Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Alexander  K. H. Weiss; Max Holzknecht; Elia Cappuccio; Ilaria Dorigatti; Karin Kreidl; Andreas Naschberger; Bernhard Rupp; Hubert Gstach; Pidder Jansen-D&#252;rr

doi:10.3791/59729

JoVE Journal > Biochemistry

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Biochemistry

ביטוי, טיהור, התגבשות ואנזים אנזימים המכילים חלבונים בתחום הידרוקלז

Published: June 20, 2019

doi:

10.3791/59729

Alexander K. H. Weiss^1,2, Max Holzknecht^1,2, Elia Cappuccio^1,2, Ilaria Dorigatti¹, Karin Kreidl¹, Andreas Naschberger³, Bernhard Rupp³, Hubert Gstach⁴, Pidder Jansen-Dürr^1,2

¹Research Institute for Biomedical Aging Research,University of Innsbruck Austria, ²Center for Molecular Biosciences Innsbruck (CMBI),University of Innsbruck Austria, ³Division of Genetic Epidemiology,Medical University of Innsbruck Austria, ⁴Faculty of Chemistry, Department of Organic Chemistry,University of Vienna Austria

Summary

ביטוי וטיהור של הידרוקלז בתחום ההידרולז-מחשבים המכילים חלבונים מתוארים עם דוגמאות (ביטוי ב -E. coli, fplc). חלבונים מטוהרים משמשים התגבשות והפקת נוגדנים מועסקים עבור assays האנזים. התצוגה הנפתחת הנבחרת מוצגת כדי להציג את הפונקציונליות הרב של FAHD1 כמו הידרולואצטט decarboxylase ו acylpy, ההידרולז.

Abstract

הידרוקלז (פה)-מחשבים המכילים חלבונים (פהד) מזוהים כחברים של משפחת פה-על באאוקריוטס. אנזימים של משפחה זו מציגים בדרך כלל ריבוי פונקציונליות, הכולל בעיקר הידרולז ו decarboxylase מנגנונים. מאמר זה מציג סדרה של שיטות רצופות לביטוי ולטיהור של חלבוני פהד, בעיקר חלבון פהד 1 (FAHD1) orthologues בין מינים (אדם, עכבר, מתקנים, צמחים, וכו ‘). שיטות מכוסות הן ביטוי חלבונים ב -E. coli, כרומטוגרפיה של אהדה, כרומטוגרפיה של המרת יונים, סינון ג’ל אנליטי, התגבשות, עקיפה של קרני רנטגן ומאמר. חלבון מרוכז של רמות טוהר גבוהות (> 98%) עשוי להיות מועסק על ייצור התגבשות או נוגדנים. חלבונים בעלי איכות דומה או נמוכה יותר עשויים להיות מועסקים בתחום האנזים או משמש כאנטיגנים במערכות איתור (מערב לכתם, אליסה). בדיון בעבודה זו, המנגנונים האנזימטיים המזוהים של FAHD1 מתוארים על מנת לתאר את ההידרולז ואת הפונקציונליות הדו ביתר פירוט.

Introduction

הידרולז אצטט (פה)¹^,² סופרמשפחה של אנזימים מתאר קבוצה של אנזימים החולקים את התחום הקטליטי שימור מאוד³^,⁴^,⁵^,⁶ ^, מיכל ^סבן ^, בן שמונה ^, מיכל בן ¹⁰ ^, ¹⁰. למרות מרכז קטליטי המשותף שלהם, אנזימים אלה הם רב תפקודי, ורובם נמצאים prokaryotes, שם הם משמשים כדי לשבור תרכובות שאוחזרו ממקורות פחמן מורכבים³. רק שלושה מבני משפחה זו זוהו ב-eukaryotes עד כה: השם נותן פה², כמו גם את פה הדומיין המכיל חלבון 1 (FAHD1)¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴ ^,¹⁵ ו פה המכילים חלבון 2 (FAHD2). דלדול של FAHD1 כבר קשור עם הנשמה מיטוכונדריאלי לקויי¹³^,¹⁶ ו הקשורים עם סוג הפיך של הסביון הסלולר פניטיפ¹⁴ המקושרת פוטנציאל ביניים חסרונות. במערכת התחבורה האלקטרונית האדם FAHD1 וorthologues שלה במערכות מודל (העכבר, nematode, תאי התאים הסרטניים, צמחים, וכו ‘), כמו גם מוטציה בנקודות שנבחרו, הפכו druggable מטרות של עניין פוטנציאלי. עבור מחקר זה, חלבון רקומביננטי ברמות גבוהות של טוהר, כמו גם מידע על מנגנונים קטליטיים המודרכת על ידי מבני גביש ונוגדנים סלקטיבית הם חיוניים.

כתב יד זה מתאר שיטות לביטוי החלבון של פהד ב -E. coli, כרומטוגרפיה של זיקה, כרומטוגרפיה של החלפת יונים, משקעים אמוניום סולפט, הכנת סינון ג’ל אנליטי, התגבשות, עקיפה של קרני רנטגן ו . בסדר. מטרת השיטות והפרוטוקולים המתוארים כאן היא לספק הנחיות למדענים העובדים בתחומים שונים כגון בדיקות, ביולוגיה של הצמח, כמו גם בעלי חיים ומחקרים אנושיים, כדי לאפיין את החברים של משפחת פה-על, כולל בני-משפחה בלתי מאופיינים צריכים להיות רלוונטיים בתחום מסוים. הפרוטוקולים המתוארים כאן עשויים לספק תמיכה רבת-ערך לפרויקטים שמטרתה לאפיין מבני-משפחה מבית-המשפחה האחרים prokaryotic או איקריוטית.

הרציונל מאחורי השיטות המתוארות כאן הוא העובדה כי לאפיון של חלבונים מתוארים בצורה גרועה (במיוחד, אנזימים מטבוליים של רלוונטיות פיזיולוגית לא ידוע), הגישה להתחיל עם מטוהרים רקומביננטי חלבונים מאפשר את ה פיתוח של כלי מחקר באיכות גבוהה, כגון ההכנות של אנזימים פעילים מחוץ לתחום, נוגדנים באיכות גבוהה, ומעכבי תרופתי רב עוצמה וספציפיים עבור אנזימים שנבחרו. השיטות המתוארות מחייבות כרומטוגרפיה נוזלית מהירה של חלבון (FPLC) וקריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן. שיטות אלטרנטיביות (למשל, לבטא חלבון ללא אינדוקציה כימית, או להציג טיהור חלבונים על-ידי צנטריפוגה לאחר טיפול בחום ולאחריו כרומטוגרפיה התפלה והגודל ההדרה), ניתן למצוא במקום אחר¹⁷. בעוד שספקטרום רחב יותר של שיטות זמין לביטוי וטיהור של משפחת פה-משפחה אנזימים²^,⁷^,⁹,¹⁷,¹⁸, עבודה זו מתמקדת בביטוי ו טיהור של חלבוני פהד בפרט.

בחלק הדיון של כתב היד הזה, המנגנונים הקטליטיים שזוהו עבור חלבון FAHD1 (הידרולז, decarboxylase)¹⁵ מתוארים ביתר פירוט, על מנת להדגים את האופי הכימי של תגובות הזרז. הנתונים המתקבלים בהתבסס על עבודה קודמת⁷^,¹⁵^,¹⁸ (pdb: 6fog, PDB: 6foh) לרמוז פעילות שלישית של האנזים כמו כתו-enol איזומראז.

Protocol

1. ביטוי של חלבוני פהד ב -E. coli מוסמך טרנספורמציה של E. Coli עם וקטורים עבור ביטוי של חלבון פהדהערה: השלבים שנדונו בסעיף הבא מסוכמים בשרטוט באיור 1A, B. אותו פרוטוקול חל על כל חלבון פהד, כולל משתני נקודה-מוטציה. גרסאות כאלה ניתן להשיג באמצעות מוטזיס בבימויו של האתר ו-PCR טכניקות19 (כגון סו pcr דו צדדי20) מסוג פראי cdna.איור 1 : הגברה של E. coli המוסמכת ו אינדוקציה של חלבון הביטוי.(א) החדרת וקטור PET לתוך BL21 המוסמכת (DE3) בקטריה של E. coli , המתואר בסעיף 1. (ב) התחשמלות הפרוטוקול והציפוי של חיידקים שהפכו לחיות המחמד של החיידק, תיאר בשלב 1 של הפרוטוקול. חיידקים שהפכו מצופים בצלחות LB אגר עם אנטיביוטיקה לבחירה. (ג) הגברה של חיידקים שהפכו לחיות מחמד החיידק, המתואר בסעיף 1. המושבות נאספו מצלחת ליברות אגר ו הוגדל בינונית הזנה (LB או NZCYM) עד הצפיפות חיידקי הגיע לסף האמפירית של 0.4. (ד) אינדוקציה של חלבון ביטוי דרך מערכת DE3-Iptg-pET , שתוארה בסעיף 1 ושרטט באיור 2. ייצור החלבון מופעל על ידי יישום ה-IPTG הכימי. בסוף סעיף 1, את הגלולה חיידקי המכילה את החלבון הוא נקצרו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. השג BL21 המוסמכת (DE3 ) בקטריה החיידק הקולי ואת הביטוי pET וקטור (ראה טבלת חומרים). רצוי לבחור וקטור pET כי גם מקודד N-Terminal תג שלו או תג לכידה הקשורים לנוחות כדי לפשט את צעדי הטיהור הבאים. השג cDNA של חלבון פהד של בחירה ולהכניס אותו לאתר שיבוט פעיל של וקטור ביטוי pET, בין היזם T7 ו T7 באתר שליחות קטלנית, בהתאמה. לאחר הגברה מוצלחת פלאמיד ואימות [באמצעות רצף של ספק מסחרי (T7 התחל ניתן להשתמש עם מערכת המחמד לנוחיות: T7 יזם, קדימה פריימר: TAאטקG, בטאטאאכג; T7 שליחות קטלנית, הפוך פריימר: GCTAGTGCGG)], הוסף 5 – 10 ng של פלאמאמצע לתוך 100 μL של המוסמכת BL21 (DE3) החיידק הקולי של החיידק על הקרח. אין לנקות ולרדת, אבל קצת להקיש על הצינור עם כדי לערבב את התוכן. לשמור על החיידקים על הקרח 30 דקות, בעדינות להקיש על הצינור כל כמה דקות. מחממים מכשיר חימום או אמבט מים עד 42 ° צ’ (מדויק). לשים את הצינור המכיל את החיידקים לתוך המנגנון ולשמור אותם עבור 90 s (מדויק). שימו אותם בקרח מיד (איור 1A). לאחר 5 – 10 דקות על קרח, להוסיף 600 μL של NCZYM בינונית (ראה טבלת חומרים) ולשים את הצינור לתוך החממה חיידקים. טלטל את הצינורית במהירות בינונית לאורך הכיוון הרועד ב-37 ° c עבור 1 h. צלחת 200 μL של התרבות החיידקית על צלחת 10 ס מ ליברות-אגר (ראה טבלה של חומרים), המכיל אנטיביוטיקה בחירה של בחירה [למשל, אחד ספציפי עבור BL21 (DE3) ההתנגדות הגדולה (כלוראמאנקול), אחד עבור המחתרת קודד על וקטור pET (kanamycin או אמפיצילין, איור 1b)]. תרבות החיידקים על צלחת ליברות-אגר בחממה חיידקית ב 37 ° c בלילה. ביטוי של חלבוני פהד על ידי IPTG אינדוקציההערה: השלבים הראשונים שנדונו בסעיף הבא מסוכמים כשרטוט באיור 1C, D. המערכת T7 ביטוי באמצעות שילוב של הקלטת DE3 חיידקיים ומערכת pET וקטור מסוכמים באיור 2.איור 2 : DE3 קלטת/חיית מחמד וקטור מערכת כפולה הסביר.(א) הגנום שרטט של חיית מחמד וקטור שהפך BL21 (DE3) החיידק של החיידק. הגנום החיידקי היליד נושא קלטת DE3 (ראה פאנל B), כמו גם גן שחור כי כל הזמן מבטא את היחידות המדיכוי. וקטור חיית המחמד שאינם ילידי נושאת את הגן חלבון שנוסף בין היזם T7 פולימראז ורצף שליחות קטלנית. פרטים נוספים בלוח B. (ב) הקלטת DE3 של הגנום החיידקי יליד מקודד את המידע עבור T7 פולימראז במונחים של E. coli RNA פולימראז. חלבון זה, לעומת זאת, אינו בא לידי ביטוי משום שהיחידה לדיכוי החתך מונעת את החלבון RNA פולימראז מכריכה. ולכן אין T7 פולימראז מבוטא ולא חלבון אקסוגני מבוטא. (ג) יישום של ה-IPTG הכימי (טבלת חומרים) מעוות את המבנה של היחידות מחדש של lac ומונע מהם לחייב את הקלטת DE3. כתוצאה מכך, RNA פולימראז יכול כעת לאגד את הקלטת, אשר T7 פולימראז מתבטא, כמו חלבון אקסוגני בסופו של דבר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. לאחר היווצרות המושבה מוצלחת, לבחור מושבה אחת (ללא כל מושבות לווין) ולפזר אותו 5 מ ל NZCYM או ליברות בינונית עם אנטיביוטיקה, נבחר כמו לפני (שלב 1.1.7). תרבות באינקובטור החיידקי ב-37 ° c ללילה (איור 1C). לאחר גידול חיידקי מוצלח, להגביר את החיידקים 250 mL, 500 mL, או 1 L אצוות של בינוני, בהתאם לביקוש של כמות החלבון. מתאים את עוצמת הקול, להחיל אנטיביוטיקה שנבחרו כפי שנעשה בשלב 1.1.7 ולהוסיף על 1% – 2% של בקטריאלי צפופה טרום התרבות (כלומר, 2.5 – 5.0 mL כדי 250 mL נפח של בינוני, וכו ‘). קח דוגמה לשימוש בשלב 1.2.5 (1 mL או יותר) ובדוק את הדחיסות האופטית (OD) ב 600 ננומטר. חיידק התרבות בחממה החיידקית ב-37 ° c עבור 2 – 3 h (איור 1C). לאחר 2 – 3 h, ציירו מדגם לניתוח פוטומטרי. אם OD ב 600 ננומטר הגיע 0.4, להחיל 200 μM עד 1 מ”מ איזופרופיל-β-D-thio מזהה (IPTG, ראה טבלת חומרים).הערה: הערך בפועל הוא אמפירי עבור כל חלבון פהד או variant מוטציה נקודה, שם 1 מ”מ IPTG הוא המקסימום שיש להחיל. זה גורם חלבון הביטוי (איור 1D, איור 2 ג). לאחר 3 – 5 שעות נוספות באינקובטור החיידקי ב-37 ° c, ביטוי החלבון מותש.הערה: עיין בסעיף הדיונים להערות על בקרת טמפרטורה. לא מומלץ ללחוץ יותר מ -5 שעות לאחר הגיוס. קח דוגמה לשימוש בשלב 1.2.5 (1 mL או יותר) ובדוק את הדחיסות האופטית (OD) ב 600 ננומטר. לקצור את הגלולה בקטריאלי באמצעות צנטריפוגה ב 5,000 x g עבור 5 דקות. לבטל את הסופרנטאנט ולהקפיא את הגלולה ב-80 ° צ’ לאחסון ארוך יותר או 20 ° c עבור אחסון קצר (איור 1d). בדוק את האינדוקציה באמצעות שתי הדגימות הפופיקריות המאוחזרות, שבהן מתויג “-I” (לפני האינדוקציה) ו-“+ I” (לאחר האינדוקציה). לאחר צנטריפוגה והשעיה של הגלולה החיידקית, לנתח את שתי הדגימות על ידי SDS-PAGE על ידי טעינת כמות זהה של חלבון מוחלט.הערה: הדגם “+ I” אמור להציג להקה חזקה המשויכת למשקל המולקולרי של החלבון הנבחר, ואילו הדגם “-I” לא אמור להכיל את הלהקה. רמת אינדוקציה נמוכה היא בעיה נפוצה לייצור של חלבונים, אך הרמה של חלבון מבוטא מספיקה לעתים קרובות עבור השלבים הבאים. רמת אינדוקציה גבוהה היא יתרון אבל הוא לא חובה. 2. הליזה כדורי בקטריאלי וסינון פסולת תלוי אם החלבון שנבחר הוא שלו-מתויג או לא מתויג, בחר NI-נ. ת. ע פועל מאגר (שלו-מתויג, ראה טבלת חומרים) או מאגר מופעל hic קר קרח (לא מתויגים). עבור כל 250 mL של השעיה בקטריאלי המקורי, להחיל 5 מ ל של המאגר הנבחר לתוך הגלולה חיידקים (5 מ”ל עבור 250 mL, 10 mL עבור 500 mL, וכו ‘). הוסף 10 μL β-mercaptoethanol (β-ME) לכל 5 מ ל של מאגר שהוחל. השתמש ב-10 מ”ל פסטר לגרום לכוח מכני את הגלולה לתוך השעיה על ידי גירוד וליטוף (להימנע היווצרות בועות אוויר בזמן מלטף). בסופו של דבר להעביר את כל ההשעיה לתוך 1 50 mL שפופרת. רצוי sonicate (6x עבור 15 s בכוח בינוני) את ההשעיה. צנטריפוגה עבור 30 דקות במהירות גבוהה (10,000 x g) ב 4 ° c. לסנן את סופרנטנט ברציפות עם יחידות סינון (למשל, 0.45 μm, 0.22 μm) על הקרח.הערה: בהתאם לשלב הקודם צנטריפוגה, סינון ישירות דרך גודל מסנן קטן הנקבוביות עשוי להיות מייגע ובדרך כלל דורש סינון מראש דרך גודל נקבובית גדול יותר. ניתן להוסיף DNAse לקבלת תוצאות טובות יותר. לאחסן את המדגם על הקרח ולהמשיך מיד עם כל סעיף 3 או 4, תלוי אם החלבון הוא שלו-מתויג או לא מתויג. 3. טיהור החלבונים שלו-tagged פהד באמצעות כרומטוגרפיה של האהדה של NI-נ. א. הערה: ני2 + יונים מאוגדים באמצעות חומצה נירילוטריאצטט (נ. ת. ע) לשרף אגקם המשמש כרומטוגרפיה של זיקה (כרומטוגרפיה של מטאל, IMAC, איור 3a). התגים של חומצת אמינו של פולי היסטרדין מאגד בחוזקה את Ni-צ’לטה, ואת החלבונים שלו-tagged ניתן להפריד בין רוב החלבונים הנותרים. חלופה להכנה המתוארת של עמודות Ni-נ. ת. ע משתמשת בעמודי מראש של Ni-נ. ת. ע ומערכת FPLC. איור 3 : שרטט איורים של סוגים נפוצים של כרומטוגרפיה.(א) השרף של טור ני-נ. ת. ע. נ. ת. ע מחזיקה יוני ניקל ביונטי, המשמשים במונחים של כרומטוגרפיה של זיקה ליון מטאל (IMAC). תגיות פולי היסטידין לאגד רצוי מוטיב זה יכול להיות חומק על ידי סרביאזול. (ב) הציפוי האופייני של חלקיקי סיליקה בתוך הידרופובי המבוססת על הידרו-כרומטוגרפיה (hic-פניאיל). חלבונים הידרופובי מתקשרים עם חומר הציפוי ומתעכבים בנדידה שלהם בעוד שאחרים אינם. (ג) ציפוי אופייני של חלקיקי סיליקה בכרומטוגרפיה של אינטראקציה יונית. חלבונים מקוטים וטעונים מתקשרים עם חומר הציפוי ומתעכבים בנדידה שלהם בעוד שאחרים אינם. (ד) השרף של סיליקה ג’ל בגודל כרומטוגרפיה הדרה (SEC). בהתבסס על נקבוביות מוגדרות בחומר סיליקה, חלבונים עשויים להיות מופרדים על ידי גודלם (בקירוב הראשון המתאים המסה המולקולרית שלהם). חלבונים קטנים מחלחלים לחומר הנקבובי ומפגרים, וחלבונים גדולים עוברים מהר יותר סביב החלקיקים הנקבובי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. המשך משלב 2.5 (כלומר, החלבון נמצא Ni-נ. ת. ע פועל מאגר מסוננים על ידי 0.22 יקרומטר יחידות סינון על הקרח). הכינו עמודת פלסטיק או זכוכית ריקה על-ידי שטיפת העמודה הריקה והצמדת העמוד לגשר יציב. בחר את גודל העמודה בהתאם לעוצמת ההשעיה של החלבון. עבור כל 10 מ ל של השעיית חלבון, להחיל 500 μL של Ni-נ. ת. ע. לתוך הטור (לנענע בכבדות לפני השימוש). החל את השימוש באיטיות ובמהירות על המסנן התחתון של העמודה באמצעות פיפטה. , תן לטור להתיישב. מה שלוקח כמה שניות מלא את העמודה לחלוטין עם Ni-נ. ת. מאגר פועל, ומבטיח לא לשבש את שרף agarose. . תן לחוצץ לעבור דרך כוח הכבידה התהליך עשוי להיות מואץ על ידי החלת לחץ האגודל על הנוזל (באמצעות מכסה או כפפה ולחץ האגודל), אבל לדאוג לא לעוות שרף agarose. . למרוח את ההשעיה של החלבון כבעבר, תן לדגימה. לעבור דרך כוח הכבידה האצת שלב זה באמצעות לחץ האגודל אינה מומלצת, כאשר האיגוד של חלבונים לעמודה משופר אם קצב הזרימה נמוך. לאסוף את הזרימה בצינור (טבלת חומרים). לאחר שהדוגמה עברה, מלא שוב את העמודה כולה עם מאגר הפעלה של Ni-נ. א. לטפל לא לשבש את שרף agarose. תנו למדגם לעבור דרך כוח הכבידה, אבל בניגוד לשלב הקודם, האצת התהליך באמצעות לחץ האגודל מומלץ, כמו זהום פוטנציאליים בשל אינטראקציות לא ספציפיות עלול להיות שבור בדרך זו. לאסוף את הפתרון כביסה בצינור. חזור על שלב זה. מניחים קובט שקוף UV מתחת לטור ולהחיל 1 mL של מאגר משחרני נ. ת. ע. לאסוף את המדגם בלי להחיל כל הלחץ האגודל על שרף. בדוק את הדחיסות האופטית (OD) של המדגם ב 280 ננומטר לעומת מדגם ריק (כלומר, מאגר משחרני-נ. ת. ע). אופטימלי, המדגם מציג OD של גדול מ 2.5. OD מתחת 0.5 מציין כי אין כמות משמעותית של חלבון הוא במדגם.הערה: כפי שמתואר בסעיף הדיונים, ריכוזי מלח וסראזול של מאגר הלידזציה עשויים להיות מותאמים לכל חלבון פהד בנפרד. חזור על הצעדים ה3.1.7 וה3.1.8 עד לפעולת OD מתחת 0.5. מאגר כל הדגימות עם OD גבוה יותר בשפופרת על הקרח. התחל שוב עם שלב 3.1.4, תוך שימוש בזרימה-דרך משלב 3.1.5 כקלט חדש עבור חזרה זו של שלב 3.1.5. חזור על תהליך זה עד שהדוגמה הראשונה שנאספה בשלב 3.1.6 תציג הודעת OD מתחת 0.5.הערה: כפי שמתואר בחלק פתרון הבעיה של מקטע הדיון, חלבונים שלו מתויגים עשוי לאגד מספיק כדי Ni2 +שרף. במקרים כאלה, יש לבצע חזרה על שיטות הפעולה הללו או החלופה (למשל, כרומטוגרפיה להחלפת יונים). לקחת דגימות של כל שברי ביניים עבור ניתוח SDS-PAGE. מאגר האנרגיה של פאהד ב-“ני-נ. ת. ב… לכן, dialyze חלבון נגד מאגר אחר (לילה על הקרח, באמצעות 1 μL של DTT ל 100 mL של מאגר דיאליזה). השתמש במאגר של מלח נמוך בהתבסס על סוג כרומטוגרפיה של חילופי יונים שיש לבצע לאחר שלב זה. שימוש נפוץ אבובים תאית עם משקל מולקולרי אופייני לגזור-off של 14 kDa (שולחן החומרים). לאחר דיאליזה לילה, ניתן לרכז את החלבון באמצעות יחידות סינון אולטרה צנטריפוגה. בצע ניתוח SDS-PAGE (12.5% ג’ל פועל, 4% הערמה ג’ל) כדי לבדוק אובדן פוטנציאלי של חלבון, הימנעות מספיק, וטוהר חלבון בכלל. , אם הכל בסדר. המשך לאגף 5 4. טיהור חלבונים של פהד מתויג באמצעות כרומטוגרפיה של הידרופובי (HIC) הערה: פניל-קבוצות על משטח הציפוי של סיליקה ג’ל בטור HIC עבור FPLC (איור 3B) לאפשר הפרדת חלבונים על פי אופי הידרופובי. השלבים המתוארים יש לבצע עם מערכת FPLC מצויד 5 מ ל של עמודה HIC-פניאיל. עמודות ניתן לשטוף עם 1 M NaOH לשימוש חוזר עבור חלבונים שונים. עם זאת, עמודות המשמשות פעם עבור סוג אחד של חלבון פהד יש לעשות שימוש חוזר רק עבור סוג זה של חלבון. משקעים אמוניום סולפט (AS) . המשך משלב 2.5 החלבון הוא מאגר הפעלה HIC קר קרח (טבלת חומרים). העריכו את עוצמת הקול של תמיסת החלבון המוכן בדיוק למיקרו-ליטר (Vהתחלתית). לאט ובזהירות להוסיף מקרר מקורר HIC פועל מאגר כפתרון, עד 35 נפח-% כמו הרוויה הוא הגיע: Vכפי שנוספה = v הראשונית * 0.538. בעדינות לערבב את הפתרון עבור 30 דקות. צנטריפוגה עבור 15 דקות במהירות גבוהה (≥ 10,000 x g) ב 4 ° c. סנן את הסופרנטנט באמצעות יחידת סינון של 0.22 יקרומטר על הקרח. באופן אופציונלי, לקחת דוגמה עבור SDS-ניתוח דף: לדלל 1:4 וחום מיד ב 95 ° צ’ עבור 5 דקות או אחרת המדגם יהיה לגוש. המדגם עלול להיות קפוא בשלב זה (-20 ° c) כדי להמשיך ביום אחר. FPLC באמצעות עמודת HIC הגדרת מערכת ה-FPLC ושיטה של עמודת HIC-פניש 5mL עם 5 כרכים של עמודות (CV) של 20% אטוח (ב H2o) ואחריו 5 קורות חיים של H2o. מערבבים 260 mL של מאגר פועל HIC (מדויק) עם 140 mL של מאגר פועל HIC (מדויק). התוצאה היא פתרון אמצעי אחסון 35-% AS. בדוק את ה-pH (7.0); זהו מאגר A. מאגר B הוא 250 mL של מאגר פועל. הוסף DTT 1 מ”מ לשני המאגרים A ו-B, ואז להשאיר אותם על הקרח. שולי העמודה עם 8 מ ל של מאגר A, 8 מ ל של מאגר B, ו 8 מ ל של מאגר A ברצף זה. החל את המדגם המוכן בשלב הפרוטוקול 4.1. לשטוף עם מאגר A, עד ספיגה אופטית בסיסית ב 280 ננומטר מגיע 1000 – 500 מאו. החל תערובת של מאגרים A ו-B, כך שריכוז ה-33% (w/v). לשטוף עם 1 קורות חיים, וכתוצאה מכך מישור ב chromatogram. הגדרת מעבר צבע של מאגר B (עד 100% מאגר B לאורך זמן): 1.5 mL של מאגר B ב 3.8 דקות (כלומר, 5.7% מאגר B עם מדרון 1% B/mL). כאשר האות UV ב 280 ננומטר עולה, להתחיל לאסוף את השבר ולמקם אותו על הקרח מיד. בסופו של דבר, שטוף את העמודה באמצעות מאגר B. קחו דגימות מכל השברים עבור ניתוח של SDS-PAGE. הקפא את כל הדגימות באמצעות חנקן נוזלי ואחסן אותן ב-80 ° c. בצע ניתוח SDS-PAGE (ואבן חשופה מערבית), כדי לזהות את החלבון פהד בשברים שנאספו. שברים המכילים את החלבון נמצאים במאגר ומוחלים על טיהור נוסף, כפי שמתואר בשלבי הפרוטוקול הבאים. שטוף את הטור עם H2o ו 20% אטוח (ב H2o). 5. טיהור חלבונים של פהד באמצעות כרומטוגרפיה להחלפת יונים הערה: מולקולות עם קבוצות פונקציונליות טעונה מאוגדים לעמודת סיליקה חלקיקים עבור FPLC (איור 3C). זה מאפשר את הבידול של חלבונים לפי אופי יוניים שלהם, כגון המטען משטח. השלבים המתוארים יש לבצע עם מחשב FPLC וידע משויך, בהתאמה. השיטה המתוארת זהה לכרומטוגרפיה של המרת החליפין או האנייונית, אך המאגרים בהם יש להשתמש הם מעט שונים. בחרה במערכת כרומטוגרפיה של המרת החליפין. בחירה זו היא אמפירית ועשויה להשתנות בין החלבונים של פהד. באופן אופטימלי, ניתן להשתמש בשתי השיטות באופן עוקב. הגדרת מערכת FPLC ולשטוף את העמודה עם 5 קורות חיים של 20% אטוח (ב H2o), ואחריו 5 קורות חיים של H2o. שיטה העמודה עם 1 קורות חיים של מאגר מלח נמוך, מאגר מלח גבוה, ושוב מאגר המלח נמוך ברצף זה. החל את המדגם (dialyzed נגד מאגר מלח נמוך הנכון משלב 3.1.11) אל העמודה. . אספו את הזרימה שטוף את הטור עבור 1 קורות חיים עם מאגר מלח נמוך. הגדרת מגבלת הדרגתי: 100% גבוהה-מאגר מלח גבוה ב -30 דקות בקצב זרימה של 1 mL/min, או 60 דקות בקצב הזרימה של 0.5 mL/min. זה יכול להיות מחדש נבחר מבוסס על הידוע כבר FPLC chromatogram, על מנת לייעל את הטיהור. לאסוף את כל השברים השיא.הערה: תנאי המלח הגבוהים עשויים להשתנות בין החלבונים של פהד, כפי שמתואר בסעיף הדיונים. לאחר סיום מעבר הצבע, הפעל עם מאגר המלח הגבוה עד שלא אותרו פסגות נוספות מעל לטווח של 1 קורות חיים (לאסוף את השברים). קחו דגימות של כל השברים שנאספו ולבצע ניתוח SDS-PAGE (12.5% ג’ל פועל, 4% ג’ל הערמה). הקפא את הדגימות הבודדות בחנקן נוזלי ואחסן אותן ב-80 ° c. לאחר השלמת ניתוח SDS-PAGE, מאגר הדגימות המכילות את החלבון פהד ומתעלם מהאחרים. באופן אופציונלי, רכז את החלבון באמצעות יחידות סינון אולטרה-צנטריפוגה. החל 1 מ ל של 25% SDS ב 0.5 M NaOH (או חומרי ניקוי אחרים) כדי לנקות את העמודה. שטוף את הטור עם H2o ו 20% אטוח (ב H2o). באופן אופציונלי, חזור על סעיף 5 עם העמודה החלופית (כרומטוגרפיה או המרת החליפין האנייונית). החלבון המתקבל משיטה זו הוא טהור מספיק כדי לבצע את הפעילות בסיסית אומר או ניתן להשתמש בהקרנה בחני עבור קריסטלוגרפיה. עבור יישומים מתקדמים, המשך בסעיף 6. 6. טיהור חלבונים של פהד באמצעות כרומטוגרפיה (SEC) הערה: החלקיקים הנקבובי בעמודת סיליקה ג’ל עבור FPLC מאפשרים בידול של חלבונים לפי גודל מולקולרי, כגון רדיוס הידרודינמי (איור 3D). השלבים המתוארים מתבצעים באמצעות מערכת FPLC, המשתמשת בעמודות SEC. בחר עמודת SEC, התלויה במשקולות המולקולריות של זהום שעדיין קיימות, כפי שאותרו באמצעות SDS-PAGE וצביעת כסף. השיטה המותווה מתאימה לשתי העמודות. שטוף את העמודה לילה עם 400 mL של H2O ו equi, עם שניות פועל מאגר. מומלץ לכתוב תוכנית עבור מערכת FPLC כדי להפוך שלב זה לאוטומטי. להוסיף 1 מ”מ DTT כדי 300 mL של שניות ריצה מאגר ולשים אותו על הקרח. . זה המאגר המפעיל החל 60 mL של מאגר זה לעמודה. צנטריפוגה את דגימת חלבון (10,000 x g עבור 10 דקות) כדי להסיר כל מיקרו משקעים. החל את הסופרנטנט על העמודה. מומלץ בדרך כלל לסנן את הסופרנטאנט לפני FPLC. החל את המאגר הפועל על העמודה עד שכל החלבון מחורץ. לאסוף את כל הפסגות בשברים של נפח מתאים (למשל, 2 מ ל). קחו דגימות של SDS-PAGE ולהקפיא את כל השברים באמצעות חנקן נוזלי. אחסן את השברים הקפואים ב-80 ° c. לאחר ניתוח SDS-PAGE (ואבן חשופה מערבית), אסוף ובריכה את כל השברים המכילים את החלבון פהד. כתמים מכסף מומלץ לזהות זהום קטין שעדיין יכול להיות נוכח. השתמש ביחידות סינון אולטרה צנטריפוגה כדי לרכז את החלבון. למרות שאין חובה לחלבונים של פהד, באופן כללי, צעד התפלה (למשל, על ידי דיאליזה) מומלץ לאסמפי אנזימים והתגבשות. חזור על שלבים 6.3 – 6.6 מספר פעמים עם שיעורי זרימה שונים וריכוזי מלח (אמפיריים) כדי לשפר את הטוהר של חלבון פהד. רוחצים את הטור לילה עם H2o ו 20% אטוח (ב H2o). 7. בסיסי הפעילות פהד מספרת עם מצעים oxaloacetate ו acetylpyruvate הערה: החלבון פהד 1 (FAHD1) מציג את הפעילות של הידרוקלואצטט (ODx) ו/או לפיפיריבט (אסף). הדבר מתואר בפירוט רב יותר בסעיף הדיונים. בגלל חוסר יציבות על ידי כתו-enol טאוטואריזציה בתמיסה מימית (כלומר, enoliטיזציה), oxaloacetate נרקב על ידי עצמו לאורך זמן (auto-decarboxלציה) כפונקציה של הריכוז קופקטור ו-pH. בסביבות pH של 7 וטמפרטורה של 25 ° c, השפעה זו אינה דרמטית, אבל החובה חייבת להיות מתכלה לחשבון הן אוטומטי-decarboxylation וריכוז אנזימים. מערכת הליטוף מחולקת באיור 4A. באופן כללי, מומלץ להשתמש בפיפטות מכוילים היטב לצורך מימוש זה, שכן הוא רגיש למדי לטעויות קטנות. איור 4 : שרטט מערכת ליטוף עבור האנזים שאומר.(א) שרטט מערכת ליטוף עבור אנזים בסיסי מבוסס מצע של חלבון פהד שאומר. מצע ריק:-S/-E; דוגמת מצע: + S/-E; האנזים ריק:-S/+ E; דגימת אנזימים: + S/+ E (S: מצע, E: אנזים). עיין בצעד הפרוטוקול 7 לקבלת פרטים נוספים. (ב) שרטט מערכת ליטוף להערכת מייקל-מנטאן קינטיקה של חלבון פהד. מצע ריק:-S/-E; דוגמת מצע: + S/-E; האנזים ריק:-S/+ E; דגימת אנזימים: + S/+ E (S: מצע, E: אנזים). ראה סעיף 8 של הפרוטוקול לקבלת פרטים נוספים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. התחל קורא מיקרופלייט והשווה ל -30 דקות ב -25 ° c. הגדרת תוכנית לקריאת 12 בארות (כפי שמתואר באיור 4A) ב 255 ננומטר. מומלץ להשתמש 25 מספר קריאות מרובות עם עיכוב זמן של 5 ms. הגדרת מחזור כדי למדוד 15x כל 2 דקות (30 דקות בסך הכל). כברירת מחדל, הכן מאגר של שיטת האנזים (ראה טבלת חומרים) עם 1 מ”מ MgCl2 ב-pH 7.4. משתנה החלבונים של פהד עשוי לדרוש קופקטורים או רמות pH שונים. Mg2 + ו-Mn 2 + מוכרים קופשחקנים עבורFAHD1 3,11,12,21. צור פתרון חלבון של 1 μg/μL, דילול עם מאגר שיטת האנזים (טבלת חומרים). הגדרת 1 mL של 20 מ”מ פתרון של מצע להיבדק (מצעים מזוהים עד כה של חלבונים פהד מפורטים במקום אחר3) במאגר שיטת האנזים. לדברי ליטוף הערכה המוצגת באיור 4A, להכין את האנזים ריק ובארות לדוגמה: pipetting 90 μl של מאגר שיטת אנזים (טבלה של חומרים) לתוך בארות עם 5 μl (5 μg) של פתרון אנזים. על פי התוכנית ליטוף מוצג באיור 4A, להכין את המצע ריק ובארות לדוגמה: pipetting 95 μl של מאגר שיטת אנזים לתוך הבארות. ממש לפני מדידת, להחיל 5 μL של מאגר שיטת אנזים לתוך שש בארות ריקות. החל 5 μL של הפתרון 20 מ”מ המצע לבארות לדוגמה. מומלץ להשתמש בצנרת רב-ערוצית. השתמש בפיפטה רב-ערוצית ב-50 μL הגדרות כדי לערבב בעדינות את כל הבארות. התחל עם החללים הריקים והמשך עם הבארות לדוגמה. לדאוג לא ליצור שום בועות. הכנס את הצלחת לתוך קורא מיקרולוח ולמדוד כל טוב ב 255 ננומטר (כפי שמתואר בשלב 7.1). בצע את הניתוח בגיליון אלקטרוני. העתק את הנתונים הגולמיים מהפומטר לגיליון אלקטרוני, וכתוב את כל ההגדרות (כלומר, כל התיעוד) לגיליון אחר. ממוצע הנתונים של שלוש הבארות של כל אחת מארבע ההכנות. הפחת את הריק מהדוגמה. כמו כן, חשב סטיות סטנדרטיות וסכם את הסטיות של ריק ומדגם. התווה נתונים אלה (y: דחיסות אופטית, x: זמן בדקות). יש להציג עקומה היורדת באופן אקספוננציאלי. תלוי בסוג של מצע בשימוש, עלייה ראשונית בתוך 10 הדקות הראשונות עשוי להיות נצפתה, לאחר מכן האות פוחתת. זה מיוחסים לטאוטואריזציה של המצע, כפי שמתואר בפירוט רב יותר בסעיף הדיונים. חלק את נתוני האות האופטיים לאורך זמן על-ידי הערך המירבי של ההתוויה, כדי לשנות את גודל הנתונים לתוך הטווח [0, 1] (דוגמה מסופקת באיור 5A). זהה את הטווח הליניארי של העקומה, החל מהקטנה ההתחלתית וחשב את השיפוע השלילי (1/דקות). מהלך הזמן של הירידה ב-OD משויך למצע באמצעות הריכוז הראשוני שלה: 100 nmol/טוב * מדרון. באמצעות ריכוז חלבון מוערך c0, הפעילות הספציפית מחושבת: 100 nmol/טוב * מדרון * 1/c0. ביטוי c0 ב-μg/ובכן, הפעילות הספציפית שחושבה בדרך זו מבוטאת באמצעות היחידה nmol/min/μg, השווה ל-μm/min/mg. 8. הערכת מיכא-מנטן קינטיקה של חלבונים פהד הערה: הערכת מייקל הקינטיקה של חלבונים של פהד היא מייגעת, מאחר שפעילות החלבון הספציפית תלויה הן בריכוז התשתית היחסי של החלבון והן באמצעי האחסון הפיזי שבהם מתרחש התגובה. יש להקים קינטיקה של המדינה היציבה על מנת להשיג תוצאות אמינות. פרוטוקול נבדק על 96 לוחית שקופה UV מחולקת בשלבים הבאים. כל צעד צריך להתבצע בזהירות רבה, כאשר שגיאות קלות מקלקל בדרך כלל את הניסוי. מומלץ לשלוט על הנאמר בסעיף 7 לפני שתנסה את השיטה המורכבת יותר המתוארת להלן. איור 5 : תוצאות מופת של האנזים מוסר.(א) עקומת UV הספיגה למופת המתקבל עבור מבוסס מצע בסיסי חלבון פהד האנזים (מנורמל לתוך טווח של 0 אל 1) עם סטיית תקן. יחס הדחיסות האופטית (OD) [OD (t)/OD (0)] בכל זמן נתון t [OD (t)] מנורמל ל-OD הראשוני [t = 0; OD (0)]. ראה סעיף 7 של הפרוטוקול לקבלת פרטים נוספים. (ב) למופת מייקל-מנטאן קינטיקה של חלבון FAHD1 אנושי עם סטיית תקן. ראה סעיף 8 של הפרוטוקול לקבלת פרטים נוספים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. התחל קורא מיקרופלייט והשווה ל -30 דקות ב -25 ° c. הגדר תוכנית לקריאת 72 בארות (כפי שמתואר באיור 4B) ב 255 nm. מומלץ להשתמש 25 קריאות מרובות עם עיכוב של 5 ms זמן. הגדר מחזור כדי למדוד 15x כל 2 דקות (30 דקות בסך הכל). בצע את השלבים 7.2 ו-7.3. לאחר מכן, להגדיר 1 mL של 100 mM פתרון המצע במאגר שיטת האנזים. הכנת דילול של פתרון המצע במאגר של שיטת אנזים: 40 מ”מ, 20 מ”מ, 10 מ”מ, 6 מ”מ, 4 מ”מ, 2 מ”מ. הבחינה מבוצעת בריכוזים של אנזימים (“מותאמים”). בשביל זה, להכין את הדילול הבאים של פתרון האנזים במאגר שיטת האנזים: 0.5 μg/μL, 0.4 μg/μL, 2.5 μg/μL, 2 μg/μL, 1.5 μg/μl, 1 μg/μL. לתוך כל הבארות מתוארים באיור 4B להחיל 180 μl של מאגר שיטת האנזים. החל 10 μL של מאגר שיטת האנזים לתוך כל הבארות עבור המצע (ריק ומדגם). החל 10 μL של סדרת דילול החלבון המוכן לבארות עבור האנזים (ריק ומדגם). החל 10 μL של מאגר שיטת האנזים לתוך כל הבארות עבור בארות עבור המצע ריק ואת האנזים ריק. ממש לפני מדידת, להחיל 10 μL של סדרת דילול המצע מוכן לתוך הבארות עבור דגימת המצע ואת דגימת האנזים. השתמש בפיפטה רב-ערוצית בהגדרות ה50 μL כדי לערבב בעדינות את כל הבארות, החל מהחללים הריקים, והמשיכו בבארות המדגם. לדאוג לא ליצור שום בועות. הכנס את הצלחת לתוך קורא מיקרופלייט ולמדוד כל טוב ב 255 ננומטר, כפי שמתואר בשלב 8.1. בצע את הניתוח בגיליון אלקטרוני. העתק את הנתונים הגולמיים מהפומטר לגיליון אלקטרוני, כתוב את כל ההגדרות (כלומר, כל התיעוד) לגיליון אחר. בצע ניתוח נתונים בודד לכל נקודה בסדרת הדילול כפי שמתואר בשלבים 7.11. ל7.14. בסופו של דבר, להשיג את כל הפעילויות הספציפיות והעלילה נגד ריכוז המצע הראשוני: 2 מ”מ, 1 מ”מ, 0.5 mM, 0.3 mM, 0.2 mM, 0.1 mM. הצג את כל נקודות הנתונים באמצעות סטיות סטנדרטיות בודדות. מחשב מיכזה-מנטאן קינטיקה באמצעות התאמת עקומות לא לינארית, או דרך ניתוח לינויבר-בורק. ייתכן שתידרש למדוד מחדש את הנקודות הבודדות, ולהתאים את היחס היחיד לריכוז החלבון/ריכוז המצע בשלבים 8.5 ו-8.6. דיאגרמת מייקל-מנטאן לFAHD1 אנושי מסופקת באיור 5B. 9. התגבשות חלבונים של פהד הערה: התגבשות של חלבונים פהד (אדם FAHD1 תיאר בעבר15) עשוי להיות מושגת על ידי אדי טיפה תלויה שיטת דיפוזיה בפורמט 24 היטב (איור 6a). פרוטוקול צעד אחר צעד על התגבשות של האדם FAHD1 באמצעות טכניקה זו מוצגת מתחת לגיל15. תיאור מפורט יותר מסופק בסעיף הדיונים. איור 6 : התגבשות של חלבונים פהד.(א) התגבשות לוחות בתקן 24 טוב או 96 היטב לרגל SBS. ראה סעיף 9 לקבלת פרטים נוספים. (ב) תהליך הגדרת הלוח הבסיסי בגיבוש חלבונים של פהד. . הדמות הזאת מצויר באישור23 ראה סעיף 9 לקבלת פרטים נוספים. (ג) קריסטלים FAHD1 אנושיים ודפוסי עקיפה מקבילים (תוספות קטנות). מרווח הסריג הקרוב ביותר מצוין בתוספות כאמצעי לאיכות עקיפה של הקריסטלים. מספרים נמוכים יותר מצביעים על רזולוציה גבוהה יותר ולכן נתונים אינפורמטיביים יותר. עיין בסעיף 9 של הפרוטוקול לקבלת פרטים נוספים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. ודא כי החלבון מופעל באמצעות מאגר הפעלה של SEC. חלבון FAHD1 צריך להיות זמין בריכוזים גבוהים (2 – 5 מ”ג/mL). בריכוזים נמוכים, החלבון עשוי לא להתגבש עקב חוסר התגררות ספונטנית. הכינו ≥ 20 מ ל של פתרון המאגר עבור התגבשות. להפוך שלושה פתרונות מניות, באמצעות מים מזוקקים או מאוהים כמו ממס: 1 M Na-HEPES (מינימום 25 mL, מותאם ל-pH 7.5), 50% (w/v) פוליאתילן גליקול 4000 (PEG4k) (מינימום 65 mL), ו 1 M Gcl2 (10 מ”ל). הגדרת רשת של 4 x 6 (24 בסך הכל) שונים 15 מ”ל צינורות. סמן אותם לפי המיקומים המתאימים על הצלחת (למשל, שורה (A, B, C, D) לעומת עמודה (1-6) כמו “A1”, “B5”, “D6”, וכו ‘). פיפטה 1 מ ל של 1 מ’ מתחת לכל צינור. פיפטה 1 מ ל של 50% (w/v) PEG4k לשורה A של הצינורות, 2 מ”ל לתוך שורה B, 3 מ ל לתוך שורה C, ו 4 מ ל לתוך שורה D. פיפטה 100 μL של 1 M MgCl2 לטור 1 של צינורות, 250 μl לטור 2 , 500 μL לעמודה 3, 1.0 mL לטור 4, 1.5 mL לטור 5, ו2.0 mL לטור 6. ממלאים את כל הצינורות עד לנפח של 10 מ ל עם מים מזוקקים או מוכי, שם קנה המידה על הצינורות מדויק מספיק. קח את דגימת חלבון FAHD1 אנושי (~ 5 מ”ג/mL) מן המקרר (או מקרח) ו ספין למטה במהירות מקסימלית עם צנטריפוגה העליון השולחן ב 4 ° צ’ עבור לפחות 10 דקות. אם שיתוף התגבשות עם אוקסלט רצוי, להוסיף אוקסלט מתוך פתרון מניות כך דגימת חלבון מכיל ריכוז אוקסלט הסופי של 2 מ”מ. החל DTT 1 מ”מ ולאחסן על הקרח. בינתיים, לפרוק 24 לוחית התגבשות היטב, באופן אידיאלי בתוך חדר מבוקר טמפרטורה 18 ° c. הפץ שכבה דקה של שמן פרפין על השפה על גבי כל באר של 24 צלחת הבאר בעזרת זכוכית דקה או מוט פלסטיק. הוסף 800 μL של קוקטיילים התגבשות מוכנים (A1 כדי D6) לתוך כל טוב תואם של צלחת התגבשות. הציבו שמיכות חדשות של 22 מ”מ על משטח נקי. הימנע מזיהום הכיסוי מחליק עם עפר או אבק. במקרה הצורך, הסירו את כל הפסולת משובר הכיסוי באמצעות אוויר דחוס או תרסיס מאבק. לאחר שצנטריפוגה הושלמה, הימנע מניעור של דגימת החלבון כך שהאגרגטים ה והפסולת בתחתית הצינורית לא צפים שוב. בשלבים הבאים, הפיפטה מדגימת החלבון מתחת לפני השטח של הפתרון, כדי להימנע מערבוב אגרגטים ופיקדונות מלמטה. עבור כל באר (ראה איור 6B) פיפטה 1 μl של פתרון חלבון על המרכז של שובר כיסוי ולהוסיף 1 μl של קוקטייל המאגר המתאים ל-droplet של חלבון, הימנעות בועות. להפוך את הכיסויים שמיכות למטה ולמקם אותו על החלק העליון של הבאר, כך שמן חותמות את הבאר עם שמיכות אוויר חזק. חזור על הפעולה עד להשלמת הצלחת ה -24. לאחסן את הצלחת ב 18 ° צ’ ולצפות את הטיפות על לוח זמנים פרוגרסיבי עם מיקרוסקופ ראוי. קריסטלים FAHD1 אנושיים מופיעים בדרך כלל בין לילה (ראו איור 6C).

Representative Results

החל עם וקטור שיבוט מוכן לרכוש BL21 (DE3) החיידק של E. coli, הפלביניים מוכנס לתוך החיידקים באמצעות הלם חום או כל שיטה חלופית הולמת (איור 1). לאחר תקופה קצרה של הגברה, החיידקים שהפכו מצופים בצלחות LB אגר, על מנת לצמוח לילה. לוחות בנקודה זו עשויים להיראות שונים, בהתאם למגוון של מקורות שגיאה פוטנציאליים. לוחות עשויים להיות ריקים (כלומר, לא מושבות), מגודלים לחלוטין על ידי חיידקים, או משהו בין, בהתאמה. שתי דוגמאות של צלחות LB אגר לאחר שינוי אופטימלי ולא אופטימלי מתוארים באיור 7A. מושבות חיידקי רבות מדי מצביעות על כך שחיידקים רבים מדי מצופים (סביר) או שהאנטיביוטיקה בשימוש עלולה להיות שפג תוקפם (לא סביר). מעט מדי מושבות חיידקי עשוי להצביע על כך או לא מספיק פלסטלינה שימש לשינוי (להשתמש יותר בפעם הבאה) או כי אנטיביוטיקה יותר מדי שימשו כדי לבחור את החיידקים. בכל מקרה, אם המושבות קיימות, הם צריכים להיות בסדר, כמו באמצעות שתי אנטיביוטיקה סלקטיבית מרמז סיכוי משמעותי למדי של חיידקים לא השתנה לצמוח. עם זאת, אין מושבות בכלל, לעומת זאת, כי או החיידק איבד את יכולת השינוי שלהם (בגלל אחסון שגוי או אחסון על פני תקופות ארוכות יותר, הקפאה חוזרת והפשרה, וכו ‘), הלם החום לא הצליח (לא ספיגה פלאמצע או חיידקי מוות על ידי חום רב מדי), וקטור שיבוט פגום, או בטעות קבוצה שגויה של אנטיביוטיקה סלקטיבית היה בשימוש (לאמת את הגן ההתנגדות על וקטור פלמיד). איור 7 : תוצאות מייצגות לשינוי חיידקים IMAC.(א) נציג LB אגר צלחות עם BL21 שינוי (DE3) E. coli, המתקבל על ידי ביצוע הפרוטוקול בשלב 1.1. משמאל: צלחת עם מושבות מבוזרות היטב (דוגמה חיובית). מימין: צלחת עם מושבה אחת בלבד (דוגמה שלילית). עיגולים לבנים מסמנים. מושבות טובות המעגל האדום מסמן מושבות שצומחות קרוב מדי אחד לשני ולא צריך להיבחר כל עוד מושבות מבודדות זמינים. (ב) 12.5% אקרילאמיד sds-ניתוח דפים של סדרה של שולטת אינדוקציה (“-” מציין לפני iptg אינדוקציה; “+” מציין לאחר אינדוקציה IPTG, לפני הקציר הגלולה, מותאם כמויות שוות של חלבון מוחלט. הדבר מתואר בשלב 1.2. (ג) מופת 12.5% אקרילאמיד sds-ניתוח עמוד של הטיהור של NI-נ. ת. א. שלו-מתויג FAHD1 חלבון. הדבר מתואר בסעיף 3 של הפרוטוקול. כרומטוגרפיה הזיקה מפיקה חלבון של טוהר גבוה (> 70%, חץ שחור), עם זאת, כמה זהום קטנים נצפו גם (חיצים אדומים). זהום אלה מורכבים מחלבונים שאינם מפאהד הקושרים לעמודה, ומחלבונים הקושרים לחלבון פהד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. מושבות מאומתות נבחרות ונבחרו. לאחר הגברה במדיום המזין, ביטוי החלבון מופעל על ידי יישום IPTG הכימי. הגלולה החיידקית המכילה את החלבון המבוטא באמצעות מיליגרם כמויות נקצרו, והביטוי מאומת באמצעות SDS-PAGE (לדוגמה, ראה איור 7B). בעיות מסוימות עלולות להתרחש במהלך תהליך פשוט זה. ראשית, כמה חלבונים טופס הכללת גופים, כי הם כנראה איכשהו להפריע לחילוף החומרים הטבעי של החיידקים המארחים. זה נצפה עבור מוטציות מסוימות של האדם FAHD1 ו FAHD2. במקרים כאלה, מערכות ביטוי אחרות כמו תאי חרק עשויות להיות מתאימות יותר ויש להתחשב בהן. לאחר איסוף גלולה מתאי חרקים, לדוגמה, טיהור החלבונים מבצע את אותם צעדים כפי שמתואר בפרוטוקול זה. שנית, מערכת DE3pET מתגלה לפעמים להיות “דולף” (כלומר, החלבון כבר מבוטא במידה מסוימת לפני iptg אינדוקציה). הסיבה הפוטנציאלית לכך היא לא מובנת היטב, אבל זה עשוי לעזור לבטא את החלבון לאט לילה בחממה חדר קר. . שלישית, שום חלבון לא מבוטא זהו כנראה התרחיש הגרוע ביותר, כפי שהוא כנראה מצביע על וקטור פגום באמצע, ובכך מומלץ לרצף את הפלביניים. אם תג שלושימש לתייג את החלבון, כרומטוגרפיה של זיקה עם NI-נ. ת. ע. היא שיטת לכידה קלה וזולה לחסל את רוב הזהום (איור 7c). שיטות דומות קיימות עבור מערכות תגים אחרות (למשל, דלקת II). אם לא נעשה שימוש בתגית, שילוב של משקעים אמוניום גופרתי וכרומטוגרפיה עוקבת של הידרופובי יכולים גם להפריד את החלבון מרוב החלבונים האחרים (איור 8A). עם זאת, השוואת שתי השיטות (איור 7C לעומת איור 8a), ניתן להדגים את עליונותה של שיטות ה-NI-נ-ע על ידי ניתוח sds-PAGE. לפיכך מומלץ להשתמש בחלבון שהואמתויג. איור 8 : תוצאות הנציג עבור ניסויים FPLC (HIC, החליפין יון, SEC).(א) כרומוטוגרמה טיפוסית ו 12.5% אקרילאמיד sds-ניתוח עמוד של כרומטוגרפיה hic-פניל לאחר אמוניום סולפט (AS) משקעים של חלבון FAHD1 לא מתויג, כפי שמתואר בסעיף 4 של הפרוטוקול. הקו הירוק משקף את מעבר הצבע של מאגר B שאינו מכיל את הפונקציה AS. במהלך התהליך, כפי שנשטף בהדרגה מן המערכת. השוואת פאנל זה לדמות 7C מציג את כוחה של הזיקה NI-נ. ת. ע בהשוואה לשיטת hic-פניל, והיתרון של שימוש במערכת התגים שלולטיהור חלבונים. (ב) כרומאטוגרם מופתי ו-12.5% אקרילאמיד sds-ניתוח עמודים של כרומטוגרפיה של המרת כרומטוגרפי של פהד שלו-מתויג לאחר טיהור NI-נ. ת. א. באמצעות מעבר מלח, המדגם שהוחל מופרד לחלבונים בודדים. (ג) כרומאטוגרם מופתי ו 12.5% אקרילאמיד sds-ניתוח עמוד של הדרה G75 גודל כרומטוגרפיה של שלו-מתויג פהד לאחר כרומטוגרפיה החליפין כרומטוגרפי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. ברציפות, החלבון מופרד עוד יותר משאריות זהום באמצעות כרומטוגרפיה של הקטיון/אניב (לדוגמה, ראה איור 8B), ואחריו כרומטוגרפיה של החרגת מהגודל (לדוגמה, ראה איור 8b). מומלץ להקים אסטרטגיית טיהור ראשונית בסדר זה; עם זאת, יש להשתמש בעמודות אלה בשילוב, לאחר מכן ובווריאציה, עד שהחלבון יהיה טהור דיו. בעלי הפעילות הפשוטה, כדי לבדוק “כן או לא” החלטות על מצעים פעילים ו/או קופטים, ניתן לבצע עם החלבונים שלו-מתויג לאחר טיהור NI-נ. ע., או חלבונים לא מתויגים לאחר עמודת החליפין יוני. פעילויות ספציפיות וקבועים קינטי חייבים להיקבע עם חלבון של טוהר הגבוהה ביותר. התגבשות ניתן לנסות עם חלבונים לאחר עמודת החליפין יונית, אבל איכות הקריסטלים כמעט תמיד מתואם לטוהר החלבון. ניתן לגדל נוגדנים פוליבטיים כנגד חלבונים בכל שלב של פרוטוקול הטיהור; עם זאת, כאן האיכות גם מתואם את טוהר החלבון.

Discussion

שלבים קריטיים

חלבוני פהד רגישים מאוד לריכוזי מלח. בריכוזים נמוכים של שייט, החלבונים עלולים להגיע לפשרה, אך בדרך כלל הם יכולים להיות מחדש לחלוטין בריכוזים גבוהים של מלח. כלומר, אם חלבון פהד מזרז מסיבה כלשהי, הוא עשוי להיות משוחזר או מקופל עם ריכוזי מלח גבוהים יותר (> 300 μM). אך לא ניתן לשחזר עוד חלבונים הידרופובי (לדוגמה, FAHD2 אנושיים), אך דטרגנטים כגון בחורים (מקסימום 1%) או גליצרול (10%) עשוי לשמש כדי לשמור אותם בפתרון יציב. בכל מקרה, הקפאת הלם באמצעות חנקן נוזלי ואחסון ב-80 ° c מומלץ, כפי שהוא תהליך עדין ואיטי של הפשרה.

כמה בעיות בלתי צפויות עלולות להתרחש במהלך טיהור Ni-נ. ת. א בשלב 3.1.10. של הערה, OD גבוה יותר במדגם השני שנאסף מאשר במדגם הראשון מציין נפח גבוה מדי של שרף agarose (לקחת פתק ולהשתמש בשרף פחות בניסוי הבא). כמו כן, שרף agarose עצמו מוביל אות OD ב 280 nm (כלומר, הפרעה של המיטה שרף agarose ייתן אותות מלאכותיים). במקרה של ספק, מומלץ להשתמש בשיטות אחרות כמו שיטת ברדפורד או BSA כדי לקבוע ריכוזי חלבונים.

בשנת האנזימטית, ישנם שלושה היבטים קריטיים שניתן להחשיב. ראשית, הערכת ריכוז החלבון הוא קריטי כדי לקבל את הפעילויות הספציפיות הנכונות. רמת הטוהר של החלבון משפיעה על התוצאה וצריכה להיות מוערכת. במקרה של חלבון מתויג, המסה של תג-חלק צריך להיות מחושב, ואת הפעילות הספציפית צריך להיות מתוקן בהתאמה. למילים פשוטות שתוארו בסעיף 7 לפרוטוקול, הטוהר של Ni-נ. ת. ע מספיקה כדי להבדיל בין מצעים פעילים ובלתי פעילים, קופטים וכו ‘. במקרה של קינטיקה מורכבת יותר של מייקל-מנטה-מנטאן, יש לקבוע בצורה נכונה את כל ריכוזי החומרים המגיבים והמצע. במיוחד בעת שימוש ב-oxaloacetate (אשר אוטומטית-decarboxylates לאורך זמן) החלק האנזימטי של התגובה חייב להיות מתוקן עבור אוטומטי-decarboxלציה (תחת ההנחה כי שתי התגובות מתרחשות בו זמנית). שינויים ראשוניים באות הדחיסות האופטית הממוען לטאוטואריזציה של המצע חייב להיחשב. שלישית, ריכוזים ואמצעי אחסון חייבים להיות מותאמים. תגובה עם ריכוזים מוגדרים של אנזימים ומצע עשוי לתת תוצאות שונות התלויות בנפח השיטת. אם יש יותר מדי אנזימים בבאר, הדבקה של הנוזל עשויה למעשה להטיה של התוצאה.

להערכת מייקל-מנטאן קינטיקה מומלץ לבצע ניסויים ראשוניים ב 100 μL, 200 μL, ו 300 μL אצוות כדי למצוא את השילוב האופטימלי. היבטים דומים חלים על היחס של ריכוזי האנזימים-מצע עבור הקינטי. אנזים רב מדי למצע או המצע יותר מדי לאנזים לשים את המערכת מחוץ למצב יציב ליניארי המדינה מייקל. ניסויים ראשוניים נדרשים כדי לייעל את התנאים הללו. התאמת המופת לחלבון FAHD1 אנושי (פראי) מסופקים בסעיף 8, וכתוצאה מכך דיאגרמות קינטי (כפי שמוצג באיור 5B, למשל).

עבור התגבשות droplet של תמיסת חלבון הוא מחובר במרכז של שמיכות מעורבב עם droplet של קוקטייל התגבשות, אשר מורכב בדרך כלל מאגר (למשל, טריס-HCl, HEPES) ו מזרז (למשל, פוליאתילן גליקול, אמוניום סולפט). Droplet של פתרון מעכבי עבור התגבשות משותפת (כגון אוקסלט בפרוטוקול זה) עשוי להיות מוחל. Coverslip ממוקם לאחר מכן למטה מעל באר של מאגר המכיל קוקטייל התגבשות, איטום האוויר היטב הדוק בעזרת שמן איטום (איור 6B). באופן אידיאלי, לא מתרחשת משקעים בתוך הירידה בתחילת הניסוי, שמשמעותו היא שרידי החלבון בתמיסה. מאז ריכוז מזרז במאגר גבוה יותר מאשר בירידה, הירידה מתחילה לאבד את המים על ידי אידוי לאטמוספירה של הבאר עד שיווי משקל עם המאגר מגיע. הפצת המים לתוך המאגר גורמת לירידה בעוצמת הקול האיטית של הירידה שגורמת לעלייה של הריכוז הן, החלבון והתלול בירידה. אם פתרון החלבון מגיע למצב הנדרש של הרוויה, ובכך המטא-יציבות, הנוקלאוציה הספונטנית ולאחריה הצמיחה הגבישית יכולה להתרחש. הגעה למצב הרוויה היא תנאי הכרחי אך לא מספיק לתגבשות. התגבשות של חלבונים זקוקים הן, התנאים התרמודינמיים והקינטית, והרבה תלוי בתכונות בלתי צפויות של החלבון להיות מגובש²².

שינויים ופתרון בעיות

ביטוי החלבון ב -E. coli עשוי להיות לא יעיל. ריכוזי IPTG משתנים, טמפרטורת ביטוי וזמן הגברה, כגון טמפרטורת החדר במשך מספר שעות או בחדר קר לילה, צריך להיבדק עבור כל חלבון חדש כדי למצוא תנאים אופטימליים. משקעים של חלבון בגופי הכללה מתבוננים לעיתים ביותר חלבונים של הידרופובי פהד. במקרים כאלה, ביטוי חלבונים במערכות מודל אחרות כגון תאי חרקים מומלץ, מאחר שגוף ההכללה פחות סביר לטופס²⁶.

כמו חלבונים פהד רגישים לריכוזים של מלח ו קופקטור, כמו גם pH, אסטרטגיות לטיהור עבור homologues שונים, orthologues, וגרסאות מוטציה הנקודה עשויה להיות שונה בהגדרות בודדות. שיטות הטיהור המתוארות מפותחות לחלבון FAHD1 האנושי והעכבר הפראי. ריכוזים של כימיקלים, כגון הנאזול והסרפירון, כמו גם pH, יכול להיות מותאם עבור חלבונים בודדים עם נקודת איזואלקטריים שונים (pI). גם של הערה, לא כל חלבון שלו-מתויג יכול לאגד היטב שרף NI-נ. ת. א. אם מאגד חלבונים לטור Ni-נ. ת. א יעיל, ריכוזים מותאמים של הנאל והסרביאזול, כמו גם מצבי pH שונים במאגר של Ni-נ. ת. א. עשוי לסייע לשפר את איכות התוצאה. אם לא, דילוג על הצעד של ני-נ. ת. ע והמשך לשלב של החלפת כרומטוגרפיה יונית עשוי גם להוביל לאסטרטגיית טיהור מוצלחת. אם חלבון נקשר לטור של ני-נ. ת. ע אך לא ניתן להתחמק מהעמודה, תוספת של מספר EDTA mM עשוי לסייע לשבש את מורכבות Ni^{2 +} .

בנוגע לתהליך של התגבשות, זה צריך להיות מובן כי ארגון עצמי של מולקולות חלבון גדול ומורכב לתוך סריג תקופתי רגיל הוא תהליך סביר מטבעו שתלוי במידה רבה קשה לשלוט פרמטרים קינטית. אפילו שינויים קטנים בהגדרה המשמשת ליצירת התגבשות יכולים לשנות באופן דרמטי את התוצאה ולא יהיו גבישים. טוהר החלבונים בדרך כלל. היא בעלת חשיבות עליונה ככלל של אגודל, לא צריך להראות להקות אחרות הרבה יותר מידי. כמו כן, הרצף שבו מתבצעות שלבים עשוי להשפיע על התוצאה. כדוגמה, כדי להבטיח שינוי בלתי משתנה, לעתים קרובות יש צורך לשמור על רצף מלטף זהה, ולאחר מכן להוסיף את החלבון, ובסופו של דבר להוסיף מזרז ל-droplet התגבשות (או להיפך). לא משנה באיזו שיטה, יש לשמור אותו זהה בעת ניסיון להתרבות או לשנות את הניסויים. אם לא נצפו קריסטלים בעקבות פרוטוקול זה, ניתן לשנות את היחס הכימי של ההרכב, ה-pH, גודל השחרור והחלבון-לזרז במרווחים קטנים. סבלנות ותצפיות עקביות של הטיפות הן מוסריות.

הערות למנגנונים קטליטיים של FAHD1

השיטות שהוצגו פותחו במיוחד כדי להשיג FAHD1 חלבונים באיכות גבוהה. זו צמיחה מופעלת של גבישים FAHD1, כמו גם הנדסה של גבישים המכילים FAHD1 משלימה מעכב (oxalate, PDB: 6FOG). מבני רנטגן מספקים ארכיטקטורה תלת ממדית של חלל קטליטי של האנזים. תוצאות אלו מאפשרות תיאור מקיף של שאריות העשויים להיות חשובים למנגנונים הקטליטיים של האנזים המעניין הזה. FAHD1 תואר לראשונה כדי להיות מסוגל לקליב acylpyruvates (acetylpyruvate, fumarylפירובט)¹¹. מאוחר יותר, זה נמצא כי FAHD1 פועל גם כמו decarboxylase של oxaloacetate¹². למרות שהמצעים הכימיים והאוקאלואצטט הם moieties כימיים שונים, הטרנספורמציות הכימיות משתפות את המחשוף האסטרטגי של בונד משותף בודד C³-c⁴ , במרץ³-C⁴ אורטלי בונד להישאר אורתוגונאל הπ-אורבילים של C²-קרבונאיל¹⁵. הסכמה כזו מאפשרת ייצוב תהודה של C³-carבאופן מחודש בתהליך המחשוף. FAHD1 מצעים (oxaloacetate ו acylpyruvates) הם מולקולות גמישות עשוי להתקיים טאוטומאריק (כתו-enol) כמו גם C²-הנוזלים צורות (איור 9a). היוויי בין המינים השונים נקבעים בעיקר על ידי הטבע של הרכב מאגר בשימוש, pH ונוכחות של יוני מתכת. במקרים הבאים אנו דנים בתרחישים היפוסטיים בהשראת הניתוח של מבנים גביש רנטגן שחשף את המרכז הקטליטי של FAHD1.

איור 9 : פרטים על המנגנון הקטליטי המוצע של FAHD1 אנושי.
(א) oxaloacetate קיים במצב גבישי, כמו גם בפתרון נייטרלי בעיקר בטופס Z-enol²⁴. עם זאת, תחת מצבי ה-pH הפיזיולוגיים הטופס 2-כתו הוא הייצוג השולט²⁵. (ב) הסקיצה הכימית של hFAHD1 החלל¹⁵ עם מג מאוגד-oxaloacetate (משמאל) ו acylpyruvate מימין, עם R¹ כמו מנוחה אורגנית; החץ האדום מציין התקפה נוקלאופילית של המולקולה הסמוכה המים מיוצב) (ראה דיון). (ג) השוואה בין קונמציות מועדפות ל-c³-c⁴ מפצילות ב decarboxylase (ב-ג) ו הידרולז (ב) מנגנון של FAHD1: שני התהליכים התוצאה ב-Mg-משלימה פירובט-enolate (ראה דיון). Intermediates b ו-b צפויים להיות מיוצב על-ידי Q109, כפי ששורטטים בלוח B (ראה דיון). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

פעילות Decarboxקלז של FAHD1

Oxaloacetate קיים במצב גבישי, כמו גם בפתרון נייטרלי בעיקר בטופס Z-enol²⁴. אבל זה הוכח כי תחת התנאים הפיזיולוגיים של ph (תנאי מאגר ב-ph 7.4) הטופס 2-כתו הוא הייצוג השולט של oxaloacetate²⁵ (איור 9a), ו enolization אינה תנאי מוקדם עבור פירובט²⁷. של הערה, Mg^{2 +} יונים אין השפעה על היחס של מינים oxaloacetate ב-pH של 7.4 או מתחת²⁸. טרנספוזיציה של מFAHD1 האוקאלואצטט לתוך המרכז הקטליטי של העיר (מונחה על ידי oxaloacetate מאוגד באנזים המלא (PDB: 6FOG¹⁵)) חשף שאריות Q109 כרגולטור הקונפורמציה של האוקאלואצטט המאוגד¹⁵. כפי שמתואר בסעיף¹⁵, מקשר מימן לקבוצה carbamoyl של Q109 מייצב oxaloacetate-היווצרות כתוצאה מסיבוב סביב C²-c³ קשר (איור 9b, פאנל שמאל). כתוצאה מסיבוב זה, הקשר C³-c⁴ (להיות ביקח) מאמצת את הנטייה האורתוגללית ביחס לπ-אורבילים של C²-קרבונאיל (איור 9c). פחמן דו-חמצני ניתן לשחרר. המוצר העיקרי של תהליך זה יהיה תהודה מיוצב Mg-enolate של פירובט. הוא ידוע בחקירות של oxaloacetate-Mg מתחמים כי enolate צורות הקומפלקס היציב ביותר²⁸^,²⁹. בהנחה היציבות דומה עבור המוני Mg-pyruvate-מורכבות הקופקטור של FAHD1 יכול להיות חסום, אבל ליזין שאריות K123 יכול protonate את פירובט-enolate בשיווי משקל לאסור על אובדן של קופקטור¹⁵.

פרשנות נתונה מציע פירובט אנול כמתווך נפרד בפונקציה odx קטליטי של FAHD1. בשלב זה במודל היפותזה, נתונים ניסיוניים אינם מספקים אינדיקציה נוספת לסיבה שהמכסה הסגור יפתח כדי לשחרר את המוצר. זה עשוי להסיק, עם זאת, כי המנגנון המוצע נראה כמו עיכוב אנזים על ידי המוצר: מבנה הגביש חושף מולקולת מים שמורה המוחזק בכיוון כיווני לעבר מרכז קטליטי FAHD1 ידי שאריות H30 ו E33 הציג ב סליל קצר¹⁵, אשר נגרמת על ידי ליג, הכריכה וסגירת המכסה. אם אנול העיקרי היה להישאר בשיווי משקל עם הenolate, התהודה התייצב מיוצב יכול להיות מנובט על ידי מולקולת המים. הידרוקסיל כתוצאה מכך יהיה מסוגל לתפוס את הפירובט מ-Mg-קופקטור עליו המכסה היה נפתח. לבסוף, מרכז קטליטי ישוחזר בסביבה מיטוכונדריאלי. בתרחיש ההיפוקריאני הזה, מולקולת המים. החלל תפעל כחומצה, בהתאמה

פעילות הידרוקלז של FAHD1

פעילות הידרוקלז של אנזים דורש באופן משתמע את היווצרות הביניים של נוקלאופיל הידרוקסיל. מנגנון זה נמצא בדרך כלל בשילוב עם פעילות בסיס חומצה קטליטי. מצב המעבר של התגובה צריך להיות מוכן באמצעות קונפורמציה שליטה על ידי שרשראות ביקורתי חומצות אמינו בצד בחלל. באנלוגיה לדיון של הפונקציה decarboxylase, האנזים מאוגד האנזימים ב-2-כגון טופס יהיה לשים תחת שליטה בקרת מימן על ידי התחברות של חמצן 4-קרבונל Q109 (איור 9B, הלוח הימני). מבנה הגביש של oxalate כרוך FAHD1 (PDB: 6FOG) חושף מולקולת מים שמורה המוחזק בכיוון כיווני לעבר מרכז קטליטי FAHD1 על ידי שאריות H30 ו E33 הציג סליל קצר¹⁵. E33-H30 צמד מוכשר כדי deprotonate את המים ממוקם כיוונית הידרוקסיל וכתוצאה מכך הוא מהווה בסיס אידיאלי כדי לתקוף את 4-קרבונאיל של acylpyruvate הציג תחת שליטה בשליטה על ידי Q109¹⁵.

של הערה, מנגנון דומה הוצע עבור אח כ¹⁸. התקפה על ידי נוקלאופיל הידרוקסיל צפוי לגרום מינים oxyanion, כי הוא התייצב על בקרת מסלולית C³-c⁴ בונד מחשוף (איור 9c). במודל זה, סיבוב C³-c⁴ בונד (איור 9c) מתרחש לאחר ההתקפה הנוקלאופילית על ידי הידרוקסיל הנוצר שצוין באיור 9c (כלומר, הוא מכין את הספיחה עבור המחשוף הקשר). המוצרים העיקריים יהיה חומצת חומץ ו-Mg פירובט enolate. בתרחיש ההיפורומאני הזה, חומצת החומץ יכולה להרוות את האנרול לפירובט ולאחר מכן לסייע בעקירה של המוצר. מעל pH של 7.5 ובנוכחות של יוני Mg, acylpyruvates קיימים בשיווי משקל בין הטפסים כגון ו-enol, האחרון בהעדפה קלה³⁰. קרוב לוודאי שני הטפסים מסוגלים לאגד את הקופקטור של FAHD1 תחת הסגר מכסה הבאים. עיבוד של מצעים מסוג אנפילית באמצעות האנזים מושפע בשל המבנה השטוח של צורת enol. המחשוף C³-c⁴ יגרום לתוספת ויניבלית ללא ייצוב תהודה.

לכן, אנו מציעים לשלב הקטנוזציה הקטליטי להתכונן להתקפה של נוקלאופיל הידרוקסיל על ה-acyl קרבקסיל. תהליך זה של הקטונזציה, לעומת זאת, ידרוש שליטה על הטרנספל פרוטונים על ידי FAHD1 שאריות, אשר מייחסים פעילות איזוזומטית הטבועה ל FAHD1. הוא דיווח כי חומציות של Mg-bound אנול מימן מגלה גידול 10000-קיפול לעומת הטופס בלתי משלימה²⁸. דה-פרוטונציה של Mg מאוגד הטופס יהיה ריאלי על ידי ביטול protonated K123. דה-פרוטונציה of K123 עשוי להיות מסייע על ידי carboxylate אוחר של D102. רשת איגרות חוב מימן שנוצרה על ידי שאריות D102-K47-K123 יכולה לפעול כממסר הפרוטונים הדרוש במרכז הקטליטי של FAHD1¹⁵. הוקמה ביניים בעלת ערך כזה יכול להיות לאחר מכן על ידי E33-H30-H₂0 שלישיה תחת ketonization של המצע¹⁵. הטופס בעל שני הצורות היה מגיע תחת שליטה בQ109, ובמקביל בנוי הידרוקסיל לתקוף את הקוקסיל קרבונל. הדיון מסוכם מרמז על שליטה של FAHD1 על מולקולת מים למעבר בין חומצה לבסיס באמצעות הגומלין של שאריות היוצרים חלל.

יישומים עתידיים או הנחיות לשיטה

יישומים עתידיים של השיטות המתוארות כאן הם רבים. שפע של חברי פרוקריוטיים של משפחת פה-על ממתינים עדיין באפיון פונקציונלי. אפילו המידע הזמין על הפעילות הקטליטית של בני משפחה מוכרת של אח כ הוא נדיר וברוב המקרים, בהתבסס על הנחות תאורטית ולא על נתונים ניסיוניים. יישום השיטות המתוארות כאן עבור החברות המיוחדות של משפחת א. א. ע תלוי בתחומי המחקר הספציפיים באימונולוגיה. מצד שני, ההפגנה האחרונה, כי החברים המשפחה superkaryotic משפחת סופר לשחק תפקידים חיוניים בתאי תאים שונים (למשל, ציטוזול לעומת מיטוa) מדגיש את הצורך לאפיין טוב יותר את החלבונים האלה (שלושה מהם כבר זוהה עד כה), במיוחד משום שהנתונים הנוכחיים מצביעים על כך שכמה חלבונים שאינם מאופיינים יכולים לבצע פונקציות שונות בהקשר של ביולוגיה מיטוכונדריאלי, מחקר הזדקנות וחקר הסרטן. זה מוצע כי האפיון המולקולרי המלא של החברים המשפחתיים האלה איקריוטית האלה עשויים לספק תובנה חשובה בתחומים עיקריים של מחקר עכשווי במגזר ביו-רפואי. מחקר נוסף על המנגנונים של FAHD1 (ואנזימים קשורים) נחוצים כדי להבין טוב יותר מנגנונים בבסיס bi-פונקציונליות של FAHD1, אשר עדיין לא הובהר במלואו. מחקרים נוספים עם מוטציות FAHD1, NMR-חקירות, ומחקרים מבניים על מכלולי מעכבי עשוי לעזור לפתור את התרחישים המכניים האמיתי אשר FAHD1 נראה מוכשר. יתר על כן, תכנון בעזרת מחשב של מחקה אנול מסוגל לאגד את Mg-קופקטור יוביל בסופו של דבר למעכבי חזק של FAHD1.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים מודים מאוד על סיוע טכני מומחה על ידי Annabella Pittl ופיתוח שיטת הטייס על ידי Haymo Pircher.

Materials

BL21(DE3) pLysS competent E. coli	Promega	L1195	High-efficiency protein expression from gene with T7 promoter and ribosome binding site
pET E. coli T7 Expression Vectors	MERCK	–	http://www.merckmillipore.com/AT/de/life-science-research/genomic-analysis/dna-preparation-cloning/pet-expression-vectors/qFSb.qB.mLQAAAFA6.VkiQ0G,nav
0.45 µm filter units	MERCK	SLHP033NS	Millex-HP, 0.45 µm, PES 33 mm, not steril
0.22 µm filter units	MERCK	SLGP033RS	Millex-HP, 0.22 µm, PES 33 mm, not steril
Eppendof tubes 1.5 mL	VWR	525-1042	microcentrifugal tubes; autoclaved
15 mL Falcon	VWR	734-0451	centrifugal tubes
50 mL Falcon	VWR	734-0448	centrifugal tubes
PS Cuvettes Spectrophotometer Semi-Micro	VWR	30622-758	VIS transparent cuvettes
UV Cuvettes Spectrophotometer Semi-Micro	VWR	47727-024	UV/VIS transparent cuvettes
isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG)	ROTH	2316	chemical used for induction of protein expression with the DE3/pET system
imidazole	ROTH	X998	chemical used for elution of polyhistidine (6xHis) sequences from a nickel-charged affinity resin
Glass Econo-Column Columns	Bio-Rad	–	http://www.bio-rad.com/de-at/product/glass-econo-column-columns?ID=2cfb1c6e-32e8-4c72-b532-dd39013d707d&pcp_loc=catprod
chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C0378	antibiotic for bacterial growth selection; resistance endióded in pLysS plasmid of BL21(DE3) E. coli; 25 µg/mL final concentration
kanamycin	Sigma-Aldrich	60615	antibiotic for bacterial growth selection; to be used if this resistance is encoded in the employed pET vector; 50 µg/mL final concentration
ampicillin	Sigma-Aldrich	A1593	antibiotic for bacterial growth selection; to be used if this resistance is encoded in the employed pET vector; 100 µg/mL final concentration
Ultra-15, MWCO 10 kDa	Sigma-Aldrich	Z706345	centrifigal filters for protein enrichment; https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/z706345?lang=de®ion=AT
Ultra-0.5 Centrifugal Filter Units	Sigma-Aldrich	Z677108	centrifigal filters for protein enrichment; https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/ALDRICH/Z677108?lang=de&region=AT&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold5-2
oxaloacetic acid	Sigma-Aldrich	O4126	TCA metabolite
sodium oxlalate	Sigma-Aldrich	71800	a competitive inhibitor of FAH superfamily enzymes
Dialysis tubing cellulose membrane	Sigma-Aldrich	D9277	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d9277; or comparable
Ni-NTA agarose	Thermo-Fischer	R90101	a nickel-charged affinity resin that can be used to purify recombinant proteins containing a polyhistidine (6xHis) sequence
96-Well UV Microplate	Thermo-Fischer	8404	UV/VIS transparent flat-bottom 96 well plates
PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa	Thermo-Fischer	26616	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26616?SID=srch-hj-26616
ÄKTA FPLC system	GE Healthcare Life Sciences	–	using the FPLC system by GE Healthcare; different custom versions exist; this work used the "ÄKTA pure" system
HiTrap Phenyl HP column	GE Healthcare Life Sciences	–	https://www.gelifesciences.com/en/it/shop/chromatography/prepacked-columns/hydrophobic-interaction/hitrap-phenyl-hp-p-05630
Mono S 10/100 GL	GE Healthcare Life Sciences	–	https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/ion-exchange/mono-s-cation-exchange-chromatography-column-p-00723
Mono Q 10/100 GL	GE Healthcare Life Sciences	–	https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/ion-exchange/mono-q-anion-exchange-chromatography-column-p-00608
HiLoad Superdex column 75 pg (G75)	GE Healthcare Life Sciences	–	https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/size-exclusion/hiload-superdex-75-pg-preparative-size-exclusion-chromatography-columns-p-05800
HiLoad Superdex column 200 pg (G200)	GE Healthcare Life Sciences	–	https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/size-exclusion/hiload-superdex-200-pg-preparative-size-exclusion-chromatography-columns-p-06283
TECAN microplate reader	TECAN Life Sciences	–	https://lifesciences.tecan.com/microplate-readers
acetylpyruvate	MoleculeCrafting.HuGs e.U.	–	custom synthesis
benzoylpyruvate	MoleculeCrafting.HuGs e.U.	–	custom synthesis
VDX™ plate (24 wells)	Hampton	HR3-142	24 well plates used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion
paraffin oil	Hampton	HR3-411	used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion
coverslips (22 mm)	Karl Hecht KG	14043	coverslips used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion
Luria broth (LB) medium	self-prepared	–	a general growth medium for E. coli: 5 g/L yeast extract; 10 g/L peptone from casein; 10 g/L sodium chloride; 12 g/L agar-agar
NZCYM medium	self-prepared	–	a better growth medium for E. coli, used for amplification: 10 g/L NZ amine; 5 g/L NaCl; 5 g/L yeast extract; 1 g/L casamino acids; 2 g/L MgSO4; adjust pH to 7.4
Luria broth (LB) agarose plates	self-prepared	–	autoclaved agarose plates containing LB-medium and antibiotics for bacterial groth selection; https://www.addgene.org/protocols/pouring-lb-agar-plates/
Ni-NTA running buffer	self-prepared	–	20 mM Tris-HCl pH 7,4; 50-300 mM NaCl; 10-200 mM imidazole; ranges: optimal value varies among FAHD proteins
Ni-NTA elution buffer	self-prepared	–	20 mM Tris-HCl pH 7,4; 50-300 mM NaCl; 200-500 mM imidazole; ranges: optimal value varies among FAHD proteins
HIC running buffer	self-prepared	–	44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 100 mM NaCl; 20 mM DTT; adjust to pH 7
HIC running buffer AS	self-prepared	–	HIC running buffer saturated with ammonium sulfate (AS); adjust to pH 7: 70 g ammonium sulfate + 90 mL buffer, stirred overnight in the cold room; adjust to pH 7.0
Mono S low salt buffer	self-prepared	–	44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 10-300 mM NaCl; ranges: optimal value varies among FAHD proteins
Mono S high salt buffer	self-prepared	–	44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 1-2 M NaCl; ranges: optimal value varies among FAHD proteins
Mono Q low salt buffer	self-prepared	–	20 mM Tris-HCl; 15 mM NaCl; adjust to pH 8.0
Mono Q high salt buffer	self-prepared	–	20 mM Tris-HCl; 1 M NaCl; 10 % glycerol; adjust to pH 8.0
G75 / G200 running buffer	self-prepared	–	15 mM Tris-HCl; 300 mM NaCl; adjust to pH 7.4
enzyme assay buffer	self-prepared	–	50 mM Tris-HCl pH7.4; 100 mM KCl; 1 mM MgCl₂
protein crystallization buffer	self-prepared	–	G75 / G200 running buffer with 1 mM DTT
reservoir solution for crystallization	self-prepared	–	100 mM Na-HEPES pH 7.5; 5-20 % (w/v) PEG4k; 10 mM-200 mM MgCl₂

References

Brouns, S. J. J., et al. Structural Insight into Substrate Binding and Catalysis of a Novel 2-Keto-3-deoxy-d-arabinonate Dehydratase Illustrates Common Mechanistic Features of the FAH Superfamily. Journal of Molecular Biology. 379, 357-371 (2008).
Timm, D. E., Mueller, H. A., Bhanumoorthy, P., Harp, J. M., Bunick, G. J. Crystal structure and mechanism of a carbon-carbon bond hydrolase. Structure (London, England: 1993). 7, 1023-1033 (1999).
Weiss, A. K. H., Loeffler, J. R., Liedl, K. R., Gstach, H., Jansen-Dürr, P. The fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) superfamily of enzymes: multifunctional enzymes from microbes to mitochondria. Biochemical Society Transactions. 46, 295 (2018).
Guimarães, S. L., et al. Crystal Structures of Apo and Liganded 4-Oxalocrotonate Decarboxylase Uncover a Structural Basis for the Metal-Assisted Decarboxylation of a Vinylogous β-Keto Acid. Biochemistry. 55, 2632 (2016).
Zhou, N. Y., Fuenmayor, S. L., Williams, P. A. nag genes of Ralstonia (formerly Pseudomonas) sp. strain U2 encoding enzymes for gentisate catabolism. Journal of Bacteriology. 183, 700 (2001).
Izumi, A., et al. Structure and Mechanism of HpcG, a Hydratase in the Homoprotocatechuate Degradation Pathway of Escherichia coli. Journal of Molecular Biology. 370, 899-911 (2007).
Manjasetty, B. A., et al. X-ray structure of fumarylacetoacetate hydrolase family member Homo sapiens FLJ36880. Biological Chemistry. 385, 935-942 (2004).
Tame, J. R. H., Namba, K., Dodson, E. J., Roper, D. I. The crystal structure of HpcE, a bifunctional decarboxylase/isomerase with a multifunctional fold. Biochemistry. 41, 2982-2989 (2002).
Ran, T., et al. Crystal structures of Cg1458 reveal a catalytic lid domain and a common catalytic mechanism for the FAH family. The Biochemical Journal. 449, 51-60 (2013).
Ran, T., Wang, Y., Xu, D., Wang, W. Expression, purification, crystallization and preliminary crystallographic analysis of Cg1458: A novel oxaloacetate decarboxylase from Corynebacterium glutamicum. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 67, 968-970 (2011).
Pircher, H., et al. Identification of human Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing Protein 1 (FAHD1) as a novel mitochondrial acylpyruvase. Journal of Biological Chemistry. 286, 36500-36508 (2011).
Pircher, H., et al. Identification of FAH domain-containing protein 1 (FAHD1) as oxaloacetate decarboxylase. Journal of Biological Chemistry. 290, 6755-6762 (2015).
Petit, M., Koziel, R., Etemad, S., Pircher, H., Jansen-Dürr, P. Depletion of oxaloacetate decarboxylase FAHD1 inhibits mitochondrial electron transport and induces cellular senescence in human endothelial cells. Experimental Gerontology. 92, 7-12 (2017).
Etemad, S., et al. Oxaloacetate decarboxylase FAHD1 – a new regulator of mitochondrial function and senescence. Mechanisms of Ageing and Development. 177, 22-29 (2019).
Weiss, A. K. H., et al. Structural basis for the bi-functionality of human oxaloacetate decarboxylase FAHD1. Biochemical Journal. 475, 3561-3576 (2018).
Taferner, A., et al. FAH domain-containing protein 1 (FAHD-1) Is required for mitochondrial function and locomotion activity in C. elegans. PLoS ONE. 10, 1-15 (2015).
Mizutani, H., Kunishima, N. Purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of the fumarylacetoacetase family member TTHA0809 from Thermus thermophilus HB8. Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization Communications. 63, 792-794 (2007).
Bateman, R. L., Bhanumoorthy, P., Witte, J. F., McClard, R. W., Grompe, M., Timm, D. E., et al. Mechanistic Inferences from the Crystal Structure of Fumarylacetoacetate Hydrolase with a Bound Phosphorus-based Inhibitor. Journal of Biological Chemistry. 276, 15284-15291 (2001).
Zeng, F., et al. Efficient strategy for introducing large and multiple changes in plasmid DNA. Scientific Reports. 8, 1714 (2018).
Higuchi, R., Krummel, B., Saiki, R. K. A general method of in vitro preparation and specific mutagenesis of DNA fragments: study of protein and DNA interactions. Nucleic Acids Research. 16, 7351-7367 (1988).
Jansen-Duerr, P., Pircher, H., Weiss, A. K. H. The FAH Fold Meets the Krebs Cycle. Molecular Enzymology and Drug Targets. 2, 1-5 (2016).
Rupp, B. Origin and use of crystallization phase diagrams. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71, 247-260 (2015).
Rupp, B. . Biomolecular Crystallography: Principles, Practice, and Application to Structural Biology. , (2010).
Flint, D. H., Nudelman, A., Calabrese, J. C., Gottlieb, H. E. Enol oxalacetic acid exists in the Z form in the crystalline state and in solution. The Journal of Organic Chemistry. 57, 7270-7274 (1992).
Pogson, C. I. I., Wolfe, R. G. G. Oxaloacetic acid tautomeric and hydrated forms in solution. Biochemical and Biophysical Research Communications. 46, 1048-1054 (1972).
Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L., Kost, A. T. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nature Biotechnology. 23, 567-575 (2005).
Steinberger, R., Westheimer, F. H. Metal Ion-catalyzed Decarboxylation: A Model for an Enzyme System 1. Journal of the American Chemical Society. 73, 429-435 (1951).
Tate, S. S., Grzybowski, A. K., Datta, S. P. The stability constants of the magnesium complexes of the keto and enol isomers of oxaloacetic acid at 25. Journal of Chemical Society. , 1381-1389 (1964).
Tate, S. S., Grzybowski, A. K., Datta, S. P. The acid dissociations of the keto and enol isomers of oxaloacetic acid at 25. Journal of Chemical Society. 1372, 1380 (1964).
Brecker, L., et al. Synthesis of 2,4-diketoacids and their aqueous solution structures. New Journal of Chemistry. 23, 437-446 (1999).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Weiss, A. K. H., Holzknecht, M., Cappuccio, E., Dorigatti, I., Kreidl, K., Naschberger, A., Rupp, B., Gstach, H., Jansen-Dürr, P. Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins. J. Vis. Exp. (148), e59729, doi:10.3791/59729 (2019).

Automatically Generated