Expression, Purification, Cristallisation et Essais enzymatiques des protéines contenant du domaine de l'hydrolase fumarylacetoacetate

1. Expression des protéines FAHD dans E. coli compétent Transformation de E. Coli avec vecteurs pour l’expression de la protéine FAHDREMARQUE : Les étapes abordées dans la section suivante sont résumées dans l’esquisse de la figure 1A,B. Le même protocole s’applique à toute protéine FAHD, y compris les variantes de point-mutant. De telles variantes peuvent être obtenues par l’intermédiaire des techniques de mutagénèse dirigée s’y ornonne et pcR19 (comme SOE PCR20) à deux côtés de l’ADNc sauvage.Figure 1 : Amplification de E. coli compétent et induction de l’expression protéique.(A) Insertion du vecteur pET dans des bactéries BL21(DE3) pLysS E. coli compétentes, décrites à la section 1. (B) Protocole de choc thermique et placage de la bactérie E. coli transformée par l’E. coli, décrite à l’étape 1 du protocole. Les bactéries transformées sont plaquées sur des plaques d’agar LB avec des antibiotiques pour la sélection. (C) Amplification des bactéries E. coli transformées par l’EET, décrites à la section 1. Les colonies sont cueillies à partir d’une plaque d’agar LB et amplifiées dans un milieu nourrissant (LB ou NZCYM) jusqu’à ce que la densité bactérienne atteigne le seuil empirique de 0,4. (D) Induction de l’expression protéique par le système DE3-IPTG-pET, décrit à la section 1 et esquissé à la figure 2. La production de protéines est commencée par l’application du produit chimique IPTG. À la fin de la section 1, la granule bactérienne contenant la protéine est récoltée. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Obtenir des bactéries BL21(DE3) compétentes et un vecteur d’expression pET (voir Tableau des matériaux). Choisissez de préférence un vecteur pET qui code également une étiquette decapture N-terminal Ou une balise de capture connexe pour plus de commodité afin de simplifier les étapes de purification suivantes. Obtenir l’ADNc de la protéine FAHD de choix et l’insérer dans le site de clonage actif du vecteur d’expression pET, entre les sites de promotrice T7 et T7, respectivement. Après l’amplification et la vérification réussies de plasmide [par le séquençage par un fournisseur commercial (les amorces T7 peuvent être employées avec le système de pET pour la convenance : promoteur de T7, amorce avant : TAATACGACTCACTATAGGG ; T7 terminateur, amorce inverse: GCTAGTTATGCTCAGCGG)], insérer 5 à 10 ng de plasmide dans 100 ‘L de BL21(DE3) compétent s’il y a des bactéries E. coli sur la glace. Ne pas aspirer de haut en bas, mais appuyez légèrement sur le tube avec afin de mélanger le contenu. Garder les bactéries sur la glace pendant 30 minutes, en tapant doucement sur le tube toutes les quelques minutes. Chauffer un appareil de chauffage ou un bain d’eau à 42 oC (exact). Mettez le tube contenant les bactéries dans l’appareil et gardez-les pendant 90 s (exact). Mettez-les sur la glace immédiatement (figure 1A). Après 5 à 10 minutes de glace, ajouter 600 oL de milieu NCZYM (voir Tableau des matériaux)et mettre le tube dans un incubateur de bactéries. Secouez le tube à vitesse moyenne orienté le long de la direction de secousse à 37 oC pendant 1 h. Plaque 200 l de la culture bactérienne sur une plaque LB-agar de 10 cm (voir Tableau des matériaux), contenant des antibiotiques de sélection de choix [p.p., un spécifique pour la résistance bl21 (DE3) pLysS (chloramphenicol), et un pour la résistance codé sur le vecteur pET (kanamycine ou ampicilline, figure 1B)). Culture de la bactérie sur la plaque LB-agar dans un incubateur bactérien à 37 oC pendant la nuit. Expression des protéines FAHD par induction IPTGREMARQUE : Les premières étapes discutées dans la section suivante sont résumées comme une esquisse dans la figure 1C,D. Le système d’expression T7 par combinaison de la cassette bactérienne DE3 et du système vectoriel pET est résumé à la figure 2.Figure 2 : Le système dual de cassette/pET DE3 expliqué.(A) Le génome esquissé du vecteur pET a transformé la bactérie BL21(DE3) pLysS E. coli. Le génome bactérien indigène porte une cassette DE3 (voir panneau B), ainsi qu’un gène lac qui exprime constamment des unités de répresseur de lac. Le vecteur pET non indigène porte le gène protéique inséré entre un promoteur de polymérase T7 et une séquence de terminaison. Plus de détails dans le panneau B. (B) La cassette DE3 du génome bactérien indigène code l’information pour la polymérase T7 en termes d’un operon de polymère d’ARN de E. coli. Cette protéine, cependant, n’est pas exprimée parce que l’unité de répresseur de lac empêche la protéine de polymérase d’ARN de se lier. Par conséquent, aucune polymérase T7 n’est exprimée et aucune protéine exogène n’estexprimée. (C) L’application du produit chimique IPTG (Tableaudes matériaux) déforme la structure des unités de répresseur de lac et les empêche de se lier à la cassette DE3. En conséquence, la polymérase d’ARN peut maintenant se lier à la cassette, pour laquelle la polymérase T7 est exprimée, de même que la protéine exogène par la suite. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Après la formation réussie d’une colonie, choisissez une seule colonie (sans aucune colonie satellite) et dispersez-la en 5 ml de NZCYM ou de lb-mesure avec des antibiotiques, choisis comme avant (étape 1.1.7). Culture dans l’incubateur bactérien à 37 oC du jour au lendemain (figure 1C). Après une croissance bactérienne réussie, amplifiez les bactéries en 250 ml, 500 ml, ou 1 L lots de milieu, selon la demande de quantité de protéines. Approprié au volume, appliquez des antibiotiques choisis comme fait dans l’étape 1.1.7 et ajoutez environ 1%-2% de la pré-culture bactérienne dense (c.-à-d., 2.5-5.0 mL à 250 mL volume de milieu, etc.). Prenez un échantillon à utiliser à l’étape 1.2.5 (1 ml ou plus) et vérifiez la densité optique (OD) à 600 nm. Bactéries de culture dans l’incubateur bactérien à 37 oC pour 2 à 3 h (figure1C). Après 2 à 3 h, prélever un échantillon pour l’analyse photométrique. Si l’OD à 600 nm a atteint 0,4, appliquez 200 M jusqu’à 1 mM isopropyl-D-thiogalactopyranosid (IPTG, voir Tableau des matériaux).REMARQUE : La valeur réelle est empirique pour chaque variante de mutation de protéine ou de point de FAHD, où 1 mM IPTG est le maximum qui devrait être appliqué. Cela induit l’expression des protéines (Figure 1D, Figure 2C). Après 3 à 5 heures de plus dans l’incubateur bactérien à 37 oC, l’expression des protéines est épuisée.REMARQUE : Consultez la section de discussion pour obtenir des commentaires sur le contrôle de la température. Plus de 5 h de secousses après l’induction n’est pas recommandé. Prenez un échantillon pour une utilisation à l’étape 1.2.5 (1 ml ou plus) et vérifiez la densité optique (OD) à 600 nm. Récolter le granule bactérien par centrifugation à 5 000 x g pendant 5 min. Jeter le supernatant et congeler le granule à -80 oC pour un stockage plus long ou à -20 oC pour un bref stockage (Figure 1D). Vérifier l’induction par l’intermédiaire des deux échantillons photométriques récupérés, qui sont étiquetés «-I » (avant l’induction) et « I » (après l’induction). Après la centrifugation et la résuspension de la granule bactérienne, analyser les deux échantillons par SDS-PAGE en chargeant la même quantité de protéines totales.REMARQUE : L’échantillon « I » doit présenter une bande solide associée au poids moléculaire de la protéine choisie, tandis que l’échantillon « I » ne doit pas contenir cette bande. Un faible niveau d’induction est un problème commun pour la production de protéines, mais le niveau de protéines exprimées est souvent suffisant pour les étapes suivantes. Un niveau d’induction élevé est un avantage mais n’est pas obligatoire. 2. Lysis des granulés bactériens et filtration des débris Selon que la protéine choisie est sa-étiquetée ou non étiquetée, sélectionnez Ni-NTA en cours d’exécution tampon (Son-étiqueté, voir Tableau des matériaux) ou froid HIC tampon de fonctionnement (non étiqueté). Pour chaque 250 ml de suspension bactérienne d’origine, appliquer 5 ml du tampon sélectionné sur le granule bactérien (5 ml pour 250 ml, 10 ml pour 500 ml, etc.). Ajouter 10 ‘L’-mercaptoéthanol par 5 ml de tampon appliqué. Utilisez une tuyauterie Pasteur de 10 ml pour forcer mécaniquement la pastille à la suspension en grattant et en piégrant (éviter la formation de bulles d’air pendant le tuyautrage). Finalement transférer toute la suspension dans un tube de 50 ml. De préférence sonicate (6x pour 15 s à force moyenne) la suspension. Centrifugeuse de 30 min à grande vitesse (10 000 x g) à 4 oC. Filtrer le supernatant consécutivement avec des unités de filtre (p. ex., 0,45 m, 0,22 m) sur la glace.REMARQUE : Selon l’étape précédente de centrifugation, la filtration directement par une petite taille de pores de filtre peut être fastidieuse et exige habituellement la préfiltration par une plus grande taille de pores. DNAse peut être ajouté pour de meilleurs résultats. Conservez l’échantillon sur la glace et procédez immédiatement à l’article 3 ou à la 4e section, selon que la protéine est étiquetée ou non étiquetée. 3. Purification de sesprotéines FAHD étiquetées à l’aide de la chromatographie d’affinité Ni-NTA REMARQUE : Les ions Ni2 sont liés par l’acide nitrilotéritic (NTA) à une résine d’agarose qui est utilisée dans la chromatographie d’affinité (chromatographie d’ion métallique immobilisée, IMAC, figure 3A). Les étiquettes d’acide aminé de poly-histidine se lient fortement à ce Ni-chelate, et ses protéines marquées peuvent être séparées de la majorité des protéines restantes. Une alternative à la préparation décrite des colonnes Ni-NTA est d’utiliser des colonnes Ni-NTA préemballées et un système FPLC. Figure 3 : Illustrations esquissées de types communs de chromatographie.(A) La résine d’une colonne Ni-NTA. NTA détient des ions nickel bivalents qui sont utilisés en termes de chromatographie d’affinité d’ions métalliques immobilisés (IMAC). Les étiquettes de poly-histidine se lient de préférence à ce motif et peuvent être élucées par l’imidazole. (B) Le revêtement typique des particules de silice dans une chromatographie d’interaction hydrophobe à base de phényl (HIC-phényl). Les protéines hydrophobes interagissent avec le matériau de revêtement et sont retardées dans leur migration alors que d’autres ne le sont pas. (C) Le revêtement typique des particules de silice dans la chromatographie d’interaction ionique. Les protéines polarisées et chargées interagissent avec le matériau de revêtement et sont retardées dans leur migration alors que d’autres ne le sont pas. (D) La résine d’un gel de silice dans la chromatographie d’exclusion de taille (SEC). Sur la base de pores définis dans le matériau de silice, les protéines peuvent être séparées par leur taille (dans une première approximation correspondant à leur masse moléculaire). De petites protéines imprègnent le matériau poreux de colonne et sont retardées, tandis que de grandes protéines migrent plus rapidement autour des particules poreuses. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Procédez à partir de l’étape 2.5 (c.-à-d., la protéine est dans le tampon de fonctionnement Ni-NTA et filtrée par des unités de filtre de 0,22 m sur la glace). Préparer une colonne de plastique ou de verre vide en lavant la colonne vide et en l’attachant à un dispositif de retenue stable. Choisissez la taille de la colonne en fonction du volume de la suspension protéique. Pour chaque 10 ml de suspension protéique, appliquer 500 ll de boue d’agarose Ni-NTA dans la colonne (secouer fortement avant utilisation). Appliquer la boue lentement et dropwise sur le filtre inférieur de la colonne à l’aide d’une pipette. Laissez la colonne s’installer, ce qui prend quelques secondes. Remplissez complètement la colonne de tampon de fonctionnement Ni-NTA, en veillant à ne pas perturber la résine d’agarose. Laissez passer le tampon par gravité. Le processus peut être accéléré en appliquant une pression du pouce sur le liquide (à l’aide d’un couvercle ou d’un gant et de la pression du pouce), mais prenez soin de ne pas déformer la résine d’agarose. Appliquer la suspension protéinée. Comme avant, laissez l’échantillon passer par gravité. Il n’est pas recommandé d’accélérer cette étape à l’aide de la pression du pouce, car la liaison des protéines à la colonne est améliorée si le débit est faible. Recueillir le flux dans un tube (Tableau des matériaux). Une fois l’échantillon passé, remplissez à nouveau toute la colonne avec le tampon d’exécution Ni-NTA. Veillez à ne pas perturber la résine d’agarose. Laissez l’échantillon passer par gravité, mais contrairement à l’étape précédente, il est recommandé d’accélérer le processus par la pression du pouce, car les contaminations potentielles en raison d’interactions non spécifiques peuvent être perturbées de cette façon. Recueillir la solution de lavage dans un tube. Répétez cette étape. Placez une cuvette transparente UV sous la colonne et appliquez 1 ml de tampon d’élution Ni-NTA. Recueillir l’échantillon sans appliquer de pression de pouce à la résine. Vérifiez la densité optique (OD) de l’échantillon à 280 nm contre un échantillon vierge (c.-à-d., tampon d’élution Ni-NTA). De façon optimale, l’échantillon affiche une OD supérieure à 2,5. Une OD inférieure à 0,5 indique qu’aucune quantité significative de protéines ne se trouve dans l’échantillon.REMARQUE : Comme indiqué dans la section de discussion, les concentrations de sel et d’imidazole du tampon d’élution peuvent devoir être adaptées pour chaque protéine FAHD individuellement. Répétez les étapes 3.1.7 et 3.1.8 jusqu’à ce que l’OD tombe en dessous de 0,5. Mettre en commun tous les échantillons avec une OD plus élevée dans un tube sur glace. Recommencez avec l’étape 3.1.4, en utilisant le flux à partir de l’étape 3.1.5 comme nouvelle entrée pour cette répétition de l’étape 3.1.5. Répétez ce processus jusqu’à ce que le premier échantillon prélevé à l’étape 3.1.6 affiche une OD inférieure à 0,5.REMARQUE : Comme indiqué dans la partie dépannage de la section de discussion, ses protéines étiquetées peuvent se lier insuffisamment à la résine Ni2. Dans de tels cas, la répétition de cette étape ou de méthodes alternatives (p. ex., chromatographie d’échange d’ions) est nécessaire. Prenez des échantillons de toutes les fractions intermédiaires pour l’analyse SDS-PAGE. Les protéines FAHD dans le tampon d’élution Ni-NTA se précipitent lors de la congélation et de la décongélation. Par conséquent, dialysez la protéine contre un tampon différent (pendant la nuit sur la glace, en utilisant 1 L de TNT par 100 ml de tampon de dialyse). Utilisez un tampon à faible teneur en sel en fonction du type de chromatographie d’échange d’ions qui doit être effectuée après cette étape. Utilisez des tubes de cellulose courants avec une coupure de poids moléculaire typique de 14 kDa (Tableaudes matériaux). Après la dialyse de la nuit, concentrez la protéine en utilisant des unités de filtre ultra-centrifugation. Effectuez l’analyse SDS-PAGE (12,5 % de gel courant, 4 % de gel d’empilage) pour vérifier la perte potentielle de protéines, l’élution insuffisante et la pureté des protéines en général. Si tout va bien, passez à l’article 5. 4. Purification des protéines FAHD non étiquetées par chromatographie hydrophobe d’interaction (HIC) REMARQUE : Les groupes de phényles sur la surface de revêtement d’un gel de silice dans une colonne HIC pour FPLC (Figure 3B) permettent la séparation des protéines selon le caractère hydrophobe. Les étapes décrites doivent être effectuées avec un système FPLC équipé d’une colonne HIC-phényl de 5 ml. Les colonnes peuvent être lavées avec 1 M NaOH pour être réutilisées pour différentes protéines. Cependant, les colonnes autrefois utilisées pour un type de protéine FAHD doivent être réutilisées uniquement pour ce type de protéine. Précipitations de sulfate d’ammonium (AS) Procédez à partir de l’étape 2.5. La protéine est dans la glace-froid HIC en cours d’exécution tampon (Tableau des matériaux). Évaluer le volume de la solution de protéines préparée précisément au microlitre (Vinitial). Ajouter lentement et à la baisse la solution AS pré-refroidie, jusqu’à ce qu’une saturation AS de 35 % soit atteinte : VAS ajouté ‘ Vinitial ‘ 0.538. Remuer délicatement la solution pendant 30 min. Centrifugeuse pendant 15 min à grande vitesse (10 000 x g) à 4 oC. Filtrer le supernatant à l’aide d’une unité de filtre de 0,22 m sur la glace. En option, prélever un échantillon pour l’analyse SDS-PAGE : diluer 1:4 et chauffer immédiatement à 95 oC pendant 5 min, sinon l’échantillon se bosse. L’échantillon peut être congelé à ce point (-20 oC) afin de procéder à un autre jour. FPLC à l’aide d’une colonne HIC Configurer le système FPLC et réquilibrer une colonne HIC-phényl de 5mL avec 5 volumes de colonnes (CV) de 20% EtOH (en H2O) suivi de 5 CV de H2O. Mélanger 260 mL de tampon de fonctionnement HIC (exact) avec 140 mL de tampon de fonctionnement HIC AS (exact). Il en résulte une solution AS de 35 % de volume. Vérifier le pH (7.0); c’est le tampon A. Buffer B est de 250 ml de tampon en cours d’exécution. Ajouter 1 mM DTT aux deux tampons A et B, puis les garder sur la glace. Équilibrez la colonne avec 8 ml de tampon A, 8 ml de tampon B et 8 ml de tampon A dans cette séquence. Appliquer l’échantillon préparé à l’étape 4.1 du protocole. Laver avec le tampon A, jusqu’à ce que l’absorption optique de base à 280 nm atteigne 1000 à 500 mAU. Appliquer un mélange de tampons A et B, de sorte que la concentration de S est de 33 % (w/v). Laver avec 1 CV, résultant en un plateau dans le chromatogramme. Configurer un gradient de tampon B (jusqu’à 100% tampon B au fil du temps): 1,5 ml de tampon B en 3,8 min (c.-à-d., tampon B de 5,7% avec 1% b/mL de pente). Lorsque le signal UV à 280 nm augmente, commencez à recueillir la fraction et placez-la sur la glace immédiatement. En fin de compte, lavez la colonne avec le tampon B. Prenez des échantillons de toutes les fractions pour l’analyse SDS-PAGE. Congeler tous les échantillons à l’aide d’azote liquide et les conserver à -80 oC. Effectuer l’analyse SDS-PAGE (et western blot), pour détecter la protéine FAHD dans les fractions recueillies. Les fractions qui contiennent la protéine sont mises en commun et appliquées à une purification plus poussée, comme indiqué dans les étapes du protocole suivante. Laver la colonne avec H2O et 20% EtOH (en H2O). 5. Purification des protéines FAHD par l’intermédiaire de la chromatographie d’échange d’ion REMARQUE : Les molécules dont les groupes fonctionnels chargés sont liées à une colonne de particules de silice pour le FPLC (figure 3C). Cela permet la différenciation des protéines en fonction de leur caractère ionique, comme la charge de surface. Les étapes décrites doivent être effectuées avec une machine FPLC et le savoir-faire associé, respectivement. La méthode décrite est la même pour la chromatographie d’échange cationique ou anionique, mais les tampons à utiliser sont légèrement différents. Choisissez le système de chromatographie d’échange cationique ou anionique. Ce choix est empirique et peut varier entre les protéines FAHD. De façon optimale, les deux méthodes peuvent être utilisées consécutivement. Configurer le système FPLC et laver la colonne avec 5 CV de 20% EtOH (en H2O), suivi de 5 CV de H2O. Equilibrate la colonne avec 1 CV de tampon à faible teneur en sel, tampon à haute teneur en sel, et encore une fois tampon de faible teneur en sel dans cette séquence. Appliquer l’échantillon (dialysé contre le tampon de sel faible correct à partir de l’étape 3.1.11) sur la colonne. Recueillir le flux à travers. Laver la colonne pour 1 CV avec un tampon de sel faible. Configuration d’une élution de gradient : tampon de 100 % de haute teneur en sel en 30 min à un débit de 1 ml/min, ou 60 min à un débit de 0,5 ml/min. Ceci peut être re-sélectionné sur la base d’un chromatogramme FPLC déjà connu, afin d’optimiser la purification. Recueillir toutes les fractions de pointe.REMARQUE : Les conditions de sel élevé peuvent varier entre les protéines FAHD, comme indiqué dans la section de discussion. Une fois le gradient terminé, exécutez avec un tampon à haute teneur en sel jusqu’à ce qu’aucun pic ne soit détecté sur la plage de 1 CV (collecter les fractions). Prélever des échantillons de toutes les fractions collectées et effectuer l’analyse SDS-PAGE (12,5 % de gel en cours d’exécution, 4 % de gel d’empilement). Congeler les échantillons individuels dans de l’azote liquide et les stocker à -80 oC. Une fois l’analyse SDS-PAGE terminée, mettez en commun les échantillons contenant la protéine FAHD et jetez les autres. En option, concentrez la protéine à l’aide d’unités de filtre ultra centrifugation. Appliquer 1 ml de 25 % de SDS dans 0,5 M NaOH (ou d’autres détergents) pour nettoyer la colonne. Laver la colonne avec H2O et 20% EtOH (en H2O). Optionnellement, répétez la section 5 avec la colonne alternative (chromatographie d’échange cationique ou anionique). La protéine obtenue à partir de cette méthode est suffisamment pure pour effectuer des tests d’activité de base ou peut être utilisée dans les essais de dépistage pour la cristallographie. Pour les demandes avancées, procédez à l’article 6. 6. Purification des protéines FAHD par chromatographie de taille-exclusion (SEC) REMARQUE : Les particules poreuses dans une colonne de gel de silice pour FPLC permettent la différenciation des protéines selon la taille moléculaire, comme le rayon hydrodynamique (figure3D). Les étapes décrites doivent être effectuées avec un système FPLC, à l’aide de colonnes SEC. Choisissez une colonne SEC, dépendante du poids moléculaire des contaminations encore présentes, tel que détecté via SDS-PAGE et la coloration argentée. La méthode décrite convient aux deux colonnes. Laver la colonne pendant la nuit avec 400 mL de H2O et équilibrer avec SEC running buffer. Il est recommandé d’écrire un programme pour le système FPLC pour automatiser cette étape. Ajouter 1 mM DTT à 300 mL de tampon de fonctionnement SEC et le mettre sur la glace. C’est le tampon en cours d’exécution. Appliquer 60 ml de ce tampon sur la colonne. Centrifuger l’échantillon de protéines (10 000 x g pendant 10 min) pour éliminer toute micro-précipitation. Appliquer le supernatant sur la colonne. Il est généralement recommandé de filtrer le supernatant avant FPLC. Appliquer le tampon courant sur la colonne jusqu’à ce que toutes les protéines soient élucées. Recueillir tous les pics en fractions de volume approprié (p. ex., 2 ml). Prélever des échantillons pour SDS-PAGE et congeler toutes les fractions à l’aide d’azote liquide. Conserver les fractions congelées à -80 oC. Après l’analyse SDS-PAGE (et western blot), collectez et mettez en commun toutes les fractions contenant la protéine FAHD. La coloration argentée est recommandée pour détecter les contaminations mineures qui peuvent encore être présentes. Utilisez des unités de filtre ultra-centrifugation pour concentrer la protéine. Bien qu’il ne soit pas obligatoire pour les protéines FAHD, en général, une étape de dessalement (par exemple, par dialyse) est recommandée pour les analyses d’enzymes et la cristallisation. Répéter les étapes 6,3 à 6,6 plusieurs fois avec des débits et des concentrations de sel différents (empiriques) afin d’améliorer la pureté de la protéine FAHD. Laver la colonne pendant la nuit avec H2O et 20% EtOH (en H2O). 7. Tests d’activité DE base FAHD avec des substrats oxaloacetate et acétylpyruvate REMARQUE : La protéine FAHD 1 (FAHD1) affiche l’activité de l’oxaloacetate decarboxylase (ODx) et de l’hydrolase d’acylpyruvate (ApH). Ceci est décrit plus en détail dans la section de discussion. En raison de la déstabilisation par la tautomerisation de keto-enol dans la solution aqueuse (c.-à-d., l’éolisation), l’oxaloacattate se désintègre par lui-même au fil du temps (auto-décarboxylation) en fonction de la concentration cofactorielle et du pH. À environ un pH de 7 et une température de 25 oC, cet effet n’est pas dramatique, mais les tests doivent être effacés pour tenir compte à la fois de l’auto-décarboxylation et de la concentration en zymatique. Le schéma de tuyauterie est décrit à la figure 4A. En général, il est recommandé d’utiliser des pipettes bien calibrées pour cet avertissement, car il est très sensible aux erreurs mineures de pipetage. Figure 4 : Schéma de pipetage esquissé pour les analyses d’enzymes.(A) Un schéma de pipetage esquissé pour les analyses d’enzymes FAHD à base de substrat. Substrat blanc: -S/-E; échantillon de substrat : S/-E; blanc enzymatique: -S/E; échantillon d’enzymes : S/E (S : substrat, E : enzyme). Voir l’étape 7 du protocole pour plus de détails. (B) Un schéma de pipetage esquissé pour évaluer la cinétique Michaelis-Menten de la protéine FAHD. Substrat blanc: -S/-E; échantillon de substrat : S/-E; blanc enzymatique: -S/E; échantillon d’enzymes : S/E (S : substrat, E : enzyme). Voir la section 8 du protocole pour plus de détails. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Démarrer un lecteur de microplaques et d’équilibrer pendant 30 min à 25 oC. Mettre en place un programme de lecture de 12 puits (tel qu’indiqué à la figure 4A) à 255 nm. Il est recommandé d’utiliser 25 lectures multiples avec un délai de 5 ms. Configurer un cycle pour mesurer 15fois toutes les 2 min (30 min au total). Par défaut, préparer un tampon d’analyse enzymatique (voir Tableau des matériaux) avec 1 mM MgCl2 au pH 7,4. Les protéines fahD variables peuvent nécessiter différents niveaux de cofacteurs ou de pH. Mg2 et Mn 2 sontdes cofacteurs connus pour FAHD13,11,12,21. Créer une solution de protéines de 1 g/L, diluant avec un tampon d’analyse enzymatique (Tableau des matériaux). Mettre en place 1 ml de 20 mM solution d’un substrat à tester (jusqu’à présent les substrats identifiés de protéines FAHD sont répertoriés ailleurs3) dans le tampon d’analyse enzymatique. Selon le schéma de pipetting affiché dans la figure 4A, préparer l’enzyme vierge et les puits d’échantillon: pipet 90 ‘L de tampon d’analyse enzymatique (Tableau des matériaux) dans les puits avec 5 l (5 ‘g) de solution enzymatique. Selon le schéma de pipetage affiché dans la figure 4A, préparer le substrat vide et les puits d’échantillon: pipet 95 ‘L de tampon d’essai enzymatique dans les puits. Juste avant de mesurer, appliquer 5 ll de tampon d’essai enzymatique dans les six puits vierges. Appliquer 5 ll de la solution de substrat de 20 mM sur les puits d’échantillon. Il est recommandé d’utiliser une pipette multicanal. Utilisez une pipette multicanal à des réglages de 50 l pour mélanger délicatement tous les puits. Commencez par les blancs et procédez avec les puits d’échantillon. Veillez à ne pas créer de bulles. Insérez la plaque dans un lecteur de microplaques et mesurez chaque puits à 255 nm (comme indiqué à l’étape 7.1). Effectuez l’analyse dans une feuille de calcul. Copiez les données brutes du photomètre dans une feuille de calcul et écrivez tous les paramètres (c.-à-d. toute la documentation) dans une autre feuille. Moyenne des données des trois puits de chacune des quatre préparations. Soustrayez le blanc de l’échantillon. Calculez également les écarts types et résumez les écarts de blanc et d’échantillon. Tracer ces données (y: densité optique, x: temps en min). Une courbe décroissante de façon exponentielle doit être affichée. Selon le type de substrat utilisé, une augmentation initiale dans les 10 premières minutes peut être observée, après quoi le signal diminue. Ceci est attribué à la tautomerisation céto-enol du substrat, comme décrit plus en détail dans la section de discussion. Divisez les données de signal optique au fil du temps par la valeur maximale de la parcelle, afin de les réduire dans la plage [0, 1] (un exemple est fourni dans la figure 5A). Identifiez la plage linéaire de la courbe, en commençant par la diminution initiale, et calculez la pente négative (1/min). Le cours temporel de la diminution de l’OD est associé au substrat par sa concentration initiale : 100 nmol/puits de pente. En utilisant la concentration de protéines évaluée c0, l’activité spécifique est calculée : 100 nmol/puits de pente à 1/c0. Exprimant c0 en g/puits, l’activité spécifique calculée de cette façon est exprimée à l’aide de l’unité nmol/min/g, qui est égale à l’amol/min/mg. 8. Évaluation de la cinétique Michaelis-Menten des protéines FAHD REMARQUE : L’évaluation de la cinétique Michaelis-Menten des protéines FAHD est fastidieuse, car l’activité protéique spécifique dépend à la fois de la concentration relative de protéines-substrats et du volume physique dans lequel la réaction a lieu. La cinétique à l’état stable doit être établie afin d’obtenir des résultats fiables. Un protocole testé sur une plaque transparente UV de 96 puits est décrit dans les étapes suivantes. Chaque étape doit être effectuée avec beaucoup de soin, car les erreurs mineures gâchent habituellement l’expérience. Il est recommandé de maîtriser les essais décrits à l’article 7 avant de tenter l’analyse plus compliquée décrite ci-dessous. Figure 5 : Résultats exemplaires des analyses d’enzymes.(A) Une courbe exemplaire d’absorption UV obtenue pour les essais de base d’enzymes FAHD à base de substrat (normalisés dans la gamme de 0 à 1) avec déviation standard. Le rapport de densité optique (OD) [OD(t)/OD(0)] à un moment donné t [OD(t)] est normalisé à l’OD initial [t – 0; OD(0)]. Voir la section 7 du protocole pour plus de détails. (B) Cinétique michaelis-Menten exemplaire de la protéine FAHD1 humaine avec déviation standard. Voir la section 8 du protocole pour plus de détails. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Démarrer un lecteur de microplaques et d’équilibrer pendant 30 min à 25 oC. Mettre en place un programme de lecture de 72 puits (tel qu’indiqué à la figure 4B)à 255 nm. Il est recommandé d’utiliser 25 lectures multiples avec un délai de 5 ms. Mettre en place un cycle pour mesurer 15x par 2 min (30 min au total). Effectuer les étapes 7.2 et 7.3. Ensuite, configurez 1 ml de solution de substrat de 100 mM dans un tampon d’essai enzymatique. Préparer les dilutions de la solution de substrat dans un tampon d’essai enzymatique : 40 mM, 20 mm, 10 mm, 6 mm, 4 mm, 2 mm. L’essai est effectué avec des concentrations d’enzymes/substrats en couple (« ajustés »). Pour cela, préparez les dilutions suivantes de la solution enzymatique dans un tampon d’essai enzymatique : 0,5 g/L, 0,4 g/L, 2,5 g/L, 2 g/L, 1,5 g/L, 1 g/L, 1 g/L. Dans tous les puits représentés dans la figure 4B appliquer 180 L de tampon d’essai enzymatique. Appliquer 10 ll de tampon d’essai enzymatique dans tous les puits pour le substrat (blanc et échantillon). Appliquer 10 L de la série de dilution stéinée préparée dans les puits pour l’enzyme (blanc et échantillon). Appliquer 10 ll de tampon d’essai d’enzyme dans tous les puits pour les puits pour le blanc de substrat et le blanc d’enzyme. Juste avant de mesurer, appliquer 10 ll de la série de dilution du substrat préparé dans les puits pour l’échantillon de substrat et l’échantillon d’enzymes. Utilisez une pipette multicanal à des réglages de 50 l pour mélanger délicatement tous les puits, en commençant par les blancs, en procédant aux puits d’échantillon. Veillez à ne pas créer de bulles. Insérez la plaque dans un lecteur de microplaques et mesurez chaque puits à 255 nm, tel que décrit à l’étape 8.1. Effectuez l’analyse dans une feuille de calcul. Copiez les données brutes du photomètre dans une feuille de calcul, écrivez tous les paramètres (c.-à-d. toute la documentation) dans une autre feuille. Effectuer une analyse individuelle des données par point dans la série de dilution, telle qu’elle est décrite dans les étapes 7.11. à 7,14. Finalement, obtenir toutes les activités spécifiques et la parcelle contre la concentration initiale de substrat: 2 mM, 1 mM, 0,5 mM, 0,3 mM, 0,2 mM, 0,1 mM. Afficher tous les points de données avec des écarts types individuels. Informatique Michaelis-Menten cinétique via le montage de courbe non linéaire, ou via l’analyse Lineweaver-Burk. Il peut être nécessaire de remesurer les points individuels et d’adapter les ratios de paires protéines/substrats-concentration individuels dans les étapes 8.5 et 8.6. Le diagramme de Michaelis-Menten pour fahD1 humain est fourni dans la figure 5B. 9. Cristallisation des protéines FAHD REMARQUE : La cristallisation des protéines FAHD (FAHD1 humaine décrite précédemment15) peut être réalisée par la méthode de diffusion de vapeur de chute suspendue dans un format de 24 puits (figure 6A). Un protocole étape par étape sur la cristallisation de fahD1 humain utilisant cette technique est présenté en dessous de15. Une description plus détaillée est fournie dans la section de discussion. Figure 6 : Cristallisation des protéines FAHD.(A) Plaques de cristallisation dans l’empreinte Standard 24 ou 96 puits SBS. Voir la section 9 pour plus de détails. (B) Processus de configuration de la plaque de base dans la cristallisation des protéines FAHD. Ce chiffre est redessiné avec la permission23. Voir la section 9 pour plus de détails. (C) Cristaux FAHD1 humains et motifs de diffraction correspondants (petits inserts). L’espacement de treillis le plus proche est indiqué dans les inserts comme mesure de la qualité de diffraction des cristaux. Des nombres plus faibles indiquent une résolution plus élevée et donc des données plus informatives. Voir la section 9 du protocole pour plus de détails. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Assurez-vous que la protéine est dialysée contre le tampon de fonctionnement SEC. La protéine FAHD1 devrait être disponible à des concentrations élevées (2 à 5 mg/mL). À des concentrations plus faibles, la protéine peut ne pas se cristalliser en raison du manque de nucléation spontanée. Préparer 20 ml de la solution du réservoir pour la cristallisation. Faire trois solutions de stock, en utilisant de l’eau distillée ou déionisée comme solvant : 1 M Na-HEPES (minimum 25 ml, ajusté au pH 7,5), 50 % (w/v) polyéthylène glycol 4000 (PEG4k) (minimum 65 ml) et 1 M MgCl2 (10 ml). Configuration d’une grille de 4 x 6 (24 au total) différents tubes de 15 ml. Étiquetez-les en fonction des positions correspondantes sur la plaque (p. ex., rangée (A, B, C, D) vscolonne (1-6) comme « A1 », « B5 », « D6 », etc. ). Pipette 1 ml de 1 M Na-HEPES dans chaque tube. Pipette 1 ml de 50 % (w/v) PEG4k dans la rangée A des tubes, 2 mL dans la rangée B, 3 ml dans la rangée C, et 4 mL dans la rangée D. Pipette 100 ‘L de 1 M MgCl2 dans la colonne 1 des tubes, 250 ‘L dans la colonne 2 , 500 l dans la colonne 3, 1,0 mL dans la colonne 4, 1,5 ml dans la colonne 5, et 2,0 mL dans la colonne 6. Remplissez tous les tubes jusqu’à un volume de 10 ml d’eau distillée ou déionisée, où l’échelle des tubes est suffisamment précise. Retirez l’échantillon humain de protéines FAHD1 (5 mg/mL) du réfrigérateur (ou de la glace) et faites une rotation à une vitesse maximale avec une centrifugeuse de table à 4 oC pendant au moins 10 min. Si la co-cristallisation avec l’oxalate est souhaitée, ajouter l’oxalate à partir d’une solution de stock de sorte que l’échantillon de protéines contienne une concentration finale d’oxalate de 2 mM. Appliquer 1 mM DTT et conserver sur la glace. Pendant ce temps, déballez une plaque de cristallisation de 24 puits, idéalement à l’intérieur d’une pièce à température contrôlée à 18 oC. Distribuer une fine couche d’huile de paraffine sur la jante sur chaque puits de la plaque de puits 24 à l’aide d’une fine tige de verre ou de plastique. Ajouter 800 l des cocktails de cristallisation préparés (A1 à D6) dans chaque puits correspondant de la plaque de cristallisation. Placer les feuilles de couverture fraîches de 22 mm sur une surface propre. Évitez de contaminer les glissades de couverture avec de la saleté ou de la poussière. Si nécessaire, retirer les débris du couvercle à l’aide d’air comprimé ou d’un vaporisateur de duster. Une fois la centrifugation terminée, évitez de secouer l’échantillon de protéines afin que les agrégats et les débris filés au fond du tube ne flottent plus. Dans les étapes suivantes, pipette de l’échantillon de protéines juste en dessous de la surface de la solution afin d’éviter de remuer les agrégats et les dépôts du fond. Pour chaque puits (voir Figure 6B) pipette 1 -L de solution protéinée sur le centre d’un bordereau de couverture et ajoutez 1 l du cocktail réservoir respectif à la gouttelette de protéines, en évitant les bulles. Tournez le bordereau à l’envers et placez-le sur le dessus du puits de sorte que l’huile scelle le puits avec le couvercle hermétique à l’air. Répéter l’opération jusqu’à ce que la plaque de 24 puits soit terminée. Conserver la plaque à 18 oC et observer les gouttes selon un horaire progressif à l’arme à l’eau avec un microscope approprié. Les cristaux FAHD1 humains apparaissent habituellement du jour au lendemain (voir la figure 6C).