS-PAGE. Поэтому рекомендуется использовать егопомеченный белок. Рисунок 8 : Репрезентативные результаты для экспериментов FPLC (HIC, ионный обмен, SEC).(A) Типичная хроматограмма и 12,5% акриламид SDS-PAGE анализ HIC-фенил хроматографии после сульфата аммония (AS) осадков немаркированного белка FAHD1, как описано в разделе 4 протокола. Зеленая линия отражает градиент буфера B, который не содержит AS. Во время процесса AS постепенно вымывается из системы. Сравнение этой панели на рисунке 7C отображает силу хроматографии сродства Ni-NTA по сравнению с методом HIC-фенил, а также преимущество использования системы Его-тегдля для очистки белка. (B) Образцовая хроматограмма и 12,5% акриламида SDS-PAGE анализ катионной обменной хроматографии егопомечены FAHD после очистки Ni-NTA. Используя градиент соли, прикладной образец делится на отдельные белки. (C) Образцовая хроматограмма и 12,5% акриламида SDS-PAGE анализ G75 размер исключения хроматографии егопомечены FAHD после катионной хроматографии обмена. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Последовательно, белок далее отделен от остатков загрязнений катион / анион обмена хроматографии (например, см. Рисунок 8B), а затем размер исключения хроматографии (например, см. Рисунок 8C). Рекомендуется разработает первоначальную стратегию очистки в этом порядке; однако, эти столбцы должны быть использованы в комбинации, затем и в изменении, до тех пор пока протеин достаточно чисто. Простые анализы активности, для того, чтобы проверить на “да или нет” решения по активным субстратов и / или кофакторов, могут быть выполнены с Егопомечены белков после очистки Ni-NTA, или untagged белков после ионной колонки обмена. Конкретные виды деятельности и кинетические константы должны определяться с помощью белка высочайшей чистоты. Кристаллизация может быть предпринята с белками после ионной колонки обмена, но качество кристаллов почти всегда коррелирует с чистотой белка. Поликлональные антитела могут быть подняты против белков на любом этапе протокола очистки; однако, здесь качество также коррелирует с чистотой протеина.

Discussion

Критические шаги

Белки FAHD очень чувствительны к концентрациям соли. При низких концентрациях NaCl, белки могут осаждать при оттаивании, но они обычно могут быть полностью восстановлены при более высоких концентрациях соли. То есть, если белок ФАХД по какой-либо причине осадки, он может быть восстановлен или сложен с более высокими концентрациями соли (Згт;300 мкм). Некоторые более гидрофобных белков, однако, не могут быть восстановлены (например, человека FAHD2), но моющие средства, такие как CHAPS (максимум 1%) или глицерол (10%) может быть использован для поддержания их в стабильном решении. В любом случае рекомендуется шок-замораживание с использованием жидкого азота и хранение при температуре -80 градусов по Цельсию, так как это нежный и медленный процесс оттаивания.

Некоторые неожиданные проблемы могут возникнуть во время очистки Ni-NTA в шаге 3.1.10. Следует отметить, что более высокий УРовень ОД во втором собранном образце, чем в первом образце, указывает на слишком большой объем агарозной мизины (примите к сведению и используйте меньше сена в следующем эксперименте). Кроме того, сама агарозная мелина приводит к сигналу OD на уровне 280 нм (т.е. нарушение агарозной ложи мели даст искусственные сигналы). В случае сомнений, рекомендуется использовать другие методы, такие как Анализ Брэдфорда или BSA для определения концентрации белка.

В ферментативных анализах необходимо рассмотреть три важных аспекта. Во-первых, оценка концентрации белка имеет решающее значение для получения правильной конкретной деятельности. Уровень чистоты белка влияет на результат и нуждается в оценке. В случае помеченного белка, масса тег-части должна быть вычислена, и конкретная деятельность должна быть соответственно исправлена. Для простых анализов, описанных в разделе 7 протокола, чистоты Ni-NTA достаточно, чтобы различать активные и неактивные субстраты, кофакторы и т.д. В случае более сложной кинетики Михаэлиса-Ментена все реактивирующие и субстративы должны быть правильно определены. Особенно при использовании оксалоацетата (который автоматически декарбоксилатирует с течением времени) ферментативная часть реакции должна быть исправлена для автоматического декарбоксиления (при предположении, что обе реакции происходят одновременно). Необходимо учитывать первоначальные изменения в сигнале оптической плотности, адресованном кето-энол таутомеризации субстрата. В-третьих, необходимо корректировать концентрации и объемы. Реакция с определенными концентрациями фермента и субстрата может дать различные результаты, зависящие от объема ассеа. Если на скважину слишком много фермента, то стежка жидкости может на самом деле предуклонить результат.

Для оценки кинетики Михаэлис-Ментен рекомендуется проводить первоначальные эксперименты в 100 юл, 200 юл и 300 юл партий, чтобы найти оптимальную комбинацию. Аналогичные аспекты применимы к соотношению концентраций фермента-субстрата для кинетической анализов. Слишком много фермента на субстрат или слишком много субстрата на фермент поставить систему за пределами линейного устойчивого состояния Michaelis диапазона. Для оптимизации этих условий необходимы первоначальные эксперименты. Примерная регулировка для человеческого белка FAHD1 (дикого типа) предусмотрена в разделе 8, в результате чего кинетические диаграммы (как представлено на рисунке 5B,например).

Для кристаллизации капли белкового раствора проплывают в центре крышки и смешивают с каплей кристаллизации коктейля, который обычно состоит из буфера (например, Tris-HCl, HEPES) и осадка (например, полиэтиленгликоль, аммоний сульфат). Капля ингибиторного раствора для кокристаллизации (например, оксалат в этом протоколе) может применяться по желанию. Coverslip затем помещается вверх ногами над колодцем резервуара, содержащего кристаллизующий коктейль, герметизируя хорошо воздуха плотно с помощью герметичного масла(рисунок 6B). В идеале, никаких осадков не происходит в пределах капли в начале эксперимента, что означает, что белок остается в растворе. Так как концентрация осадка в водохранилище выше, чем в падении, капля начинает терять воду путем испарения в атмосферу скважины до достижения равновесия с резервуаром. Диффузия воды в резервуар вызывает медленное уменьшение объема капли, что, в свою очередь, вызывает увеличение как белка, так и концентрации осадка в падении. Если белковый раствор достигает необходимого состояния сверхнасыщенности и, таким образом, метастабильности, может произойти спонтанное нуклеацию с последующим ростом кристалла. Достижение перенасыщенного состояния является необходимым, но не достаточным условием для кристаллизации. Кристаллизация белков нуждается как в благоприятных термодинамических, так и в кинетической кинетических условиях, и во многом зависит от непредсказуемых свойств белка, который будет кристаллизован^22.

Модификации и устранение неполадок

Выражение белка в кишечной палочке может быть неэффективным. Изменение концентраций IPTG, температура экспрессии и время усиления, такие как комнатная температура в течение нескольких часов или в холодной комнате на ночь, возможно, потребуется проверить для каждого нового белка, чтобы найти оптимальные условия. Осадки белка в инклюзивных телах иногда наблюдаются для более гидрофобных белков ФАХД. В таких случаях рекомендуется экспрессия белка в других модельных системах,таких как клетки насекомых, так как тела включения менее склонны к 26.

Поскольку белки FAHD чувствительны к концентрациям соли и кофактора, а также к рН, стратегии очистки различных гомологов, ортогогов и точечных мутаций могут отличаться в отдельных условиях. Описанные методы очистки разработаны для белка FAHD1 дикого типа. Концентрации химических веществ, таких как NaCl и имидазол, а также рН, возможно, должны быть адаптированы для отдельных белков с другой изоэлектрической точкой (pI). Также следует отметить, что не каждый белок, отмеченный еготегами, может хорошо связываться с мишенями Ni-NTA. Если связывание белка с колонкой Ni-NTA является неэффективным, адаптированные концентрации NaCl и имидазола, а также различные условия рН в буфере Ni-NTA могут помочь улучшить качество результата. В противном случае пропуск ступени Ni-NTA и переход к этапу ионной биржевой хроматографии также может привести к успешной стратегии очистки. Если белок связывается с колонкой Ni-NTA, но не может быть высажена из столбца, добавление некоторых mM EDTA может помочь нарушить комплекс Ni^2.

Что касается процесса кристаллизации, то необходимо понимать, что самоорганизация крупных и сложных белковых молекул в обычную периодическую решетку является по своей сути маловероятным процессом, который в значительной степени зависит от трудно контролировать кинетические параметры. Даже небольшие изменения в настройке, используемой для кристаллизации, могут кардинально изменить результат, и кристаллы не образуются. Чистота белка, как правило, имеет первостепенное значение. Как правило, сильно перегружены SDS-PAGE гель не должны показывать другие полосы. Кроме того, последовательность выполнения шагов может повлиять на результат. В качестве примера, чтобы обеспечить воспроизводимость, часто необходимо сохранить трубационную последовательность одинаково, затем сначала добавить белок, и, наконец, добавить осадки в рылусие кристаллизации (или наоборот). Какой бы метод не использовался, он должен быть неизменным при попытке воспроизвести или масштабировать эксперименты. Если кристаллы не наблюдаются после этого протокола, химический состав осадка, рН, размер капли и соотношение белка к осадку могут быть изменены небольшими приращениями. Терпение и последовательные наблюдения за каплями добродетели.

Замечания к каталитическим механизмам FAHD1

Представленные методы были разработаны специально для получения высококачественных белков FAHD1. Это позволило рост кристаллов FAHD1, а также инженерии кристаллов, содержащих FAHD1 комплексных ингибитор (оксалат, PDB:6FOG). Рентгеновские структуры обеспечивают 3D-архитектуру каталитического полости фермента. Эти результаты устанавливают всестороннее описание остатков, потенциально важных для каталитические механизмы этого интригующего фермента. FAHD1 был впервые описан, чтобы иметь возможность расщеплять acylpyruvates (ацетилпирувате, fumarylpyruvate)¹¹. Позже было установлено, что FAHD1 действует также как декарбоксилаза оксалоацетата¹². Хотя субстраты ацилпируват и оксалоацетат различные химические moieties, химические преобразования разделяют механически стратегическое расщепление общего одного C³-C⁴ связи, энергично облегчается, если C³-C⁴ орбиты связи остаются ортогональными к орбиталам C²-carbonyl¹⁵. Такая конформация позволяет резонансную стабилизацию C 3-carbanion преходяще формируется в процессе расщепления. Субстраты FAHD1 (оксалоацетат и ацилпируваты) являются гибкими молекулами и могут существовать втаутомерных (кето-энол), а также C 2-гидратированных формах (рисунок9A). Равновесие между различными видами определяется главным образом характером используемого буферного состава, рН и наличием ионов металла. В следующих мы обсуждаем гипотетические механические сценарии, вдохновленные анализом рентгеновских кристаллических структур, которые раскрыли каталитический центр FAHD1.

Рисунок 9 : Подробная информация о предлагаемом каталитическом механизме человека FAHD1.
(A) Оксалоацетат существует как в кристаллическом состоянии, так и в нейтральном растворе, главным образом в форме²⁴. Однако, под физиологическимр рН-условиями форма 2-кето является преобладающим представлением²⁵. (B) Химический эскиз полости hFAHD1¹⁵ с мг-связанным оксалоацетатом (слева) и ацилпируватом (справа, с R¹ в качестве органического отдыха; красная стрелка обозначает нуклеофильные атаки прилегающей стабилизированной молекулы воды) (см. обсуждение). (C) Сравнение благоприятствования конформации для C³-C⁴ расщепления в декарбоксилазе (b к c) и гидролазе (b’ to c) механизм FAHD1: оба процесса приводят к Mg-комплексной пирувате-инолат (см. обсуждение). Промежуточные b и b’, как ожидается, будут стабилизироваться к 109 евро, как набросал в панели B (см. обсуждение). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Декарбоксилаза деятельность FAHD1

Оксалоацетат существует в кристаллическом состоянии, а также в нейтральном растворе, в основном в форме 24. Но было показано, что в физиологических рН-условиях (буферные условия при рН 7,4) 2-кето форма является преобладающим представлением оксалоацетата²⁵ (рисунок 9A), и что энолизация не является необходимым условием для декарбокскилирования²⁷. Следует отметить, что ионы Mg² “не влияют на соотношение видов оксалатацетата при рН 7,4 или ниже²⁸. Транспозиция формы оксалоацетата кето в каталитический центр FAHD1 (руководствуясь связанным оксалатом всложном ферменте (PDB: 6FOG 15)) выявила остаток No109 как конформашновый регулятор связанного оксалоацета¹⁵. Как указано в другой статье¹⁵, водородных связей с карбамойл группы No 109 стабилизирует оксалатацетат-конформации в результате вращения вокруг C²-C³ связи (Рисунок9B, левая панель). В результате этого вращения, C³-C⁴ облигации (для расщепления) принимает близко к ортогонального расположения по отношению к -орбиталы C²-карбонил (Рисунок9C). Углекислый газ может быть освобожден. Основным продуктом этого процесса будет резонанс стабилизировался Mg-enolate пирувата. Из исследований комплексов оксалоацетат-Мг известно, что енолат образует самый стабильный комплекс^28,²⁹. Предполагая сопоставимую стабильность для Mg-pyruvate енолат-комплекс кофактор FAHD1 может быть заблокирован, но остатки лизина K123 может протонаpytoe-инолат в равновесии, чтобы запретить потерю кофактора¹⁵.

Данное толкование предполагает pyruvate enol в качестве отдельного промежуточного в каталитической функции ODx FAHD1. На этом этапе гипотезы модели экспериментальные данные не дают никаких дополнительных указаний относительно того, почему закрытая крышка должна открыться для выпуска продукта. Можно сделать вывод, однако, что предлагаемый механизм выглядит как ингибирование фермента продуктом: кристаллическая структура показывает, что сохраненная молекула воды, удерживаемая в направленной ориентации к каталитическому центру FAHD1, остатками H30 и E33, представленными в короткая спирали¹⁵, которая индуцируется при связывании лиганда и закрытии крышки. Если первичный энол останется в равновесии с энолатом, то резонанс, стабилизированный, может быть угасать до пирувата молекулой воды. Полученный гидроксил сможет вытеснить пируват из Mg-кофактора, на котором откроется крышка. Наконец, каталитический центр будет восстановлен в митохондриальной среде. В этом гипотетическом сценарии молекула полости воды будет работать как кислота, соответственно.

Гидролаза активность FAHD1

Гидролаза активность фермента неявно требует промежуточного образования гидроксилового нуклеофила. Этот механизм обычно встречается в сочетании с кислотно-базовой каталитической активностью. Переходное состояние реакции должно быть подготовлено с помощью конформационного контроля критическими аминокислотными боковыми цепями в полости. По аналогии с обсуждением функции декарбоксилазы, фермент-связанный ацилпируват в 2-кето-форме будет поставлен под конформационный контроль путем водородного склеивания 4-углеродного кислорода до 109 евро(рисунок 9B, правая панель). Кристаллическая структура oxalate-связанных FAHD1 (PDB:6FOG) показывает, сохраненные молекулы воды провел в направленной ориентации к FAHD1 каталитический центр остатков H30 и E33 представлены в короткой суглики¹⁵. Dad E33-H30 компетентен депротоназировать направленное расположение воды и в результате гидроксила находится в идеальном расположении, чтобы атаковать 4-карбонил acylpyruvate представлены под конформационным контролем по 109¹⁵.

Следует отметить, что аналогичный механизм был предложен для FAH¹⁸. Атака гидроксила нуклеофил, как ожидается, приведет к оксианион видов, что стабилизируется на орбитальном контролируемых C³-C⁴ расщепления облигаций (рисунок9C). В этой модели, C³-C⁴ вращение облигаций (Рисунок9C) происходит после нуклеофильной атаки сформированного гидроксила, указанного на рисунке 9B (т.е. он готовит acylpyruvate для расщепления облигаций). Основными продуктами будут уксусная кислота и инообразить Mg-pyruvate. В этом гипотетическом сценарии, уксусная кислота может утолить энол пирувате и впоследствии помочь смещению продукта. Над рН 7,5 и в присутствии ионов Mg, acylpyruvates существуют в равновесии между кето- и энол-формы, последний в небольшом предпочтении³⁰. Скорее всего, обе формы способны привязываться к кофактору FAHD1 при последующем закрытии крышки. Обработка энола ацилпирувате субстратов ферментом затруднена из-за плоской структуры энол-формы. Расщепление C³-C⁴ приведет к виниловому карбаниону без резонансной стабилизации.

Поэтому мы предлагаем шаг каталитического кетонизации для подготовки к атаке гидроксилового нуклеофила на ацил карбонил. Этот процесс кетонизации, однако, потребует контроля над протонных транспозиций остатков FAHD1, что будет приписывать присущие изомеразы деятельности FAHD1. Сообщается, что кислотность водорода, связанного с Мг-связанным энол, показывает десятитысячное увеличение по сравнению с несложной формой^28. Депротонация Мг связана энол-форма будет возможно оон-протонной K123. Депротонации K123 может помочь карбоксилат D102. Сеть водородных связей, сформированная остатками D102-K47-K123, могла бы работать в качестве необходимого протонного ретранслятора в каталитическом центре FAHD1^15. Такой сформированный промежуточный инолат может быть угасана триадой E33-H30-H₂0 под кетонезацию субстрата¹⁵. 2-кето форма будет подпадать под конформационный контроль в 109 фунтов, и сопутствуюая сформированный гидроксил будет атаковать ацил карбонил. Обобщенные обсуждения подразумевает контроль FAHD1 о молекуле воды для переключения между кислотой и базой через взаимодействие остатков кариеса.

Будущие приложения или направления метода

Будущие применения описанных здесь методов многочисленны. Множество прокариотических членов суперсемьи FAH все еще ожидает функциональной характеристики. Даже имеющаяся информация о каталитических действиях известных членов СУПЕРсемейства ФАГ является скудной и, в большинстве случаев, основана на теоретических предположениях, а не экспериментальных данных. Применение описанных здесь методов для прокариотических членов суперсемейства FAH зависит от конкретных исследовательских интересов в бактериологии. С другой стороны, недавняя демонстрация того, что эукариотические члены суперсемейства FAH играют важную роль в различных сотовых отсеках (например, цитозол против митохондрий) подчеркивает необходимость лучше охарактеризовать эти белки (три из которых были определены до сих пор), в частности, потому, что текущие данные свидетельствуют о том, что некоторые нехарактерные белки могут выполнять различные функции в контексте митохондриальной биологии, старения исследований и исследований рака. Предлагается, что полная молекулярная и физиологическая характеристика этих эукариотических членов FAH суперсемейства может обеспечить важное представление о основных областях современных исследований в биомедицинском секторе. Необходимы дополнительные исследования механизмов FAHD1 (и связанных с ним ферментов), чтобы лучше понять механизмы, лежащие в основе бифункциональности FAHD1, которая до сих пор полностью не прояснена. Дополнительные исследования с мутантами FAHD1, Исследования ЯМР и структурные исследования ингибиторных комплексов могут помочь решить истинные механистические сценарии, для которых FAHD1 кажется компетентным. Кроме того, компьютерная конструкция имитирования энола, способная связываться с Мг-кофактором, в конечном итоге приведет к подоплекам мощных ингибиторов FAHD1.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы очень благодарны за экспертную техническую помощь Аннабеллы Питтл и разработку пилотного метода Хаймо Пирчера.

Materials

BL21(DE3) pLysS competent E. coli	Promega	L1195	High-efficiency protein expression from gene with T7 promoter and ribosome binding site
pET E. coli T7 Expression Vectors	MERCK	–	http://www.merckmillipore.com/AT/de/life-science-research/genomic-analysis/dna-preparation-cloning/pet-expression-vectors/qFSb.qB.mLQAAAFA6.VkiQ0G,nav
0.45 µm filter units	MERCK	SLHP033NS	Millex-HP, 0.45 µm, PES 33 mm, not steril
0.22 µm filter units	MERCK	SLGP033RS	Millex-HP, 0.22 µm, PES 33 mm, not steril
Eppendof tubes 1.5 mL	VWR	525-1042	microcentrifugal tubes; autoclaved
15 mL Falcon	VWR	734-0451	centrifugal tubes
50 mL Falcon	VWR	734-0448	centrifugal tubes
PS Cuvettes Spectrophotometer Semi-Micro	VWR	30622-758	VIS transparent cuvettes
UV Cuvettes Spectrophotometer Semi-Micro	VWR	47727-024	UV/VIS transparent cuvettes
isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG)	ROTH	2316	chemical used for induction of protein expression with the DE3/pET system
imidazole	ROTH	X998	chemical used for elution of polyhistidine (6xHis) sequences from a nickel-charged affinity resin
Glass Econo-Column Columns	Bio-Rad	–	http://www.bio-rad.com/de-at/product/glass-econo-column-columns?ID=2cfb1c6e-32e8-4c72-b532-dd39013d707d&pcp_loc=catprod
chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C0378	antibiotic for bacterial growth selection; resistance endióded in pLysS plasmid of BL21(DE3) E. coli; 25 µg/mL final concentration
kanamycin	Sigma-Aldrich	60615	antibiotic for bacterial growth selection; to be used if this resistance is encoded in the employed pET vector; 50 µg/mL final concentration
ampicillin	Sigma-Aldrich	A1593	antibiotic for bacterial growth selection; to be used if this resistance is encoded in the employed pET vector; 100 µg/mL final concentration
Ultra-15, MWCO 10 kDa	Sigma-Aldrich	Z706345	centrifigal filters for protein enrichment; https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/z706345?lang=de®ion=AT
Ultra-0.5 Centrifugal Filter Units	Sigma-Aldrich	Z677108	centrifigal filters for protein enrichment; https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/ALDRICH/Z677108?lang=de&region=AT&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold5-2
oxaloacetic acid	Sigma-Aldrich	O4126	TCA metabolite
sodium oxlalate	Sigma-Aldrich	71800	a competitive inhibitor of FAH superfamily enzymes
Dialysis tubing cellulose membrane	Sigma-Aldrich	D9277	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d9277; or comparable
Ni-NTA agarose	Thermo-Fischer	R90101	a nickel-charged affinity resin that can be used to purify recombinant proteins containing a polyhistidine (6xHis) sequence
96-Well UV Microplate	Thermo-Fischer	8404	UV/VIS transparent flat-bottom 96 well plates
PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa	Thermo-Fischer	26616	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26616?SID=srch-hj-26616
ÄKTA FPLC system	GE Healthcare Life Sciences	–	using the FPLC system by GE Healthcare; different custom versions exist; this work used the "ÄKTA pure" system
HiTrap Phenyl HP column	GE Healthcare Life Sciences	–	https://www.gelifesciences.com/en/it/shop/chromatography/prepacked-columns/hydrophobic-interaction/hitrap-phenyl-hp-p-05630
Mono S 10/100 GL	GE Healthcare Life Sciences	–	https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/ion-exchange/mono-s-cation-exchange-chromatography-column-p-00723
Mono Q 10/100 GL	GE Healthcare Life Sciences	–	https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/ion-exchange/mono-q-anion-exchange-chromatography-column-p-00608
HiLoad Superdex column 75 pg (G75)	GE Healthcare Life Sciences	–	https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/size-exclusion/hiload-superdex-75-pg-preparative-size-exclusion-chromatography-columns-p-05800
HiLoad Superdex column 200 pg (G200)	GE Healthcare Life Sciences	–	https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/size-exclusion/hiload-superdex-200-pg-preparative-size-exclusion-chromatography-columns-p-06283
TECAN microplate reader	TECAN Life Sciences	–	https://lifesciences.tecan.com/microplate-readers
acetylpyruvate	MoleculeCrafting.HuGs e.U.	–	custom synthesis
benzoylpyruvate	MoleculeCrafting.HuGs e.U.	–	custom synthesis
VDX™ plate (24 wells)	Hampton	HR3-142	24 well plates used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion
paraffin oil	Hampton	HR3-411	used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion
coverslips (22 mm)	Karl Hecht KG	14043	coverslips used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion
Luria broth (LB) medium	self-prepared	–	a general growth medium for E. coli: 5 g/L yeast extract; 10 g/L peptone from casein; 10 g/L sodium chloride; 12 g/L agar-agar
NZCYM medium	self-prepared	–	a better growth medium for E. coli, used for amplification: 10 g/L NZ amine; 5 g/L NaCl; 5 g/L yeast extract; 1 g/L casamino acids; 2 g/L MgSO4; adjust pH to 7.4
Luria broth (LB) agarose plates	self-prepared	–	autoclaved agarose plates containing LB-medium and antibiotics for bacterial groth selection; https://www.addgene.org/protocols/pouring-lb-agar-plates/
Ni-NTA running buffer	self-prepared	–	20 mM Tris-HCl pH 7,4; 50-300 mM NaCl; 10-200 mM imidazole; ranges: optimal value varies among FAHD proteins
Ni-NTA elution buffer	self-prepared	–	20 mM Tris-HCl pH 7,4; 50-300 mM NaCl; 200-500 mM imidazole; ranges: optimal value varies among FAHD proteins
HIC running buffer	self-prepared	–	44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 100 mM NaCl; 20 mM DTT; adjust to pH 7
HIC running buffer AS	self-prepared	–	HIC running buffer saturated with ammonium sulfate (AS); adjust to pH 7: 70 g ammonium sulfate + 90 mL buffer, stirred overnight in the cold room; adjust to pH 7.0
Mono S low salt buffer	self-prepared	–	44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 10-300 mM NaCl; ranges: optimal value varies among FAHD proteins
Mono S high salt buffer	self-prepared	–	44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 1-2 M NaCl; ranges: optimal value varies among FAHD proteins
Mono Q low salt buffer	self-prepared	–	20 mM Tris-HCl; 15 mM NaCl; adjust to pH 8.0
Mono Q high salt buffer	self-prepared	–	20 mM Tris-HCl; 1 M NaCl; 10 % glycerol; adjust to pH 8.0
G75 / G200 running buffer	self-prepared	–	15 mM Tris-HCl; 300 mM NaCl; adjust to pH 7.4
enzyme assay buffer	self-prepared	–	50 mM Tris-HCl pH7.4; 100 mM KCl; 1 mM MgCl₂
protein crystallization buffer	self-prepared	–	G75 / G200 running buffer with 1 mM DTT
reservoir solution for crystallization	self-prepared	–	100 mM Na-HEPES pH 7.5; 5-20 % (w/v) PEG4k; 10 mM-200 mM MgCl₂

References

Brouns, S. J. J., et al. Structural Insight into Substrate Binding and Catalysis of a Novel 2-Keto-3-deoxy-d-arabinonate Dehydratase Illustrates Common Mechanistic Features of the FAH Superfamily. Journal of Molecular Biology. 379, 357-371 (2008).
Timm, D. E., Mueller, H. A., Bhanumoorthy, P., Harp, J. M., Bunick, G. J. Crystal structure and mechanism of a carbon-carbon bond hydrolase. Structure (London, England: 1993). 7, 1023-1033 (1999).
Weiss, A. K. H., Loeffler, J. R., Liedl, K. R., Gstach, H., Jansen-Dürr, P. The fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) superfamily of enzymes: multifunctional enzymes from microbes to mitochondria. Biochemical Society Transactions. 46, 295 (2018).
Guimarães, S. L., et al. Crystal Structures of Apo and Liganded 4-Oxalocrotonate Decarboxylase Uncover a Structural Basis for the Metal-Assisted Decarboxylation of a Vinylogous β-Keto Acid. Biochemistry. 55, 2632 (2016).
Zhou, N. Y., Fuenmayor, S. L., Williams, P. A. nag genes of Ralstonia (formerly Pseudomonas) sp. strain U2 encoding enzymes for gentisate catabolism. Journal of Bacteriology. 183, 700 (2001).
Izumi, A., et al. Structure and Mechanism of HpcG, a Hydratase in the Homoprotocatechuate Degradation Pathway of Escherichia coli. Journal of Molecular Biology. 370, 899-911 (2007).
Manjasetty, B. A., et al. X-ray structure of fumarylacetoacetate hydrolase family member Homo sapiens FLJ36880. Biological Chemistry. 385, 935-942 (2004).
Tame, J. R. H., Namba, K., Dodson, E. J., Roper, D. I. The crystal structure of HpcE, a bifunctional decarboxylase/isomerase with a multifunctional fold. Biochemistry. 41, 2982-2989 (2002).
Ran, T., et al. Crystal structures of Cg1458 reveal a catalytic lid domain and a common catalytic mechanism for the FAH family. The Biochemical Journal. 449, 51-60 (2013).
Ran, T., Wang, Y., Xu, D., Wang, W. Expression, purification, crystallization and preliminary crystallographic analysis of Cg1458: A novel oxaloacetate decarboxylase from Corynebacterium glutamicum. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 67, 968-970 (2011).
Pircher, H., et al. Identification of human Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing Protein 1 (FAHD1) as a novel mitochondrial acylpyruvase. Journal of Biological Chemistry. 286, 36500-36508 (2011).
Pircher, H., et al. Identification of FAH domain-containing protein 1 (FAHD1) as oxaloacetate decarboxylase. Journal of Biological Chemistry. 290, 6755-6762 (2015).
Petit, M., Koziel, R., Etemad, S., Pircher, H., Jansen-Dürr, P. Depletion of oxaloacetate decarboxylase FAHD1 inhibits mitochondrial electron transport and induces cellular senescence in human endothelial cells. Experimental Gerontology. 92, 7-12 (2017).
Etemad, S., et al. Oxaloacetate decarboxylase FAHD1 – a new regulator of mitochondrial function and senescence. Mechanisms of Ageing and Development. 177, 22-29 (2019).
Weiss, A. K. H., et al. Structural basis for the bi-functionality of human oxaloacetate decarboxylase FAHD1. Biochemical Journal. 475, 3561-3576 (2018).
Taferner, A., et al. FAH domain-containing protein 1 (FAHD-1) Is required for mitochondrial function and locomotion activity in C. elegans. PLoS ONE. 10, 1-15 (2015).
Mizutani, H., Kunishima, N. Purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of the fumarylacetoacetase family member TTHA0809 from Thermus thermophilus HB8. Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization Communications. 63, 792-794 (2007).
Bateman, R. L., Bhanumoorthy, P., Witte, J. F., McClard, R. W., Grompe, M., Timm, D. E., et al. Mechanistic Inferences from the Crystal Structure of Fumarylacetoacetate Hydrolase with a Bound Phosphorus-based Inhibitor. Journal of Biological Chemistry. 276, 15284-15291 (2001).
Zeng, F., et al. Efficient strategy for introducing large and multiple changes in plasmid DNA. Scientific Reports. 8, 1714 (2018).
Higuchi, R., Krummel, B., Saiki, R. K. A general method of in vitro preparation and specific mutagenesis of DNA fragments: study of protein and DNA interactions. Nucleic Acids Research. 16, 7351-7367 (1988).
Jansen-Duerr, P., Pircher, H., Weiss, A. K. H. The FAH Fold Meets the Krebs Cycle. Molecular Enzymology and Drug Targets. 2, 1-5 (2016).
Rupp, B. Origin and use of crystallization phase diagrams. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71, 247-260 (2015).
Rupp, B. . Biomolecular Crystallography: Principles, Practice, and Application to Structural Biology. , (2010).
Flint, D. H., Nudelman, A., Calabrese, J. C., Gottlieb, H. E. Enol oxalacetic acid exists in the Z form in the crystalline state and in solution. The Journal of Organic Chemistry. 57, 7270-7274 (1992).
Pogson, C. I. I., Wolfe, R. G. G. Oxaloacetic acid tautomeric and hydrated forms in solution. Biochemical and Biophysical Research Communications. 46, 1048-1054 (1972).
Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L., Kost, A. T. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nature Biotechnology. 23, 567-575 (2005).
Steinberger, R., Westheimer, F. H. Metal Ion-catalyzed Decarboxylation: A Model for an Enzyme System 1. Journal of the American Chemical Society. 73, 429-435 (1951).
Tate, S. S., Grzybowski, A. K., Datta, S. P. The stability constants of the magnesium complexes of the keto and enol isomers of oxaloacetic acid at 25. Journal of Chemical Society. , 1381-1389 (1964).
Tate, S. S., Grzybowski, A. K., Datta, S. P. The acid dissociations of the keto and enol isomers of oxaloacetic acid at 25. Journal of Chemical Society. 1372, 1380 (1964).
Brecker, L., et al. Synthesis of 2,4-diketoacids and their aqueous solution structures. New Journal of Chemistry. 23, 437-446 (1999).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Weiss, A. K. H., Holzknecht, M., Cappuccio, E., Dorigatti, I., Kreidl, K., Naschberger, A., Rupp, B., Gstach, H., Jansen-Dürr, P. Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins. J. Vis. Exp. (148), e59729, doi:10.3791/59729 (2019).

Automatically Generated