フマリアルセトーアセテートヒドロラーゼドメイン含有タンパク質の発現、精製、結晶化、酵素アッセイ

1. 有能な大腸菌におけるFAHDタンパク質の発現 FAHDタンパク質発現のためのベクターによる大腸菌の変質注: 次のセクションで説明する手順は、図 1A、Bのスケッチに要約されています。ポイント変異型変異体を含む任意の FAHD タンパク質にも同じプロトコルが適用されます。このような変異体は、野生型cDNAから部位指向変異体およびPCR技術19(両面SOE PCR20など)を介して得られ得る。図 1: 有能な大腸菌の増幅とタンパク質発現の誘導(A)pETベクターを有能なBL21(DE3)pLysS大腸菌に挿入し、セクション1に記載する。(B)pET形質転換大腸菌のヒートショックプロトコルとめっきは、プロトコルのステップ1に記載されている。 形質転換された細菌は、選択のための抗生物質とLB寒天プレートにめっきされています。(C)pET形質転換大腸菌の増幅は、セクション1に記載されている。コロニーはLB寒天プレートから採取され、細菌密度が0.4の経験閾値に達するまで栄養培地(LBまたはNZCYM)で増幅される。 (D)DE3-IPTG-pETシステムを介したタンパク質発現の誘導は、セクション1に記載され、図2にスケッチした。タンパク質産生は、化学IPTGの応用によって開始される。セクション1の終わりに、タンパク質を含む細菌ペレットが収穫される。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 有能なBL21(DE3)pLysS大腸菌およびpET発現ベクターを得る(材料の表を参照)。好ましくは、以下の精製工程を簡素化するために、便宜上、N-端末Hisタグまたは関連キャプチャタグもエンコードするpETベクトルを選択する。 選択したFAHDタンパク質のcDNAを取得し、PET発現ベクターの活性クローニング部位に挿入し、それぞれT7プロモーターとT7ターミネータ部位の間に挿入する。 プラスミド増幅と検証に成功した後[T7プライマーは、便宜上pETシステムで使用することができます:T7プロモーター、フォワードプライマー:TAATACGACTCACTATAGGG;T7ターミネータ、リバースプライマー:GCTAGTTATTGCTCAGCGG)]]、5-10 ngのプラスミドを100μLの有能なBL21(DE3)pLysS大腸菌を氷上に挿入する。上下に吸引しないでくださいが、内容を混ぜるためにチューブを少しタップします。 細菌を氷の上に30分間置き、チューブを数分ごとに軽くたたきます。 加熱装置または水浴を42°C(正確)に加熱します。細菌を含むチューブを装置に入れ、90s(正確)に保管してください。すぐに氷の上に置きます(図1A)。 氷上で5~10分後、600μLのNCZYM培地(材料表参照)を加え、チューブを細菌インキュベーターに入れます。1時間37°Cで振る方向に向かって中速でチューブを振ります。 10cm LB-寒天板上の細菌培養物のプレート200μL(材料の表を参照)、選択した抗生物質を含む[例えば、BL21(DE3)pLysS耐性(クロラムフェニコール)に特異的なもの、および耐性のための1つpETベクター(カナマイシンまたはアンピシリン、図1B)にエンコードされる。 一晩37°Cで細菌インキュベーターでLB-寒天プレート上の細菌を培養する。 IPTG誘導によるFAHDタンパク質の発現注: 次のセクションで説明する最初の手順は、図 1C、Dのスケッチとして要約されています。細菌DE3カセットとpETベクターシステムの組み合わせを介したT7発現システムを図2にまとめた。図 2:DE3カセット/pETベクトルデュアルシステムについて説明しました。(A)pETベクターのスケッチゲノムはBL21(DE3)pLysS大腸菌を形質転換した。天然の細菌ゲノムは、DE3カセット(パネルBを参照)と、常にラックリプレッサーユニットを発現するlac遺伝子を運びます。非ネイティブpETベクターは、T7ポリメラーゼプロモーターとターミネータ配列の間に挿入されたタンパク質遺伝子を運ぶ。パネルBの詳細(B)天然細菌ゲノムのDE3カセットは、大腸菌RNAポリメラーゼオペロンの観点からT7ポリメラーゼの情報をコードする。 しかし、このタンパク質は、LACリプレッサユニットがRNAポリメラーゼタンパク質の結合を妨げるため、発現されません。したがって、T7ポリメラーゼは発現され、外因性タンパク質は発現しない。(C)化学IPTG(材料表)の適用は、ラックリプレッサーユニットの構造を歪め、DE3カセットに結合するのを防ぎます。その結果、RNAポリメラーゼはカセットに結合することができ、T7ポリメラーゼが発現し、最終的には外因性タンパク質と同様に発現する。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 コロニー形成に成功した後、単一のコロニー(衛星コロニーなし)を1つ選び、NZCYMまたはLB培地の5mLに抗生物質で分散させ、前のように選択します(ステップ1.1.7)。一晩37°Cで細菌インキュベーターで培養する(図1C)。 細菌の増殖に成功した後、タンパク質量の需要に応じて、250 mL、500 mL、または1Lバッチの培地で細菌を増幅する。 体積に適して、ステップ1.1.7で行われた抗生物質を適用し、密な細菌前培養の約1%〜2%を加える(すなわち、2.5〜5.0mL〜250mLの培地等)。ステップ1.2.5(1 mL以上)で使用するサンプルを採取し、600 nmで光学密度(OD)を確認します。細菌インキュベーター中の細菌を2〜3h(図1C)で37°Cで培養する。 2~3時間後、フォトメトリック分析用のサンプルを描画します。600 nmのODが0.4に達した場合は、200 μMを1mM isopropyl-β-D-チオガラクピラノシド(IPTG、材料の表を参照)に適用します。注: 実際の値は、各 FAHD タンパク質またはポイント変異変異バリアントに対して経験的であり、1 mM IPTG が適用されるべき最大値です。これはタンパク質発現を誘導する(図1D、図2C)。 37°Cで細菌インキュベーターでさらに3〜5時間後、タンパク質発現が枯渇する。注: 温度制御に関するコメントについては、ディスカッション セクションを参照してください。誘導後の5時間以上の揺れはお勧めしません。ステップ 1.2.5 (1 mL 以上) で使用するサンプルを採取し、600 nm の光学密度 (OD) を確認します。 5分間5,000 x gで遠心分離を介して細菌ペレットを収穫し、上清を捨て、より長い貯蔵のために-80 °Cでペレットを凍結し、短い貯蔵のために-20 °C(図1D)。 “-I” (誘導前) と “+I” (誘導後) というラベルが付いた 2 つの取得済みフォトメトリック サンプルを使用して誘導を確認します。細菌ペレットの遠心分離と再懸濁後、同じ量の全タンパク質をロードしてSDS-PAGEで2つのサンプルを分析します。注: “+I” サンプルは選択したタンパク質の分子量に関連付けられた強いバンドを表示する必要がありますが、”-I” サンプルにはこのバンドを含めるべきではありません。低誘導レベルはタンパク質の産生に共通の問題ですが、発現タンパク質のレベルは、多くの場合、次のステップで十分です。高い誘導レベルは利点ですが、必須ではありません。 2. 細菌ペレットのリシスと破片の濾過 選択したタンパク質がHisタグまたはタグなしのいずれであるかに応じて、Ni-NTA 実行バッファー (彼のタグ付け、材料の表を参照) または氷冷 HIC ランニング バッファー (タグなし) を選択します。 元の細菌懸濁液の各250 mLについて、選択したバッファーの5mLを細菌ペレットに適用します(250mLの場合は5mL、500mLの場合は10mLなど)。適用されたバッファーの5 mLあたり10 μL β-メルカプトエタノール(β-ME)を加える。10 mLのパスツールピペを使用して、ペレットを傷つけてピペッティング(ピペッティング中の気泡形成を避ける)によってペレットをサスペンションに機械的に強制します。最終的に1つの50 mLチューブにサスペンションのすべてを転送します。 好ましくは超音波(中力で15s用6x)懸濁液を。 4°Cで高速(10,000 x g)で30分間遠心分離機。氷上のフィルター単位(例えば、0.45 μm、0.22 μm)で連続して上清を濾過します。注:前の遠心分離ステップに応じて、小さなフィルター細孔サイズを通して直接濾過は退屈であり、通常は大きな細孔サイズを介して事前濾過を必要とします。より良い結果を与えるため、DNAse を追加できます。 サンプルを氷の上に保存し、タンパク質がHisタグであるかタグなしかに応じて、セクション3または4のいずれかに直ちに進みます。 3. Ni-NTA親和性クロマトグラフィーを用いた彼のタグ付きFAHDタンパク質の精製 注:Ni2+イオンは、ニトリロトリアセチン酸(NTA)を介して、親和性クロマトグラフィーに使用されるアガロース樹脂(固定化金属イオンクロマトグラフィー、IMAC、図3A)に結合する。ポリヒスチジンアミノ酸タグは、このNi-キレートに強く結合し、彼のタグ付きタンパク質は、残りのタンパク質の大部分から分離することができます。Ni-NTAカラムの記載された調製に代わるものは、あらかじめパックされたNi-NTAカラムとFPLCシステムを使用することです。 図 3:クロマトグラフィーの一般的なタイプのスケッチイラスト。(A) Ni-NTAカラムの樹脂。NTAは、固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー(IMAC)の観点から使用される二価ニッケルイオンを保持しています。ポリヒスチジンタグは、好ましくは、このモチーフに結合し、イミダゾールによってelutedされてもよい。(B)フェニル系疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC-フェニル)におけるシリカ粒子の典型的なコーティング。疎水性タンパク質はコーティング材料と相互作用し、他のタンパク質は、他のものではない間、その移行に遅れています。(C)イオン相互作用クロマトグラフィーにおけるシリカ粒子の典型的なコーティング。偏光タンパク質と荷電タンパク質はコーティング材料と相互作用し、他のタンパク質は移行が遅れますが、他のタンパク質はそうではありません。(D)サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)におけるシリカゲルの樹脂。シリカ材料中の定義された細孔に基づいて、タンパク質は、その大きさ(その分子量に対応する最初の近似で)によって分離されてもよい。小さなタンパク質は多孔質カラム材料に浸透し、遅れ、大きなタンパク質は多孔質粒子の周りをより速く移動します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 ステップ2.5から進みます(すなわち、タンパク質はNi-NTA実行バッファー内にあり、氷上の0.22 μmフィルター単位で濾過されます)。 空のプラスチックまたはガラスの柱を洗浄し、安定したリテーナに取り付けることによって、空のプラスチックまたはガラスの柱を準備します。タンパク質懸濁液の体積に応じてカラムのサイズを選択します。 タンパク質懸濁液の10 mLごとに、Ni-NTAアガローズスラリーの500 μLをカラムに塗布します(使用前に大きく振ります)。ピペットを使用して、スラリーをゆっくりとドロップして列の下部フィルタに適用します。列を決済し、数秒かかります。 Ni-NTAの実行中のバッファでカラムを完全に埋め、アガロース樹脂を破壊しないようにします。バッファーを重力で駆け抜けましょう。このプロセスは、(蓋や手袋と親指の圧力を使用して)液体に親指圧を加えることによって加速されるかもしれませんが、アガロース樹脂を歪ませないように注意してください。 タンパク質懸濁液を塗布します。前と同様に、サンプルを重力で駆け抜けましょう。流量が低い場合、カラムへのタンパク質の結合が強化されるため、親指圧を使用してこのステップを加速することはお勧めしません。チューブ(材料のテーブル)でフロースルーを収集します。 サンプルが通過した後、Ni-NTA 実行バッファで列全体をもう一度塗りつぶします。アガロース樹脂を破壊しないように注意してください。サンプルを重力で駆け抜けましょうが、前のステップとは対照的に、非特異的な相互作用のために潜在的な汚染がこの方法で中断される可能性があるため、親指圧によるプロセスの加速が推奨されます。洗浄液をチューブに入れます。この手順を繰り返します。 カラムの下にUV透明キュベットを配置し、Ni-NTA溶出バッファーの1 mLを適用します。樹脂に親指の圧力をかけずにサンプルを採取してください。 280 nmとブランクサンプル(すなわち、Ni-NTA溶出バッファー)でサンプルの光学密度(OD)を確認してください。最適に、サンプルには 2.5 より大きい OD が表示されます。0.5未満のODは、サンプル中に有意な量のタンパク質がないことを示します。注:議論セクションで概説したように、溶出バッファーの塩およびイミダゾール濃度は、各FAHDタンパク質に個別に適合する必要があります。 OD が 0.5 を下回るまで、手順 3.1.7 と 3.1.8 を繰り返します。氷の上のチューブに高いODを持つすべてのサンプルをプールします。 ステップ 3.1.4 からもう一度開始し、ステップ 3.1.5 からのフロースルーをステップ 3.1.5 のこの繰り返しの新しい入力として使用します。ステップ 3.1.6 で収集した最初のサンプルに OD が 0.5 未満表示されるまで、この手順を繰り返します。注:ディスカッションセクションのトラブルシューティングの部分で説明されているように、Hisタグ付きタンパク質はNi2+-樹脂に不十分に結合する可能性があります。このような場合には、この工程または代替方法(例えば、イオン交換クロマトグラフィー)の繰り返しが必要である。 SDS-PAGE 分析のすべての中間分数のサンプルを取ります。 Ni-NTA溶出バッファー内のFAHDタンパク質は、凍結および解凍時に沈殿します。したがって、異なるバッファーに対してタンパク質を透析する(氷上で一晩、透析バッファーの100mL当たり1μLのDTTを用いる)。この手順の後に実行するイオン交換クロマトグラフィーの種類に基づいて、低塩バッファーを使用します。14 kDa (材料の表) の典型的な分子量カットオフで一般的なセルロースチューブを使用してください。 一晩透析の後、必要に応じて超遠心フィルターユニットを使用してタンパク質を濃縮します。SDS-PAGE分析(12.5%ランニングゲル、4%スタッキングゲル)を実行して、タンパク質の潜在的な損失、不十分な溶出、およびタンパク質純度全般をチェックします。すべてが問題ない場合は、セクション 5 に進みます。 4. 疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)によるタグなしFAHDタンパク質の精製 注:FPLC用HICカラム中のシリカゲルのコーティング表面上のフェニル基(図3B)は、疎水性特性に応じてタンパク質の分離を可能にする。記載されたステップは、HIC-フェニルカラムの5 mLを備えたFPLCシステムで行う必要があります。カラムは、異なるタンパク質に再利用するために1M NaOHで洗浄してもよい。しかし、一度FAHDタンパク質の1種類に使用されたカラムは、このタイプのタンパク質にのみ再利用する必要があります。 硫酸アンモニウム(AS)沈殿 手順 2.5 から進みます。タンパク質は、氷冷HICランニングバッファー(材料の表)にあります。 マイクロリットル(V初期)に対して調製されたタンパク質溶液の体積を正確に評価する。35 ボリューム%AS 飽和度に達するまで、冷却済みの HIC 実行バッファー AS ソリューションをゆっくりとドロップワイズで追加します: VASが追加 = V初期* 0.538。4°Cで高速(≥10,000 x g)で15分間30分間静急に溶液を静かにかき混ぜます。 氷上の0.22 μmフィルターユニットを使用して上清を濾過します。必要に応じて、SDS-PAGE分析用のサンプルを採取します:希釈1:4と95°Cで直ちに5分間加熱するか、またはサンプルが塊になります。試料は、別の日に進むために、この時点(-20°C)で凍結してもよい。 HIC カラムを使用した FPLC FPLCシステムをセットアップし、5mL HIC-フェニルカラムを20%EtOH(H2 O)の5カラムボリューム(CV)で平衡化し、続いてH2Oの5 CVを使用します。 HIC 実行バッファーの 260 mL を 140 mL の HIC 実行バッファー AS (正確) と混合します。これにより、35 ボリューム%AS ソリューションが発生します。pH (7.0) を確認します。これはバッファー A. バッファ B は実行中のバッファーの 250 mL です。バッファー A と B の両方に 1 mM DTT を追加し、氷の上に置きます。 このシーケンスでは、8 mL のバッファー A、8 mL のバッファー B、および 8 mL のバッファー A でカラムを平衡化します。プロトコル・ステップ4.1で調製したサンプルを適用します。280 nmでベースライン光吸収が1000〜500 mAUに達するまで、バッファーAで洗浄する。 ASの濃度が33%(w/v)になるように、バッファーAとBの混合物を適用します。1 CVで洗浄し、クロマトグラムに高原をもたらす。バッファ B のグラデーションを設定します (時間の経過と共にバッファー B が最大 100%) : バッファー B の 1.5 mL を 3.8 分 (つまり、1% B/mL 傾斜を持つ 5.7% バッファー B)280 nmの紫外線信号が上昇したら、分数の収集を開始し、すぐに氷の上に置きます。 最後に、バッファBでカラムを洗います。SDS-PAGE 分析のすべての分数のサンプルを取ります。液体窒素を使用してすべてのサンプルを凍結し、-80 °C.でそれらを保存します。 SDS-PAGE(およびウェスタンブロット)解析を実行して、収集された画分内のFAHDタンパク質を検出します。タンパク質を含む分数はプールされ、次のプロトコルステップで概説されているように、さらなる精製に適用されます。H2O および 20% EtOH (H2O) でカラムを洗います。 5. イオン交換クロマトグラフィーによるFAHDタンパク質の精製 注:荷電された官能基を有する分子は、FPLC(図3C)のシリカ粒子カラムに結合している。これにより、表面電荷などのイオン性の特性に応じてタンパク質を分化することができます。記載されたステップは、FPLCマシンと関連するノウハウをそれぞれ使用して実行する必要があります。記載された方法は、カチオンまたはアニオン交換クロマトグラフィーのいずれについても同じですが、使用するバッファはわずかに異なります。 カチオンまたはアニオン交換クロマトグラフィーシステムを選択した。この選択は経験的であり、FAHDタンパク質によって異なる場合があります。最適には、両方の方法を連続して使用できます。 FPLCシステムをセットアップし、20%EtOHの5 CV(H2 O)でカラムを洗浄し、続いてH2 Oの5 CVを低塩バッファー、高塩バッファー、および再び低塩バッファーの1 CVで平衡化します。 サンプル(ステップ3.1.11から正しい低塩バッファーに対して透析)をカラムに適用します。フロースルーを収集します。低塩バッファーで1 CVのカラムを洗います。 勾配溶出をセットアップする:流量1mL/minで30分で100%高塩バッファー、または流量0.5mL/分で60分。これは、精製を最適化するために、既知のFPLCクロマトグラムに基づいて再選択されてもよい。すべてのピーク分数を収集します。注:高塩条件は、議論のセクションで概説されているように、FAHDタンパク質によって異なる場合があります。 グラデーションが終了したら、1 CV の範囲でピークが検出されないまで、高塩バッファーで実行します (分数を収集します)。 収集されたすべての分数のサンプルを採取し、SDS-PAGE分析(12.5%ランニングゲル、4%スタッキングゲル)を実行します。個々のサンプルを液体窒素で凍結し、-80°Cで保存します。 SDS-PAGE解析が完了したら、FAHDタンパク質を含むサンプルをプールし、他のサンプルを廃棄します。必要に応じて、超遠心フィルターユニットを使用してタンパク質を濃縮します。 0.5 M NaOH(または他の洗剤)で25%SDSの1 mLを塗布し、カラムを洗浄します。H2O および 20% EtOH (H2O) でカラムを洗います。 必要に応じて、代替カラム(カチオンまたはアニオン交換クロマトグラフィー)でセクション5を繰り返す。この方法から得られたタンパク質は、塩基性活性アッセイを行うために十分に純粋であるか、または結晶学用のスクリーニングアッセイに使用することができる。高度なアプリケーションの場合は、セクション 6 に進みます。 6. サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によるFAHDタンパク質の精製 注:FPLC用シリカゲルカラム中の多孔質粒子は、流体力学半径(図3D)などの分子サイズに応じてタンパク質の分化を可能にします。説明されたステップは、SECカラムを使用してFPLCシステムで実行される予定です。 SDS-PAGEおよび銀染色によって検出される汚染の分子量に依存するSECカラムを選択してください。輪郭を描く方法は、両方の列に適しています。H2O の 400 mL でカラムを一晩洗い、SEC 実行バッファで平衡化します。このステップを自動化するには、FPLC システム用のプログラムを作成することをお勧めします。 SECランニングバッファの300 mLに1 mM DTTを追加し、氷の上に置く。これは実行中のバッファーです。このバッファーの 60 mL を列に適用します。 タンパク質サンプル(10分間10,000 x g)を遠心分離し、マイクロ沈殿物を除去します。列に上清を適用します。一般に、FPLCの前に上清を濾過することをお勧めします。 すべてのタンパク質がエラスに含めるまで、実行中のバッファーを列に適用します。適切な体積の分数(例えば、2 mL)ですべてのピークを収集します。SDS-PAGEのサンプルを採取し、液体窒素を使用してすべての分画を凍結します。冷凍画分を-80°Cに保管してください。 SDS-PAGE(およびウェスタンブロット)分析後、FAHDタンパク質を含むすべての分画を収集してプールします。銀染色は、まだ存在する可能性のある小さな汚染を検出することをお勧めします。 タンパク質を濃縮するために、超遠心フィルターユニットを使用します。FAHDタンパク質には必須ではありませんが、一般に脱塩工程(例えば、透析による)は、酵素アッセイおよび結晶化のために推奨されます。 FAHDタンパク質の純度を高めるために、異なる流量と塩濃度(経験的)で6.3~6.6の手順を数回繰り返します。H2O および 20% EtOH (H2O) で一晩カラムを洗います。 7. 基板オキサロ酢酸塩とアセチルピルビ酸を使用した基本的なFAHD活性アッセイ 注:FAHDタンパク質1(FAHD1)は、オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ(ODx)およびアシルピルベートヒドロラーゼ(ApH)活性を表示します。これについては、ディスカッション セクションで詳しく説明します。水溶液中のケトエノールツオメライゼーションによる不安定化(すなわち、エノライゼーション)のために、オキサロ酢酸塩は、共因子濃度およびpHの関数として時間の経過とともに単独で崩壊する(自動デカルボキシル化)。pH7の周りと25°Cの温度では、この効果は劇的ではありませんが、自動脱カルボキシル化と酵素濃度の両方を考慮してアッセイをブランクする必要があります。ピペッティングスキームの概要は図 4Aです。一般に、このアッセイには十分にキャリブレーションされたピペットを使用することをお勧めします。 図 4: 酵素アッセイ用のスケッチピペッティングスキーム。(A)基礎基質ベースのFAHDタンパク質酵素アッセイのスケッチピペッティングスキーム。基板ブランク: -S/-E;基板サンプル: +S/-E;酵素ブランク: -S/+E;酵素サンプル:+S/+E(S:基板、E:酵素)。詳細については、プロトコル ステップ 7 を参照してください。(B) FAHDタンパク質のマイケルス・メンテン運動学を評価するためのスケッチされたピペッティングスキーム。基板ブランク: -S/-E;基板サンプル: +S/-E;酵素ブランク: -S/+E;酵素サンプル:+S/+E(S:基板、E:酵素)。詳細については、プロトコルのセクション 8 を参照してください。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 マイクロプレートリーダーを起動し、25°Cで30分間平衡化します。255 nm で 12 ウェル (図 4Aで概説されているように) を読み取るためのプログラムをセットアップします。5 ミリ秒の遅延で 25 の複数の読み出しを使用することをお勧めします。サイクルを設定して、2 分ごとに 15 x (合計 30 分) を測定します。 デフォルトでは、pH 7.4で1mM MgCl2を持つ酵素アッセイバッファー(材料の表を参照)を調製します。変異型FAHDタンパク質は、異なる共因子またはpHレベルを必要としてもよい。Mg2+および Mn2+は、FAHD13、11、12、21の係合要因として知られています。 1 μg/μLタンパク質溶液を作成し、酵素アッセイバッファー(材料表)で希釈します。 試験する基質の20mM溶液の1mLを設定する(これまでに同定されたFAHDタンパク質の基質は、酵素アッセイバッファー内の他の場所にリストされている)。 図4Aに表示されるピペッティングスキームによれば、酵素ブランクおよびサンプルウェル:酵素アッセイバッファー(材料表)のピペット90μLを酵素溶液の5μL(5 μg)でウェルに調製する。 図4Aに表示されるピペッティングスキームによれば、基板ブランクおよびサンプルウェル:ピペ95μLの酵素アッセイバッファーをウェルに調製する。 測定の直前に、6つの空白のウェルに5 μLの酵素アッセイバッファーを塗布します。20 mM基板溶液の5 μLをサンプルウェルに塗布します。マルチチャンネルピペットを使用することをお勧めします。 50 μL の設定でマルチチャンネルピペットを使用して、すべてのウェルを穏やかに混合します。ブランクから始めて、サンプルウェルを進めます。気泡を作成しないように注意してください。プレートをマイクロプレートリーダーに挿入し、255 nm(ステップ7.1で概説)で各ウェルを測定します。 スプレッドシートで分析を実行します。フォトメーターの生データをスプレッドシートにコピーし、すべての設定(すべてのドキュメント)を別のシートに書き込みます。4つの調製物のそれぞれの3つの井戸のデータを平均する。サンプルからブランクを減算します。また、標準偏差を計算し、ブランクとサンプルの偏差を合計します。 このデータをプロットします(Y:光学密度、x:分単位)。指数関数的に減少する曲線を表示する必要があります。使用中の基板の種類に依存して、最初の10分以内の初期増加が観察され、その後、信号が減少する。これは、議論のセクションでより詳細に概説されているように、基板のケトエノールのオートマライゼーションに起因する。 時間の経過に伴う光信号データをプロットの最大値で除算し、データを範囲 [0, 1] にスケールダウンするために (図 5Aに例を示します)。最初の減少から始まる曲線の線形範囲を識別し、負の勾配(1 分)を計算します。 ODの減少の時間経過は、その初期濃度を介して基板に関連付けられています: 100 nmol/ウェル * 傾斜.評価されたタンパク質濃度c0を使用して、特定の活性が計算されます:100 nmol/ウェル* 勾配* 1/c0.μg/ウェルでc0を表し、この方法で計算された特定の活性は、μmol/min/mgに等しい単位nmol/min/μgを使用して表されます。 8. FAHDタンパク質のマイケルス・メンテン運動学の評価 注:FAHDタンパク質のマイケルス・メンテン運動学の評価は、特定のタンパク質活性が反応が起こっている相対タンパク質基質濃度と物理的体積の両方に依存するため、退屈です。信頼性の高い結果を得るためには、定常状態運動学を確立する必要があります。96ウェルUV透明プレート上のテスト済みプロトコルは、次の手順で概説されています。軽微なエラーは通常実験を台無しにするので、すべてのステップは細分的に実行する必要があります。以下に説明するより複雑なアッセイを試みる前に、セクション7に概説されたアッセイを習得することをお勧めします。 図 5: 酵素アッセイの例示的な結果。(A)標準偏差で基礎基質ベースのFAHDタンパク質酵素アッセイ(0~1の範囲に正規化)のために得られる例示的なUV吸収曲線。任意の時点での光学密度 (OD) 比 [OD(t)/OD(0)] は、初期 OD [t = 0] に正規化されます。OD(0)]。詳細については、プロトコルのセクション 7 を参照してください。(B)標準偏差を伴うヒトFAHD1タンパク質の例示的なマイケルス・メンテン運動学。詳細については、プロトコルのセクション 8 を参照してください。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 マイクロプレートリーダーを起動し、25°Cで30分間平衡化します。255 nm で 72 ウェル (図 4Bで概説されているように) を読み取るためのプログラムをセットアップします。5 ミリ秒の遅延で 25 の複数の読み出しを使用することをお勧めします。サイクルを設定して、2 分(合計 30 分)ごとに 15 倍を測定します。 手順 7.2 および 7.3 を実行します。次いで、酵素アッセイバッファーに100mM基板溶液の1mLを設定する。 酵素アッセイバッファーで基板溶液の希釈を調製する:40mM、20mM、10mM、6mM、4mM、2mM。アッセイは、対ワイズ(「調整」)酵素/基板濃度で行われます。このために、酵素アッセイバッファー内の酵素溶液の以下の希釈を調製します:0.5 μg/μL、0.4 μg/μL、2.5 μg/μL、2μg/μL、1.5 μg/μL、1μg/μL。 図4Bに示すすべてのウェルに180μLの酵素アッセイバッファーを適用する。基板(ブランクおよびサンプル)のすべてのウェルに10 μLの酵素アッセイバッファーを適用します。調製したタンパク質希釈シリーズの10 μLを酵素(ブランクおよびサンプル)のウェルに適用します。基板ブランクと酵素ブランクのウェルのすべてのウェルに10 μLの酵素アッセイバッファーを適用します。 測定の直前に、基板試料および酵素試料のウェルに、調製された置換希釈シリーズの10μLを適用する。 50 μL の設定でマルチチャンネル ピペットを使用して、ブランクから始めてすべてのウェルを穏やかに混合し、サンプルウェルに進みます。気泡を作成しないように注意してください。 プレートをマイクロプレートリーダーに挿入し、ステップ8.1で概説されているように、255 nmで各ウェルを測定します。スプレッドシートで分析を実行します。フォトメーターの生データをスプレッドシートにコピーし、すべての設定(すべてのドキュメント)を別のシートに書き込みます。 手順 7.11 で概説されているように、希釈系列のポイントごとの個別データ分析を実行します。7.14に。最終的に、初期基板濃度に対するすべての特定の活性およびプロットを得る:2 mM、1 mM、0.5 mM、0.3 mM、0.2 mM、0.1 mM。 個々の標準偏差を持つすべてのデータポイントを表示します。コンピュータマイケルス-メンテン運動学は、非線形曲線継手を介して、またはラインウィーバー-バーク分析を介して。個々のポイントを再測定し、ステップ 8.5 および 8.6 で個々のタンパク質濃度/基質濃度対比を適応させる必要がある場合があります。ヒトFAHD1のマイケル・メンテン図は図5Bで提供されている。 9. FAHDタンパク質の結晶化 注:FAHDタンパク質の結晶化(前述の15)は、24ウェルフォーマット(図6A)における吊り下げ水蒸気拡散法によって達成され得る。この技術を用いてヒトFAHD1の結晶化に関するステップバイステッププロトコルを15の下に示す。詳細については、ディスカッション セクションを参照してください。 図 6: FAHDタンパク質の結晶化(A)標準24ウェルまたは96ウェルSBSフットプリントの結晶化プレート。詳細については、セクション 9 を参照してください。(B) FAHDタンパク質の結晶化における基本的なプレートセットアッププロセス。この図は許可23で再描画されます。詳細については、セクション 9 を参照してください。(C)ヒトFAHD1結晶および対応する回折パターン(小さな挿入物)。最も近い格子間隔は、結晶の回折品質の尺度として挿入物に示されます。数値が小さいほど、解像度が高く、より有益なデータが表示されます。詳細については、プロトコルのセクション 9 を参照してください。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 SECの実行中のバッファーに対してタンパク質が透析されていることを確認します。FAHD1タンパク質は、高濃度(2-5 mg/mL)で利用可能でなければなりません。低濃度では、タンパク質は自発的な核生成の欠如のために結晶化しないことがあります。 結晶化のための貯留液の≥20 mLを準備します。蒸留水または脱イオン水を溶媒として使用する3つのストック溶液を作ります:1 M Na-HEPES(最小25mL、pH 7.5に調整)、50%(w/v)ポリエチレングリコール4000(PEG4k)(最小65mL)、および1M MgCl 2(10 mL)。 4 x 6 (合計 24) 異なる 15 mL チューブのグリッドをセットアップします。プレート上の対応する位置に従ってラベルを付けます(例えば、行(A、B、C、D)対列(1~6)、”A1″、”B5″、”D6″など)。各管に1 Mナヘペスのピペット1 mL。 50% のピペット 1 mL(w/v) PEG4k をチューブの行 A に、2 mL を行 B に、行 C に 3 mL、4 mL を行 D. ピペット 100 μL の 1 M MgCl2の列 1 にチューブの列 1 に、250 μL を列 2 に500 μL を列 3 に、1.0 mL を列 4 に、1.5 mL を列 5 に、2.0 mL を列 6 にします。 チューブ上のスケールが十分に正確である蒸留水または脱イオン水で10 mLボリュームまですべてのチューブを充填します。 人間のFAHD1タンパク質サンプル(または氷から)からヒトFAHD1タンパク質サンプル(〜5mg/mL)を取り出し、少なくとも10分間4°Cのテーブルトップ遠心分離機で最高速度でスピンダウンします。シュウ酸塩との共結晶化が望ましい場合は、タンパク質サンプルに2mMの最終的なシュウ酸濃度が含まれるようにストック溶液からシュウ酸塩を添加します。1 mM DTTを適用し、氷の上に保存します。 その間、理想的には18°Cで温度制御された部屋の中で、24ウェル結晶化プレートを解凍します。薄いガラスまたはプラスチック棒の助けを借りて、24ウェルプレートのすべての井戸の上の縁にパラフィン油の薄い層を分配します。調製した結晶化カクテル(A1~D6)の800μLを結晶化プレートの各対応ウェルに加えます。 新鮮な22mmのカバーリップをきれいな表面に置きます。カバースリップを汚れやほこりで汚染しないようにしてください。必要に応じて、圧縮空気またはダスタースプレーを使用してカバースリップから破片を取り除きます。 遠心分離が完了したら、チューブの下部にあるスピンダウン凝集体と破片が再び浮かびないように、タンパク質サンプルを振らないようにしてください。次のステップでは、溶液の表面のすぐ下にあるタンパク質試料からのピペットは、下から凝集体および堆積物をかき混ぜることを避けるために。 各ウェル(図6Bを参照)のピペット1μLのタンパク質溶液をカバースリップの中心に、それぞれのリザーバーカクテルの1 μLをタンパク質液滴に加え、気泡を回避します。カバースリップを逆さまにして井戸の上に置き、オイルがカバースリップの気密で井戸を密封するようにします。24ウェルプレートが完成するまで繰り返します。 プレートを18°Cに保存し、適切な顕微鏡で進行性のスケジュールで滴を観察します。ヒトFAHD1結晶は通常一晩で現れる(図6C参照)。