Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Alexander  K. H. Weiss; Max Holzknecht; Elia Cappuccio; Ilaria Dorigatti; Karin Kreidl; Andreas Naschberger; Bernhard Rupp; Hubert Gstach; Pidder Jansen-D&#252;rr

doi:10.3791/59729

JoVE Journal > Biochemistry

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Biochemistry

Expressie, zuivering, kristallisatie, en enzym assays van Fumarylacetoacetate hydrolase domein-bevattende eiwitten

Published: June 20, 2019

doi:

10.3791/59729

Alexander K. H. Weiss^1,2, Max Holzknecht^1,2, Elia Cappuccio^1,2, Ilaria Dorigatti¹, Karin Kreidl¹, Andreas Naschberger³, Bernhard Rupp³, Hubert Gstach⁴, Pidder Jansen-Dürr^1,2

¹Research Institute for Biomedical Aging Research,University of Innsbruck Austria, ²Center for Molecular Biosciences Innsbruck (CMBI),University of Innsbruck Austria, ³Division of Genetic Epidemiology,Medical University of Innsbruck Austria, ⁴Faculty of Chemistry, Department of Organic Chemistry,University of Vienna Austria

Summary

Expressie en zuivering van fumarylacetoacetate hydrolase domein-bevattende eiwitten wordt beschreven met voorbeelden (expressie in E. coli, FPLC). De gezuiverde proteïnen worden gebruikt voor kristallisatie en antilichamenproductie en in dienst genomen voor enzym analyses. De geselecteerde fotometrische analyses worden voorgesteld om de multi-functionaliteit van FAHD1 als Oxaloacetaat decarboxylase en acylpyruvate hydrolase te tonen.

Abstract

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domein-bevattende proteïnen (FAHD) zijn geïdentificeerde leden van de familie FAH in eukaryoten. Enzymen van deze superfamilie over het algemeen weer te geven multi-functionaliteit, waarbij voornamelijk hydrolase en decarboxylase mechanismen. Dit artikel presenteert een reeks opeenvolgende methoden voor de expressie en zuivering van FAHD eiwitten, voornamelijk FAHD Protein 1 (FAHD1) orthologues tussen soorten (mens, muis, nematoden, planten, enz.). De behandelde methodes zijn eiwituitdrukking in E. coli, affiniteitchromatografie, ionen uitwisselings chromatografie, voorbereidende en analytische gel filtratie, kristallisatie, röntgendiffractie, en fotometrische analyses. Geconcentreerd eiwit van hoge zuiverheidsniveaus (> 98%) kan voor kristallisatie of antilichamenproductie worden tewerkgesteld. De proteïnen van gelijkaardige of lagere kwaliteit kunnen in enzym analyses worden tewerkgesteld of als antigenen in opsporingssystemen worden gebruikt (westelijk-vlek, ELISA). In de bespreking van dit werk, worden de geïdentificeerde enzymatische mechanismen van FAHD1 geschetst om zijn hydrolase en decarboxylase BI-functionaliteit in meer detail te beschrijven.

Introduction

De fumarylacetoacetate hydrolase (FAH)¹^,² superfamilie van enzymen beschrijft een groep van enzymen die het aandeel van de zeer behouden katalytische Fah^{domein 3}^,⁴^,⁵^,⁶ ^, ⁷ ^, ⁸ ^, ⁹ ^, ¹⁰. ondanks hun gemeenschappelijke katalytische centrum, zijn deze enzymen multi-functioneel, en de meesten worden gevonden in prokaryoten, waar zij worden gebruikt om samenstellingen te breken die van complexe koolstofbronnen worden teruggewonnen³. Slechts drie leden van deze familie werden geïdentificeerd in eukaryoten tot dusver: de naam die Fah²geeft, evenals Fah domein-bevattende proteïne 1 (FAHD1)¹¹,¹²^,¹³^,¹⁴ ^,¹⁵ en Fah domein-bevattend PROTEÏNE 2 (FAHD2). Uitputting van FAHD1 is geassocieerd met verminderde mitochondriale ademhaling¹³^,¹⁶ en geassocieerd met een omkeerbare type cellulaire senescentie fenotype¹⁴ dat is gekoppeld aan intermediair potentieel tekortkomingen in het elektron transportsysteem. De menselijke FAHD1 en zijn orthologues in modelsystemen (muis, nematode, kankercellen lijnen, installaties, enz.), evenals de geselecteerde varianten van de punt verandering, zijn druggable doelstellingen van potentieel belang geworden. Voor dit onderzoek, recombinant eiwit op hoge niveaus van zuiverheid, alsmede informatie over katalytische mechanismen geleid door kristalstructuren en selectieve antilichamen zijn van vitaal belang.

Dit manuscript beschrijft methodes voor de eiwituitdrukking van FAHD in E. coli, affiniteitchromatografie, ionen uitwisselings chromatografie, de precipitatie van het ammoniumsulfaat, voorbereidende en analytische gel filtratie, kristallisatie, X-straal diffractie, en fotometrische analyses. Het doel van de hier beschreven methoden en protocollen is om richtsnoeren te geven voor wetenschappers die werkzaam zijn op diverse gebieden, zoals Bacteriologie, plantenbiologie, alsmede dierlijke en menselijke studies, om de leden van de FAH superfamilie te karakteriseren, waaronder niet-gekenmerkte Superfamily-leden moeten ze relevant worden in een bepaald gebied. De hier beschreven protocollen kunnen waardevolle ondersteuning bieden voor projecten die gericht zijn op het karakteriseren van andere prokaryote of eukaryote FAH familieleden.

De reden achter de hier beschreven methodes is het feit dat voor karakterisering van slecht beschreven proteïnen (in het bijzonder, metabolische enzymen van onbekende fysiologische relevantie), de benadering om met gezuiverde recombinante proteïnen te beginnen de ontwikkeling van onschatbare, kwalitatief hoogwaardige onderzoeksmethoden, zoals in vitro actieve enzympreparaten, hoogwaardige antilichamen en krachtige en specifieke farmacologische remmers voor geselecteerde enzymen. De beschreven methoden vereisen een snelle eiwit vloeistofchromatografie (FPLC) en X-Ray kristallografie. Alternatieve methoden (bijvoorbeeld om eiwitten te uiten zonder chemische inductie, of om de eiwit zuivering door centrifugeren na warmtebehandeling, gevolgd door ontzouten en grootte uitsluiting chromatografie), kan elders worden gevonden¹⁷. Terwijl een breder spectrum van methoden beschikbaar is voor de expressie en reiniging van Fah superfamilie enzymen²^,⁷^,⁹^,¹⁷^,¹⁸, dit werk richt zich op de expressie en reiniging van FAHD-eiwitten in het bijzonder.

In de besprekings sectie van dit manuscript, worden de katalytische mechanismen die voor het FAHD1 proteïne (hydrolase, decarboxylase)¹⁵ worden geïdentificeerd meer gedetailleerd beschreven om het chemische karakter van de gekatalysete reacties aan te tonen. De gegevens die zijn verkregen op basis van eerdere werkzaamheden⁷^,¹⁵^,¹⁸ (VOB: 6FOG, VOB: 6FOH) impliceren een derde activiteit van het enzym als Keto-Enol isomerase.

Protocol

1. expressie van de FAHD-eiwitten in de bevoegde E. coli Transformatie van E. coli met vectoren voor uitdrukking van FAHD proteïneOpmerking: de stappen die in de volgende sectie worden besproken, worden samengevat in de schets in Figuur 1a, B. Hetzelfde protocol geldt voor elke FAHD-eiwit, met inbegrip van Point-Mutant varianten. Dergelijke varianten kunnen via plaats-geleide mutagenese en PCR technieken19 (zoals DUBBELZIJDIGE Soe PCR20) van wild-type cDNA worden verkregen.Figuur 1 : Versterking van de bevoegde E. coli en inductie van eiwitexpressie.A het inbrengen van de pET -vector in de in punt 1 beschreven BL21 (DE3) pLysS E. coli -bacterie. (B) hitte shock protocol en plating van het huisdier getransformeerd E. coli bacteriën, beschreven in stap 1 van het protocol. De omgezette bacteriën worden geplateerd op pond agar platen met antibiotica voor selectie. (C) versterking van pET -getransformeerde E. coli -bacteriën, beschreven in punt 1. De kolonies worden geplukt van een pond agar plaat en werden versterkt in voedend middel (pond of NZCYM) tot de bacteriële dichtheid de empirische drempel van 0,4 bereikte. D inductie van eiwitexpressie via het DE3-IPTG-pET systeem, beschreven in punt 1 en geschetst in Figuur 2. De eiwitproductie wordt gestart door de toepassing van de chemische IPTG. Aan het eind van sectie 1, wordt de bacteriële korrel die het eiwit bevat geoogst. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Verkrijgen van de bevoegde BL21 (DE3) PLysS E. coli bacteriën en een pET-expressievector (Zie tabel van materialen). Kies bij voorkeur een huisdier vector die ook codeert een N-Terminal zijn-tag of gerelateerde Capture tag voor het gemak van de volgende zuivering stappen te vereenvoudigen. Verkrijg cDNA van de FAHD-proteïne naar keuze en plaats deze in de actieve kloon site van de pET-expressievector, tussen de respectievelijk de tempels promotor en de tempels Terminator. Na succesvolle plasmide versterking en verificatie [via sequencing door een commerciële leverancier (de primer van het huisdier kan met het huisdieren systeem voor gemak worden gebruikt: de promotor van de vooruitgang, voorwaartse Inleiding: TAATACGACTCACTATAGGG; De Begeindiger van de Terminator, omgekeerde Inleiding: GCTAGTTATTGCTCAGCGG)], plaats 5 – 10 ng van plasmide in 100 µ L van bekwame BL21 (DE3) PLysS E. coli bacteriën op ijs. Niet aspireren op en neer, maar een beetje Tik op de buis met om de inhoud te mengen. Houd de bacteriën op ijs voor 30 min, zachtjes te tikken op de buis om de paar minuten. Verwarm een verwarmingsapparaat of een waterbad tot 42 °C (exact). Zet de buis met de bacteriën in het apparaat en bewaar ze voor 90 s (exact). Leg ze onmiddellijk op ijs (Figuur 1a). Na 5 – 10 min op het ijs, voeg 600 µ L van NCZYM medium (Zie tabel van materialen) en zet de buis in een bacterie incubator. Schud de buis op middellange snelheid georiënteerd langs de schuddende richting bij 37 °C voor 1 uur. Plaat 200 µ L van de bacteriële cultuur op een 10 cm LB-agar plaat (Zie de lijst van materialen), die selectie antibiotica van keuze [bijv., een specifiek voor de BL21 (DE3) pLysS resistentie (chlooramfenicol), en een voor de weerstand gecodeerd op de pET -vector (kanamycine of AMPICILLIN, Figuur 1b)]. Cultuur de bacteriën op de LB-agar plaat in een bacteriële incubator bij 37 °C ‘s nachts. Uitdrukking van FAHD proteïnen door IPTG inductieNota: de eerste stappen die in de volgende sectie worden besproken worden samengevat als schets in figuur 1c, D. Het tempels -systeem via de combinatie van het bacteriële DE3 cassette en pET vectorsysteem wordt samengevat in Figuur 2.Figuur 2 : De DE3 cassette/pET vector dual systeem toegelicht.(A) het geschetste genoom van pET vector getransformeerd BL21 (DE3) pLysS E. coli bacteriën. Het inheemse bacteriële genoom draagt een DE3 cassette (zie paneel B), evenals een Lac gen dat constant de eenheden van de repressers van de Lac uitdrukt. De niet-inheemse huisdieren vector draagt het eiwit gen dat tussen a wordt ingevoegd de promotor van de polymerase en de opeenvolging van de Begeindiger. Meer details in paneel B. (b) de DE3 cassette van het inheemse bacteriële genoom codeert de informatie voor de polymerase van operon in termen van een E. coli RNA polymerase. Dit eiwit, echter, wordt niet uitgedrukt omdat de Lac represser eenheid de polymerase proteïne van RNA van het binden verhindert. Vandaar wordt geen de polymerase van tempels uitgedrukt en geen exogene proteïne wordt uitgedrukt. (C) de toepassing van de chemische IPTG (tabel van de materialen) verstoort de structuur van Lac repressers units en voorkomt dat ze binden aan de DE3 cassette. Dientengevolge, kan de polymerase van RNA nu aan de cassette binden, waarvoor de polymerase van tempels wordt uitgedrukt, zoals exogene proteïne uiteindelijk is. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Na succesvolle kolonie formatie, kies een enkele kolonie (zonder satelliet kolonies) en verspreid het in 5 mL van NZCYM of LB medium met antibiotica, geselecteerd als voorheen (stap 1.1.7). Cultuur in de bacteriële incubator bij 37 °C ‘s nachts (figuur 1c). Na een succesvolle bacteriële groei, versterken de bacteriën in 250 mL, 500 mL, of 1 L batches van medium, afhankelijk van de vraag van de eiwit hoeveelheid. Geschikt voor het volume, toe te passen antibiotica geselecteerd zoals gedaan in stap 1.1.7 en voeg ongeveer 1%-2% van de dichte bacteriële pre-cultuur (dat wil zeggen, 2,5-5,0 mL tot 250 mL volume van het medium, enz.). Neem een monster om te worden gebruikt in stap 1.2.5 (1 mL of meer) en controleer de optische dichtheid (OD) op 600 nm. Kweek bacterie in de bacteriële incubator bij 37 °C voor 2 – 3 h (figuur 1c). Teken na 2 – 3 h een steekproef voor fotometrische analyse. Als OD bij 600 nm 0,4 heeft bereikt, ben 200 µ M tot 1 mM van toepassing isopropylalcohol-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG, Zie lijst van materialen).Nota: de daadwerkelijke waarde is empirisch voor elke FAHD proteïne of de variant van de punt verandering, waar 1 mM IPTG het maximum is dat zou moeten worden toegepast. Dit induceert eiwitexpressie (figuur 1d, figuur 2c). Na 3 – 5 meer uren in de bacteriële incubator bij 37 °C, is de eiwituitdrukking uitgeput.Opmerking: Zie de discussie sectie voor opmerkingen over temperatuurregeling. Langer dan 5 uur schudden na inductie wordt niet aanbevolen. Neem een monster voor gebruik in stap 1.2.5 (1 mL of meer) en controleer de optische dichtheid (OD) op 600 nm. Oogst de bacteriële pellet via centrifugeren bij 5.000 x g voor 5 min. Gooi de bovendrijvende weg en bevriezen de pellet bij-80 °c voor langere opslag of-20 °c voor korte opslag (figuur 1d). Controleer de inductie via de twee teruggewonnen fotometrische monsters, die worden geëtiketteerd “-I” (vóór inductie) en “+ I” (na inductie). Na centrifugeren en opnieuw opschorten van de bacteriële korrel, analyseer de twee steekproeven door SDS-pagina door de zelfde hoeveelheid totale proteïne te laden.Opmerking: de “+ I” sample moet een sterke band in verband met het molecuulgewicht van het gekozen eiwit weer te geven, terwijl de “-I” monster mag niet bevatten deze band. Een lage inductie niveau is een veelvoorkomend probleem voor de productie van eiwitten, maar het niveau van de uitgedrukte eiwitten is vaak voldoende voor de volgende stappen. Een hoog inductie niveau is een voordeel, maar is niet verplicht. 2. Lysis van bacteriële pellets en filtratie van puin Afhankelijk van of de gekozen proteïne zijn-geëtiketteerd of untagged is, selecteer ni-transatlantische lopende buffer (zijn-geëtiketteerd, Zie lijst van materialen) of ijskoude hic lopende buffer (untagged). Breng voor elke 250 mL van de originele bacteriële suspensie 5 mL van de geselecteerde buffer aan op de bacteriële pellet (5 mL voor 250 mL, 10 mL voor 500 mL, enz.). Voeg 10 µ L β-mercaptoethanol (β-ME) toe per 5 mL toegepaste buffer. Gebruik een 10 mL Pasteur pipet om de pellet mechanisch te dwingen tot schorsing door te krabben en te pipetteren (luchtbellen vorming te voorkomen tijdens het pipetten). Uiteindelijk de overdracht van alle van de schorsing in 1 50 mL Tube. Bij voorkeur Bewerk (6x voor 15 s op middellange kracht) de vering. Centrifugeer gedurende 30 minuten bij hoge snelheid (10.000 x g) bij 4 °c. Filter de bovendrijvende achtereenvolgens met filtereenheden (bijv. 0,45 µm, 0,22 µm) op ijs.Opmerking: afhankelijk van de vorige centrifugale stap, filtratie rechtstreeks door middel van een kleine filter poriegrootte kan worden vervelend en vereist meestal pre-filtratie door een grotere poriegrootte. DNAse kan worden toegevoegd voor betere resultaten. Sla het monster op ijs en ga onmiddellijk met ofwel sectie 3 of 4, afhankelijk van de vraag of het eiwit is zijn-tag of untagged. 3. reiniging van zijn-gelabelde FAHD eiwitten met ni-transatlantische affiniteitchromatografie Nota: ni2 + ionen zijn verbindend via nitrilotriacetic zuur (de transatlantische) aan een agarose hars die in affiniteitchromatografie wordt gebruikt (immobiled metaalionen chromatografie, iMac, Figuur 3a). Poly-histidine aminozuur Tags binden sterk aan deze ni-chelaat, en zijn-gecodeerde eiwitten kunnen worden gescheiden van de meerderheid van de resterende eiwitten. Een alternatief voor de beschreven voorbereiding van ni-transatlantische kolommen is het gebruik van voorverpakte ni-transatlantische kolommen en een FPLC systeem. Figuur 3 : Geschetste illustraties van gemeenschappelijke types van chromatografie. A de hars van een ni-transatlantische kolom. De transatlantische bevat bivalente nikkel ionen die worden gebruikt in termen van immobilis metaalionen affiniteitchromatografie (IMAC). Poly-histidine Tags binden bij voorkeur aan dit motief en kunnen worden geëlueerd door imidazool. (B) de typische coating van silica deeltjes in een fenyl-based hydrofobe interactie chromatografie (HIC-fenyl). Hydrofobe eiwitten interageren met de coating materiaal en worden vertraagd in hun migratie, terwijl anderen niet. (C) de typische coating van silica deeltjes in Ionische interactie chromatografie. Gepolariseerde en geladen eiwitten interageren met de coating materiaal en worden vertraagd in hun migratie, terwijl anderen niet. (D) de hars van een silica gel in grootte-uitsluiting chromatografie (SEC). Op basis van gedefinieerde poriën in het silica materiaal, kunnen eiwitten worden gescheiden door hun grootte (in een eerste benadering die overeenkomt met hun moleculaire massa). De kleine proteïnen doordringen het poreuze kolom materiaal en zijn achtergebleven, terwijl de grote proteïnen sneller rond de poreuze deeltjes migreren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Ga van stap 2,5 (d.w.z., is het eiwit in ni-transatlantische lopende buffer en gefiltreerd door 0,22 µm filtereenheden op ijs). Bereid een lege plastic of glazen kolom door het wassen van de lege kolom en bevestig deze aan een stabiele provisie. Kies de grootte van de kolom afhankelijk van het volume van de eiwit suspensie. Voor elke 10 mL eiwit suspensie, van toepassing 500 µ L van ni-transatlantische agarose drijfmest in de kolom (schudden zwaar voor gebruik). Breng de drijfmest langzaam en dropwise op de onderste filter van de kolom met behulp van een pipet. Laat de kolom te regelen, die een paar seconden duurt. Vul de kolom volledig met ni-transatlantische lopende buffer, ervoor zorgend om de agarose hars niet te onderbreken. Laat de buffer door de zwaartekracht doorlopen. Het proces kan worden versneld door het toepassen van duim druk op de vloeistof (met behulp van een deksel of handschoen en duim druk), maar zorg ervoor dat de agarose hars niet vervormen. Breng de eiwit suspensie. Als voorheen, laat het monster doorlopen door de zwaartekracht. Het versnellen van deze stap met behulp van duim druk wordt niet aanbevolen, als binding van eiwitten aan de kolom wordt versterkt als het debiet laag is. Het verzamelen van de flow-through in een buis (tabel van materialen). Nadat de steekproef is doorgegeven, vul de gehele kolom opnieuw met ni-transatlantische lopende buffer. Neem zorg om de agarose hars niet te onderbreken. Laat het monster door de zwaartekracht, maar in tegenstelling tot de vorige stap, het versnellen van het proces via duim druk wordt aanbevolen, als potentiële verontreinigingen als gevolg van onspecifieke interacties kan worden verstoord op deze manier. Verzamel de was oplossing in een buis. Herhaal deze stap. Plaats een UV-transparante Cuvette onder de kolom en breng 1 mL ni-transatlantische elutie buffer aan. Verzamel het monster zonder de toepassing van duim druk op de hars. Controleer de optische dichtheid (OD) van de steekproef bij 280 nm versus een leeg monster (d.w.z., ni-transatlantische elutie buffer). Optimaal, het monster geeft een OD van meer dan 2,5. Een OD onder 0,5 duidt erop dat er geen significante hoeveelheid eiwit is in het monster.Opmerking: zoals uiteengezet in de discussie sectie, zout en imidazool concentraties van de elutie buffer kan moeten worden aangepast voor elke FAHD eiwit individueel. Herhaal de stappen 3.1.7 en 3.1.8 tot de OD daalt tot onder 0,5. Pool alle steekproeven met hogere OD in een buis op ijs. Begin opnieuw met stap 3.1.4, gebruikend de stroom-door van stap 3.1.5 als nieuwe input voor deze herhaling van stap 3.1.5. Herhaal dit proces totdat de eerste steekproef verzameld in stap 3.1.6 geeft een OD onder 0,5.Opmerking: zoals uiteengezet in de problemen oplossen deel van de discussie sectie, zijn-gecodeerde eiwitten kunnen onvoldoende binden aan de ni2 +-hars. In dergelijke gevallen, herhaling van deze stap of alternatieve methoden (bijv. ion-uitwisseling chromatografie) nodig zijn. Neem steekproeven van alle tussen fracties voor SDS-pagina analyse. FAHD eiwitten in ni-transatlantische elutie buffer zal neerstorten op het vriespunt en ontdooien. Daarom, dialyze het eiwit tegen een andere buffer (overnachting op ijs, met behulp van 1 µ L van DTT per 100 mL van de dialyse buffer). Gebruik een laag-zout buffer op basis van welk type van Ion-uitwisseling chromatografie moet worden uitgevoerd na deze stap. Gebruik gemeenschappelijke cellulose slang met een typische molecuulgewicht cut-off van 14 kDa (tabel van materialen). Na overnachting dialyse, optioneel concentreren het eiwit met behulp van ultra-Centrifugeer filtereenheden. Voer SDS-pagina analyse uit (12,5% lopend gel, 4% het stapelen gel) om potentieel verlies van proteïne, ontoereikende elutie, en eiwit zuiverheid in het algemeen te controleren. Als alles goed is, ga dan naar paragraaf 5. 4. zuivering van untagged FAHD eiwitten via hydrofobe interaction chromatografie (HIC) Opmerking: fenyl-groepen op de coating oppervlak van een silica gel in een HIC kolom voor FPLC (Figuur 3b) kunnen de scheiding van eiwitten volgens hydrofobe karakter. De beschreven stappen moeten worden uitgevoerd met een FPLC systeem uitgerust met een 5 mL HIC-fenyl kolom. De kolommen kunnen met 1 M NaOH worden gewassen die voor verschillende proteïnen moet worden hergebruikt. Nochtans, zouden de kolommen die eens voor één type van FAHD proteïne worden gebruikt voor slechts dit type van proteïne moeten worden hergebruikt. Het sulfaat van het ammonium (als) precipitatie Ga verder vanaf stap 2,5. De proteïne is binnen ijskoude HIC lopende buffer (lijst van materialen). Beoordeel het volume van de voor bereide eiwitoplossing precies aan de microliter (VInitial). Langzaam en drop-Wise toe te voegen pre-gekoelde HIC lopende buffer als oplossing, tot een 35 volume-% als verzadiging wordt bereikt: Vals toegevoegd = vInitial * 0,538. Roer voorzichtig de oplossing voor 30 min. Centrifugeer gedurende 15 minuten bij hoge snelheid (≥ 10.000 x g) bij 4 °c. Filter de bovendrijvende met behulp van een 0,22 µm filtereenheid op ijs. Naar keuze, neem een steekproef voor SDS-pagina analyse: Verdun 1:4 en de hitte onmiddellijk bij 95 °C voor 5 min of anders het steekproef zal forfaitair. De steekproef kan op dit punt (-20 °C) worden bevroren om een andere dag te werk te gaan. FPLC met behulp van een HIC kolom Stel het FPLC systeem in en equilibrate een 5 ml HIC-fenyl kolom met vijf kolom volumes (CV) van 20% EtOH (in H2o) gevolgd door 5 CV van h2o. Meng 260 mL HIC Running buffer (exact) met 140 mL HIC Running buffer als (exact). Dit resulteert in een 35 volume-% als oplossing. Controleer de pH (7,0); Dit is buffer A. buffer B is 250 mL van de lopende buffer. Voeg 1 mM DTT aan beide buffers A en B, dan houd ze op ijs. Equilibrate de kolom met 8 ml buffer A, 8 mL buffer B en 8 mL buffer A in deze volgorde. Toepassing van het monster bereid in Protocol stap 4,1. Was met buffer A, tot de baseline optische absorptie op 280 nm bereikt 1000-500 mAU. Breng een mengsel van buffers A en B, zodat de concentratie van AS is 33% (w/v). Was met 1 CV, wat resulteert in een plateau in de chromatogram. Stel een gradiënt van buffer B (tot 100% buffer B in de tijd): 1,5 mL buffer B in 3,8 min (dat wil zeggen, 5,7% buffer B met 1% B/mL helling). Wanneer het UV-signaal op 280 nm stijgt, start het verzamelen van de Fractie en plaats deze onmiddellijk op ijs. In het einde, was de kolom met buffer B. Neem steekproeven van alle fracties voor SDS-pagina analyse. Bevriezen alle monsters met behulp van vloeibare stikstof, en bewaar ze op-80 ° c. Voer SDS-pagina (en westelijke vlek) analyse uit, om de FAHD proteïne in de verzamelde fracties te ontdekken. Fracties die het eiwit bevatten worden gebundeld en toegepast op verdere zuivering, zoals uiteengezet in de volgende protocol stappen. Was de kolom met H2o en 20% EtOH (in h2o). 5. reiniging van FAHD proteïnen via ionen uitwisselings chromatografie Opmerking: moleculen met geladen functionele groepen zijn gebonden aan een silica deeltjes kolom voor FPLC (figuur 3c). Dit maakt de differentiatie van eiwitten op basis van hun Ionische karakter, zoals de oppervlakte lading. De beschreven stappen moeten worden uitgevoerd met een FPLC machine en bijbehorende knowhow, respectievelijk. De beschreven methode is het zelfde voor of kationische of anionische uitwisselings chromatografie, maar de te gebruiken buffers zijn lichtjes verschillend. Koos de kationische of anionische uitwisseling chromatografie systeem. Deze keuze is empirisch en kan variëren tussen FAHD eiwitten. Optimaal kunnen beide methoden achtereenvolgens worden gebruikt. Opstelling het FPLC systeem en was de kolom met 5 CV van 20% EtOH (in H2o), gevolgd door 5 CV van h2o. Equilibrate de kolom met 1 CV van laag-zout buffer, hoog-zout buffer, en opnieuw laag-zout buffer in deze opeenvolging. Breng het monster (dialyzed tegen de juiste laag zout buffer van stap 3.1.11) op de kolom. Het verzamelen van de flow-through. Was de kolom voor 1 CV met een lage zout buffer. Opstelling een gradiënt elutie: 100% hoog-zout buffer in 30 min bij een stroomtarief van 1 mL/min, of 60 min bij een stroomtarief van 0,5 mL/min. Dit kan opnieuw worden geselecteerd op basis van een reeds bekende FPLC chromatogram, om de zuivering te optimaliseren. Verzamel alle piek fracties.Opmerking: hoog-zout voorwaarden kunnen variëren tussen FAHD eiwitten, zoals uiteengezet in de discussie sectie. Na het verloop is voltooid, lopen met een hoog-zout buffer totdat er geen pieken worden gedetecteerd over het bereik van 1 CV (het verzamelen van de fracties). Neem monsters van alle verzamelde fracties en uit te voeren SDS-pagina-analyse (12,5% running gel, 4% stapelen gel). Bevriezen van de individuele monsters in vloeibare stikstof en bewaar ze op-80 ° c. Na SDS-pagina analyse is voltooid, pool de monsters met de FAHD-eiwit en gooi de anderen. Optioneel, concentraat het eiwit met behulp van ultra-Centrifugeer filtereenheden. Breng 1 mL van 25% SDS in 0,5 M NaOH (of andere detergenten) aan om de kolom te reinigen. Was de kolom met H2o en 20% EtOH (in h2o). Optioneel, herhaal sectie 5 met de alternatieve kolom (kationische of anionische uitwisseling chromatografie). Het eiwit dat van deze methode wordt verkregen is voldoende zuiver om basisactiviteiten analyses uit te voeren of kan in onderzoek analyses voor kristallografie worden gebruikt. Voor geavanceerde toepassingen gaat u verder met sectie 6. 6. reiniging van FAHD eiwitten via maat-uitsluiting chromatografie (SEC) Opmerking: poreuze deeltjes in een silica gel kolom voor FPLC kunnen de differentiatie van eiwitten volgens de moleculaire grootte, zoals hydrodynamica RADIUS (figuur 3D). De beschreven stappen moeten worden uitgevoerd met een FPLC systeem, met behulp van SEC kolommen. Kies een SEC kolom, afhankelijk van de moleculaire gewichten van de nog aanwezige verontreinigingen, zoals gedetecteerd via SDS-pagina en zilver kleuring. De geschetste methode is geschikt voor beide kolommen. Was de kolom ‘s nachts met 400 mL H2O en EQUILIBRATE met SEC Running buffer. Het wordt aanbevolen om een programma te schrijven voor het FPLC systeem om deze stap te automatiseren. Voeg 1 mM DTT tot 300 mL van de SEC lopen buffer en zet het op ijs. Dit is de running buffer. Pas 60 mL van deze buffer toe op de kolom. Centrifugeer de eiwitSteekproef (10.000 x g voor 10 min) om om het even welke micro-precipitatie te verwijderen. De bovendrijvende toepassen op de kolom. Het wordt over het algemeen geadviseerd om de bovendrijvende vóór FPLC te filtreren. Breng de running buffer op de kolom totdat alle eiwitten is geëlueerd. Verzamel alle pieken in fracties van geschikt volume (bijv. 2 mL). Neem monsters voor SDS-pagina en bevriezen alle fracties met behulp van vloeibare stikstof. Bewaar de bevroren fracties bij-80 °C. Na SDS-pagina (en westelijke vlek) analyse, verzamel en bundel alle fracties die de FAHD proteïne bevatten. Zilver kleuring wordt aanbevolen om kleine verontreinigingen die nog aanwezig kunnen zijn op te sporen. Gebruik Ultra-Centrifugeer filtereenheden om het eiwit te concentreren. Hoewel niet verplicht voor FAHD eiwitten, in het algemeen een ontzouten stap (bijv. door dialyse) wordt aanbevolen voor enzym assays en kristallisatie. Herhaal de stappen 6.3-6.6 meerdere malen met verschillende debieten en zoutconcentraties (empirisch) om de zuiverheid van de FAHD-eiwit te verbeteren. Was de kolom ‘s nachts met H2o en 20% EtOH (in h2o). 7. Basic FAHD activiteit assays met substraten Oxaloacetaat en acetylpyruvate Opmerking: FAHD Protein 1 (FAHD1) geeft Oxaloacetaat decarboxylase (ODx) en acylpyruvate hydrolase (ApH) activiteit. Dit is meer in detail uiteengezet in de discussie sectie. Wegens destabilisatie door Keto-Enol tautomerization in waterige oplossing (d.w.z., enolization), vervalt Oxaloacetaat door zich na tijd (auto-decarboxylatie) als functie van cofactors concentratie en pH. Rond een pH van 7 en temperatuur van 25 °C, is dit effect niet dramatisch, maar de analyses moeten om voor zowel auto-decarboxylatie als enzym concentratie worden blanked te verantwoorden. Het pipetten schema wordt beschreven in figuur 4a. In het algemeen is het raadzaam om goed gekalibreerde pipetten te gebruiken voor deze test, omdat het vrij gevoelig is voor kleine Pipetting fouten. Figuur 4 : Geschetste pipetten regeling voor enzym assays. A een geschetste pipetten regeling voor basis substraat-gebaseerde FAHD eiwit enzym assays. Substraat leeg:-S/-E; de steekproef van het substraat: + S/-E; enzym leeg:-S/+ E; de steekproef van het enzym: + S/+ E (S: substraat, E: enzym). Zie Protocol stap 7 voor meer informatie. (B) een geschetste pipetten regeling voor de beoordeling van Michaelis-Menten KINETIEK van FAHD-eiwit. Substraat leeg:-S/-E; de steekproef van het substraat: + S/-E; enzym leeg:-S/+ E; de steekproef van het enzym: + S/+ E (S: substraat, E: enzym). Zie paragraaf 8 van het protocol voor meer informatie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Start een Microplate lezer en equilibrate voor 30 min bij 25 °C. Opstelling een programma voor het lezen van 12 putten (zoals beschreven in figuur 4a) bij 255 nm. Het wordt aanbevolen om 25 meerdere uitlezingen te gebruiken met 5 MS time delay. Opstelling een cyclus om 15x elke 2 min (30 min totaal) te meten. Maak standaard een enzym assay buffer (zie tabel met materialen) met 1 mm MgCl2 bij pH 7,4. De variant FAHD proteïnen kan verschillende cofactors of pH niveaus vereisen. Mg2 + en MN2 + zijn bekende cofactors voor FAHD13,11,12,21. Maak een 1 µ g/µ L eiwitoplossing, verdunnen met enzym assay buffer (tabel van materialen). Opstelling 1 mL 20 mM oplossing van een te testen substraat (tot dusver geïdentificeerde substraten van de proteïnen van FAHD zijn elders vermeld3) in de buffer van de enzym analyse. Volgens het Pipetting schema dat in figuur 4awordt weergegeven, bereidt u het enzym leeg en de monster putten: pipet 90 µ l van de buffer van de enzym analyse (lijst van materialen) in de putten met 5 µ l (5 µ g) van enzym oplossing. Volgens het Pipetting schema weergegeven in figuur 4a, bereid het substraat leeg en monster Wells: pipet 95 µ l van enzym assay buffer in de putten. Vlak voor het meten, toepassen 5 µ L van enzym assay buffer in de zes lege putten. Breng 5 µ L van de 20 mM substraat oplossing aan de monster putten. Het wordt aanbevolen om een multichannel pipet te gebruiken. Gebruik een multichannel pipet bij 50 µ L instellingen om alle putten zachtjes te mengen. Begin met de blanks en ga verder met de monster putten. Zorg ervoor dat u geen bubbels te maken. Plaats de plaat in een Microplate lezer en meet elk goed bij 255 nm (zoals beschreven in stap 7,1). Voer de analyse uit in een spreadsheet. Kopieer de ruwe gegevens van de fotometer in een spreadsheet, en schrijf alle instellingen (dwz alle documentatie) in een ander vel. Gemiddelde van de gegevens van de drie putten van elk van de vier preparaten. Aftrekken van de blanco uit het monster. Bereken ook standaardafwijkingen en som de afwijkingen van spatie en steekproef. Plot deze gegevens (y: optische dichtheid, x: tijd in min). Een exponentieel afnemende kromme moet worden weergegeven. Afhankelijk van het soort substraat in gebruik, kan een eerste verhoging binnen de eerste 10 min worden waargenomen, waarna het signaal afneemt. Dit wordt toegeschreven aan de Keto-Enol tautomerization van het substraat, zoals uiteengezet in meer detail in de discussie sectie. Verdeel de optische signaal gegevens over tijd door de maximumwaarde van het perceel om de gegevens in de waaier [0.1] te schalen (een voorbeeld wordt verstrekt in figuur 5a). Identificeer het lineaire bereik van de kromme, beginnend bij de aanvankelijke daling, en bereken de negatieve helling (1/min). De tijdsverloop van de afname in OD wordt geassocieerd met het substraat via de initiële concentratie: 100 nmol/well * Slope. Gebruikend de geschatte eiwitconcentratie c0, wordt de specifieke activiteitgegevens verwerkt: 100 nmol/well * helling * 1/c0. Uitdrukken van c0 in µ g/Nou, de specifieke activiteit berekend op deze manier wordt uitgedrukt met behulp van de eenheid nmol/min/µ g, die gelijk is aan µmol/min/mg. 8. evaluatie van Michaelis-Menten kinetiek van FAHD-eiwitten Nota: het beoordelen van Michaelis-Menten kinetica van FAHD proteïnen is vervelend, aangezien de specifieke eiwit activiteit van zowel de relatieve proteïne-substraatconcentratie als fysiek volume afhankelijk is waarin de reactie plaatsvindt. De steady-state kinetiek moet worden vastgesteld om betrouwbare resultaten te behalen. Een getest protocol op een 96 goed UV-transparante plaat wordt beschreven in de volgende stappen. Elke stap moet worden uitgevoerd met grote zorg, als kleine fouten meestal bederven het experiment. Het wordt aanbevolen de in sectie 7 beschreven analysen te beheersen alvorens de meer gecompliceerde analyse te proberen. Figuur 5 : Voorbeeldige resultaten van enzym analyses.(A) een voorbeeldige UV-absorptie curve verkregen voor basis substraat-gebaseerde FAHD eiwit enzym assays (genormaliseerd in het bereik van 0 tot 1) met standaarddeviatie. De optische dichtheid (OD) verhouding [OD (t)/OD (0)] op een gegeven moment t [OD (t)] is genormaliseerd naar de eerste OD [t = 0; OD (0)]. Zie paragraaf 7 van het protocol voor meer informatie. (B) voorbeeldige Michaelis-Menten kinetiek van het humaan FAHD1 eiwit met standaarddeviatie. Zie paragraaf 8 van het protocol voor meer informatie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Start een Microplate lezer en equilibrate voor 30 min bij 25 °C. Het opzetten van een programma voor het lezen van 72 Wells (zoals beschreven in figuur 4b) op 255 nm. Het wordt aanbevolen om 25 meerdere uitlezingen te gebruiken met een 5 MS tijdvertraging. Stel een cyclus te meten 15x elke 2 min (30 min totaal). Voer de stappen 7,2 en 7,3 uit. Dan, opstelling 1 mL van 100 mM substraat oplossing in de buffer van de enzym analyse. Bereid verdunningen van de substraat oplossing in de buffer van de enzym analyse: 40 mM, 20 mM, 10 mM, 6 mM, 4 mM, 2 mM. De assay wordt uitgevoerd met paarsgewijs (“aangepast”) enzym/substraatconcentraties. Voor dit, bereid de volgende verdunningen van de enzym oplossing in de buffer van de enzym analyse voor: 0,5 µ g/µ L, 0,4 µ g/µ L, 2,5 µ g/µ L, 2 µ g/µ L, 1,5 µ g/µ l, 1 µ g/µ l. In alle putten afgebeeld in figuur 4b van toepassing 180 µ l van enzym assay buffer. Breng 10 µ L van de buffer van de enzym analyse in alle putten voor het substraat (spatie en steekproef) toe. Breng 10 µ L van de voor bereide eiwit verdunning serie in de putten voor het enzym (blanco en monster). Breng 10 µ L van de buffer van de enzym analyse in alle putten voor putten voor de substraat leeg en het enzym leeg. Vlak voor het meten, breng 10 µ L van de voor bereide substraat verdunningsreeks in de putten voor het substraat monster en het enzym monster. Gebruik een multichannel pipet op 50 µ L instellingen om voorzichtig te mengen alle putten, te beginnen met de spaties, te gaan naar de monster putten. Zorg ervoor dat u geen bubbels te maken. Plaats de plaat in een Microplate lezer en meet elk goed bij 255 nm, zoals beschreven in stap 8,1. Voer de analyse uit in een spreadsheet. Kopieer de ruwe gegevens van de fotometer in een spreadsheet, schrijf alle instellingen (dwz alle documentatie) in een ander vel. Voer afzonderlijke gegevensanalyse per punt uit in de verdunningsreeks zoals beschreven in stap 7,11. tot 7,14. Haal uiteindelijk alle specifieke activiteiten en plot tegen de initiële substraatconcentratie: 2 mM, 1 mM, 0,5 mM, 0,3 mM, 0,2 mM, 0,1 mM. Alle gegevenspunten weergeven met afzonderlijke standaarddeviaties. Computer Michaelis-Menten kinetica via niet-lineaire kromme montage, of via Lineweaver-Burk analyse. Het kan nodig zijn om individuele punten te hermeten en individuele eiwitten-concentratie/substraat-concentratie paar verhoudingen aan te passen in de stappen 8,5 en 8,6. Het Michaelis-Menten schema voor menselijke FAHD1 is voorzien in Figuur 5b. 9. kristallisatie van FAHD proteïnen Opmerking: kristallisatie van FAHD eiwitten (menselijke FAHD1 beschreven eerder15) kan worden bereikt door de opknoping druppel damp diffusie methode in een 24 goed formaat (Figuur 6a). Een stap-voor-stap protocol over kristallisatie van de menselijke FAHD1 met behulp van deze techniek wordt gepresenteerd onder de15. Een meer gedetailleerde beschrijving vindt u in de discussie sectie. Figuur 6 : Kristallisatie van FAHD eiwitten.(A) kristallisatie platen in standaard 24 goed of 96 goed SBS footprint. Zie hoofdstuk 9 voor meer informatie. (B) de basisplaat Setup proces in kristallisatie van FAHD eiwitten. Dit cijfer wordt opnieuw getekend met toestemming23. Zie hoofdstuk 9 voor meer informatie. (C) menselijke FAHD1 kristallen en overeenkomstige diffractiepatronen (kleine inserts). De dichtste rooster afstand wordt vermeld in de tussenvoegsels als maatregel voor diffractie kwaliteit van de kristallen. De lagere aantallen wijzen op hogere resolutie en zo meer informatieve gegevens. Zie paragraaf 9 van het protocol voor meer informatie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Zorg ervoor dat het eiwit is dialyzed tegen SEC Running buffer. Het FAHD1-eiwit moet beschikbaar zijn bij hoge concentraties (2 – 5 mg/mL). Bij lagere concentraties, kan het eiwit niet kristalliseren wegens gebrek aan spontane nucleatie. Bereid ≥ 20 mL van de reservoir oplossing voor kristallisatie. Maak drie stockoplossingen, het gebruik van gedistilleerd of deioniseerd water als oplosmiddel: 1 M na-HEPES (minimum 25 mL, aangepast aan de pH 7,5), 50% (w/v) polyethyleenglycol 4000 (PEG4k) (minimaal 65 mL), en 1 M MgCl2 (10 ml). Opstelling een rooster van 4 x 6 (24 totaal) verschillende 15 mL buizen. Label ze volgens de overeenkomstige posities op de plaat (bijv. rij (A, B, C, D) versus kolom (1 – 6) zoals “a1”, “B5”, “D6”, enz.). Pipetteer 1 mL van 1 M na-HEPES in elke buis. Pipetteer 1 mL van 50% (w/v) PEG4k in rij A van de buizen, 2 mL in rij B, 3 mL in rij C en 4 mL in rij D. Pipet 100 µ L van 1 M MgCl2 in kolom 1 van de buizen, 250 µ l in kolom 2 , 500 µ L in kolom 3, 1,0 mL in kolom 4, 1,5 mL in kolom 5, en 2,0 mL in kolom 6. Vul alle buizen tot een volume van 10 mL met gedistilleerd of deioniseerd water, waar de schaal op de buizen voldoende nauwkeurig is. Neem de menselijke FAHD1 eiwit monster (~ 5 mg/mL) uit de koelkast (of van ijs) en spin down op maximale snelheid met een tafelblad centrifuge bij 4 ° c gedurende ten minste 10 min. Als co-kristallisatie met oxalaat gewenst is, voeg dan oxalaat van een voorraadoplossing toe, zodat het eiwit monster een laatste oxalaat concentratie van 2 mM bevat. Breng 1 mM DTT en op te slaan op het ijs. In de tussentijd, pak een 24 goed kristallisatie plaat, idealiter binnen een temperatuur gecontroleerde kamer bij 18 ° c. Distribueer een dun laagje paraffineolie op de velg op de top van elke put van de 24 goed plaat met de hulp van een dun glas of plastic staaf. Voeg 800 µ L van de voor bereide kristallisatie cocktails (a1 tot D6) toe aan elke corresponderende put van de kristallisatie plaat. Plaats verse 22 mm-dekglaasjes op een schoon oppervlak. Vermijd het vervuilen van het deksel glijdt met vuil of stof. Verwijder indien nodig alle resten van de cover slip met perslucht of een stofzuiger spray. Na centrifugeren is voltooid, voorkomen dat het eiwit monster te schudden, zodat de gesponnen-down aggregaten en puin aan de onderkant van de buis niet weer zweven. In de volgende stappen, Pipetteer van het eiwit monster net onder het oppervlak van de oplossing om te voorkomen dat roeren tot aggregaten en deposito’s van de bodem. Voor elk goed (Zie Figuur 6b) Pipetteer 1 µ l eiwitoplossing op het middelpunt van een Afdekstrook en voeg 1 µ l van de respectieve reservoir cocktail toe aan het eiwit druppeltje, om bubbels te vermijden. Draai de dekglaasje ondersteboven en plaats deze op de top van de put, zodat de olie zeehonden de put met de dekglaasje luchtdicht. Herhaal dit totdat de 24 goed plaat is voltooid. Bewaar de plaat bij 18 °C en observeer de druppels op een progressief schema met een goede Microscoop. Menselijke FAHD1 kristallen verschijnen meestal ‘s nachts (Zie figuur 6C).

Representative Results

Beginnend met een voor bereide het klonen vector en gekochte BL21 (DE3) PLysS E. coli, wordt de plasmide opgenomen in de bacteriën via hitte-schok of om het even welke aangewezen alternatieve methode (Figuur 1). Na een korte periode van versterking, zijn de omgezette bacteriën geplateerd op LB agar platen, om te groeien ‘s nachts. Platen op dit punt kan er anders uitzien, afhankelijk van een verscheidenheid van mogelijke foutbronnen. Platen kunnen leeg zijn (dat wil zeggen, geen kolonies), volledig overwoekerd door bacteriën, of iets tussen, respectievelijk. Twee voorbeelden van LB agar platen na optimale en niet-optimale transformatie zijn afgebeeld in figuur 7A. Te veel bacteriële kolonies geven ofwel dat er te veel bacteriën werden verzilverd (waarschijnlijk) of dat de antibiotica in gebruik kan worden verstreken (onwaarschijnlijk). Te weinig bacteriële kolonies kan erop wijzen dat ofwel niet genoeg plasmide werd gebruikt voor de transformatie (gebruik meer de volgende keer) of dat er te veel antibiotica werden gebruikt om de bacteriën te selecteren. In ieder geval, als kolonies aanwezig zijn, moeten ze wel goed, zoals het gebruik van twee selectieve antibiotica impliceert een vrij onbeduidende kans van ongetransformeerde bacteriën om te groeien. Geen kolonies bij allen, echter, wijst erop dat of de bacteriën hun transformatie bekwaamheid (wegens verkeerde opslag of opslag over langere periodes, herhaalde vorst en dooi, enz.) verloren, de hitte-schok niet succesvol was (geen opname van de plasmide of bacteriële dood door teveel hitte), is de het klonen vector bedorven, of door fout een verkeerde reeks selectieve antibiotica werd gebruikt (Controleer het weerstands gen op de plasmide vector). Figuur 7 : Representatieve resultaten voor bacteriën transformatie en iMac.(A) representatieve lb agar platen met getransformeerde BL21 (DE3) E. coli, verkregen door het volgen van protocol stap 1,1. Links: een bord met goed verdeelde kolonies (positief voorbeeld). Rechts: een bord met slechts een enkele kolonie (negatief voorbeeld). Witte cirkels markeren goede kolonies. De rode cirkel markeert kolonies die groeien te dicht bij elkaar en mag niet worden geplukt zolang geïsoleerde kolonies beschikbaar zijn. (B) een 12,5% acrylamide sds-pagina analyse van een reeks inductie controles (“-” wijst vóór IPTG inductie aan; “+” geeft aan na IPTG inductie, vóór pellet oogst), aangepast aan gelijke hoeveelheden van het totale eiwit. Dit wordt beschreven in stap 1,2. (C) een voorbeeldige 12,5% acrylamide sds-pagina analyse van ni-transatlantische zuivering van zijn-geëtiketteerde FAHD1 proteïne. Dit wordt beschreven in paragraaf 3 van het protocol. De affiniteitchromatografie levert proteïne van hoge zuiverheid (> 70%, zwarte pijl), echter, worden verscheidene kleine verontreinigingen ook waargenomen (rode pijlen). Deze verontreinigingen bestaan uit niet-FAHD eiwitten die binden aan de kolom, en van eiwitten die binden aan de FAHD-eiwit. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Gevalideerde kolonies worden geselecteerd en geplukt. Na versterking in voedend middel, wordt de eiwituitdrukking teweeggebracht door toepassing van chemische IPTG. De bacteriële pellet met de uitgedrukte eiwitten in milligram hoeveelheden wordt geoogst, en de expressie wordt geverifieerd via SDS-pagina (zie bijvoorbeeld figuur 7b). Sommige problemen kunnen optreden tijdens dit anders eenvoudige proces. Ten eerste, sommige eiwitten vormen inclusie lichamen, omdat ze blijkbaar een of andere manier interfereren met de natuurlijke stofwisseling van de gastheer bacteriën. Dit werd waargenomen voor sommige punt veranderingen van menselijke FAHD1 en FAHD2. In dergelijke gevallen, andere expressie systemen zoals insecten cellen kunnen meer geschikt en moet worden overwogen. Na het oogsten van een pellet uit insecten cellen, bijvoorbeeld, de zuivering van de eiwitten volgt dezelfde stappen als beschreven in dit protocol. Ten tweede, wordt het DE3-huisdieren systeem soms gevonden om “lekkend” te zijn (d.w.z., wordt het eiwit reeds uitgedrukt in zekere mate vóór IPTG inductie). De mogelijke reden hiervoor is niet goed begrepen, maar het kan helpen om het eiwit langzaam ‘s nachts uitdrukken in een koude ruimte incubator. Ten derde wordt geen proteïne uitgedrukt. Dit is waarschijnlijk het slechtst-geval scenario, aangezien het waarschijnlijk een bedorven plasmide vector en zo raadzaam aan opeenvolging de plasmide wijst. Als een his-tag werd gebruikt om het eiwit tag, affiniteitchromatografie met ni-transatlantische agarose is een gemakkelijke en goedkope Capture methode elimineren van de meerderheid van de verontreinigingen (figuur 7C). Soortgelijke methoden bestaan voor andere tag-systemen (bijvoorbeeld, keelontsteking-II). Als geen markering werd gebruikt, kan een combinatie van de precipitatie van het ammoniumsulfaat en opeenvolgende hydrofobe uitwisselings chromatografie ook het eiwit van de meerderheid van andere proteïnen scheiden (figuur 8a). Echter, het vergelijken van de twee methoden (figuur 7C versus figuur 8a), de superioriteit van de ni-transatlantische methoden kan worden aangetoond door SDS-pagina analyse. Met behulp van zijn-gelabelde eiwitten is daarom geadviseerd. Figuur 8 : Representatieve resultaten voor FPLC experimenten (HIC, Ion Exchange, SEC).(A) een typische chromatogram en 12,5% acrylamide sds-pagina analyse van hic-fenyl chromatografie na ammoniumsulfaat (als) precipitatie van untagged FAHD1 proteïne, zoals beschreven in punt 4 van het protocol. De groene lijn weerspiegelt de gradiënt van de buffer B die niet bevat als. Tijdens het proces zoals geleidelijk wordt uitgewassen uit het systeem. Vergelijking van dit paneel om figuur 7C geeft de kracht van ni-transatlantische affiniteitchromatografie in vergelijking met de HIC-fenyl methode, en het voordeel van het gebruik van een his-tag systeem voor eiwit zuivering. (B) een voorbeeldige chromatogram en 12,5% acrylamide sds-pagina analyse van kationische uitwisselings chromatografie van zijn-geëtiketteerde FAHD na ni-transatlantische reiniging. Met behulp van een zout gradiënt, is de toegepaste steekproef gescheiden in individuele eiwitten. (C) een voorbeeldige chromatogram en 12,5% acrylamide sds-pagina analyse van G75 grootte uitsluitings chromatografie van zijn-geëtiketteerde FAHD na kationische uitwisselings chromatografie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Achtereenvolgens, het eiwit is verder gescheiden van overgebleven verontreinigingen door kation/anion uitwisseling chromatografie (bijvoorbeeld, Zie figuur8 b), gevolgd door grootte-uitsluiting chromatografie (bijvoorbeeld, Zie figuur8 c). Het is aangeraden om in deze volgorde een initiële reinigings strategie in te stellen; echter, deze kolommen moeten worden gebruikt in combinatie, vervolgens en in variatie, totdat het eiwit is voldoende zuiver. Eenvoudige activiteit assays, om te testen op “Ja of nee” beslissingen over actieve substraten en/of cofactoren, kan worden uitgevoerd met zijn-gelabelde eiwitten na ni-transatlantische zuivering, of niet-gecodeerde eiwitten na de Ionische uitwisseling kolom. Specifieke activiteiten en kinetische constanten moeten worden bepaald met eiwit van de hoogste zuiverheid. Kristallisatie kan met proteïnen na de Ionische uitwisselings kolom worden geprobeerd, maar de kwaliteit van kristallen correleert bijna altijd met eiwit zuiverheid. Polyclonale antilichamen kunnen in elke fase van het zuiverings Protocol tegen eiwitten worden verhoogd; Nochtans, hier correleert de kwaliteit ook met de eiwit zuiverheid.

Discussion

Kritieke stappen

FAHD eiwitten zijn zeer gevoelig voor zoutconcentraties. Bij lage NaCl concentraties, kunnen de eiwitten neerslag bij het ontdooien, maar ze kunnen meestal volledig worden hervormd bij hogere zoutconcentraties. Dat is, als een FAHD eiwit precipitaten om wat voor reden, kan worden teruggewonnen of hervouwen met hogere zoutconcentraties (> 300 µ M). Sommige meer hydrofobe proteïnen, echter, kunnen niet worden teruggekregen (bijvoorbeeld, menselijke FAHD2), maar detergentia zoals CHAPs (maximum 1%) of glycerol (10%) kan worden gebruikt om hen in stabiele oplossing te houden. In elk geval, wordt het schok-bevriezen gebruikend vloeibare stikstof en opslag bij-80 °C geadviseerd, aangezien het een zacht en langzaam proces van het ontdooien is.

Sommige onverwachte problemen kunnen optreden tijdens de ni-transatlantische zuivering in stap 3.1.10. Van nota, wijst een hogere OD in de tweede verzamelde steekproef dan in de eerste steekproef op een te hoog volume van de agarose hars (neem een nota en gebruik minder hars in het volgende experiment). Ook, leidt de agarose hars zelf tot een OD signaal bij 280 nm (d.w.z., zal de verstoring van het agarose hars bed kunstmatige signalen geven). In geval van twijfel, is het aangeraden om andere methoden te gebruiken, zoals een Bradford of BSA assay om eiwit concentraties te bepalen.

In enzymatische analyses, zijn er drie kritieke aspecten om worden overwogen. Ten eerste is de beoordeling van de eiwitconcentratie van cruciaal belang voor het verkrijgen van de juiste specifieke activiteiten. Het niveau van de zuiverheid van het eiwit is het beïnvloeden van het resultaat en moet worden geschat. In het geval van gelabelde eiwitten, de massa van de tag-deel moet worden berekend, en de specifieke activiteit moet dienovereenkomstig worden gecorrigeerd. Voor eenvoudige assays zoals beschreven in paragraaf 7 van het protocol is ni-transatlantische zuiverheid voldoende om onderscheid te maken tussen actieve en inactieve substraten, cofactoren, enz. In het geval van meer complexe Michaelis-Menten kinetiek, moeten alle reactie-en substraatconcentraties correct worden bepaald. Vooral bij het gebruik van Oxaloacetaat (die auto-decarboxylates loop van de tijd) het enzymatische deel van de reactie moet worden gecorrigeerd voor auto-decarboxylatie (in de veronderstelling dat beide reacties gelijktijdig optreden). De aanvankelijke veranderingen in het optische dichtheids signaal gericht aan Keto-Enol tautomerization van het substraat moeten worden overwogen. Ten derde moeten concentraties en volumes worden aangepast. Een reactie met bepaalde concentraties van enzym en substraat kan verschillende resultaten afhankelijk van het analyse volume geven. Als er te veel enzym per goed, adhesie van de vloeistof kan in feite bias het resultaat.

Voor de beoordeling van Michaelis-Menten kinetica wordt aanbevolen om de eerste experimenten uit te voeren in 100 µ L, 200 µ L, en 300 µ L batches om de optimale combinatie te vinden. De gelijkaardige aspecten zijn op de verhouding van enzym-substraatconcentraties voor kinetische analyses van toepassing. Te veel enzym per substraat of te veel substraat per enzym zet het systeem buiten de lineaire steady-state Michaelis bereik. Eerste experimenten zijn nodig om deze voorwaarden te optimaliseren. De voorbeeldige aanpassing voor humaan FAHD1 (wild-type) proteïnen wordt verstrekt in sectie 8, resulterend in kinetische diagrammen (zoals voorgesteld in Figuur 5b, bijvoorbeeld).

Voor kristallisatie wordt een druppel eiwitoplossing in het midden van een dekglaasje gepipetteerd en gemengd met een druppel kristallisatie cocktail, die meestal bestaat uit een buffer (bijv. tris-HCl, HEPES) en een precipitant (bijv. Polyethyleenglycol, ammonium sulfaat). Een druppel van inhibitor oplossing voor co-kristallisatie (zoals oxalaat in dit Protocol) kan naar keuze worden toegepast. De dekglaasje wordt dan geplaatst ondersteboven boven een put van reservoir met kristallisatie cocktail, afdichting van de put luchtdicht met de hulp van Sealant olie (Figuur 6b). Idealiter, geen neerslag optreedt binnen de druppel aan het begin van het experiment betekent dat het eiwit blijft in oplossing. Aangezien de concentratie van precipitant in het reservoir hoger is dan in de daling, begint de daling water door verdamping in de atmosfeer van goed te verliezen tot het evenwicht met het reservoir wordt bereikt. De verspreiding van water in het reservoir veroorzaakt een langzame volumedaling van de daling die beurtelings een verhoging van allebei veroorzaakt, proteïne en precipitant concentratie in de daling. Als de eiwitoplossing bereikt de vereiste staat van Super-verzadiging en dus meta-stabiliteit, spontane nucleatie gevolgd door kristalgroei kan optreden. Het bereiken van de oververzadigde toestand is een noodzakelijke maar niet voldoende voorwaarde voor kristallisatie. Kristallisatie van eiwitten behoeften zowel, gunstige thermodynamische en kinetische omstandigheden, en sterk afhankelijk van de onvoorspelbare eigenschappen van het eiwit te worden gekristalleerd²².

Wijzigingen en probleemoplossing

Expressie van eiwitten in E. coli kan inefficiënt zijn. Verschillende IPTG concentraties, expressie temperatuur, en versterking tijd, zoals kamertemperatuur voor enkele uren of in koude kamer ‘s nachts, kan nodig zijn om te worden getest voor elk nieuw eiwit om optimale omstandigheden te vinden. De precipitatie van proteïne in opnemings organismen wordt soms waargenomen voor meer hydrofobe FAHD proteïnen. In dergelijke gevallen, wordt de eiwituitdrukking in andere modelsystemen zoals insect cellen geadviseerd, aangezien de opnemings organismen minder waarschijnlijk zullen vormen²⁶.

Zoals FAHD eiwitten zijn gevoelig voor zout en cofactor concentraties, evenals pH, zuivering strategieën voor verschillende homologen, orthologues, en Point mutatie varianten kunnen verschillen in individuele instellingen. De beschreven reinigingsmethodes worden ontwikkeld voor de wild-type mens en muis FAHD1 proteïne. Concentraties van chemische stoffen, zoals NaCl en imidazool, alsmede pH, kunnen moeten worden aangepast voor individuele eiwitten met een ander ISO punt (pI). Ook van nota, niet kan elk zijn-geëtiketteerde proteïne goed aan een ni-transatlantische hars binden. Als eiwitbinding aan de ni-transatlantische kolom inefficiënt is, kunnen aangepaste concentraties van NaCl en imidazool, evenals de verschillende pH-omstandigheden in de ni-transatlantische Running buffer bijdragen tot een verbetering van de kwaliteit van het resultaat. Zo niet, dan is het overslaan van de ni-transatlantische stap en de procedure om de stap van de Ionische uitwisseling chromatografie kan ook leiden tot een succesvolle reiniging strategie. Als een eiwit bindt aan de ni-transatlantische kolom, maar kan niet worden geëlueerd uit de kolom, toevoeging van een aantal mM EDTA kan helpen verstoren de ni^{2 +} complex.

Betreffende het proces van kristallisatie, moet men begrijpen dat de zelf-organisatie van grote en complexe eiwit molecules in een regelmatig periodiek rooster een inherent onwaarschijnlijk proces is dat zwaar van moeilijk om kinetische parameters afhangt te controleren. Zelfs kleine veranderingen in de set-up gebruikt voor kristallisatie kan drastisch veranderen het resultaat en geen kristallen zal vormen. De eiwit zuiverheid is over het algemeen van primordiaal belang. Als vuistregel, zou een zwaar overbelaste SDS-pagina gel geen andere banden moeten tonen. Ook kan de volgorde waarin de stappen worden uitgevoerd van invloed op de uitkomst. Als voorbeeld, om te zorgen voor reproduceerbaarheid, is het vaak noodzakelijk om de Pipetting volgorde hetzelfde te houden, dan eerst het eiwit toe te voegen, en tenslotte precipitant toe te voegen aan de kristallisatie druppel (of vice versa). Welke methode gebruikt, moet worden gehouden hetzelfde wanneer het proberen te reproduceren of scale-up experimenten. Als na dit protocol geen kristallen worden waargenomen, kunnen de chemische precipitant samenstelling, pH, dalings grootte, en eiwit-aan-precipitatie verhouding in kleine stappen worden gevarieerd. Geduld en consistente waarnemingen van de druppels zijn van deugd.

Opmerkingen aan katalytische mechanismen van FAHD1

De gepresenteerde methoden zijn speciaal ontwikkeld om FAHD1 eiwitten van hoge kwaliteit te verkrijgen. Dit stelde de groei van FAHD1 kristallen evenals techniek van kristallen met FAHD1 die aan een inhibitor wordt gecomplexeerd (oxalaat, VOB: 6FOG) in. De X-Ray structuren bieden een 3D-architectuur van de katalytische holte van het enzym. Deze resultaten stellen een uitgebreide beschrijving vast van residuen die mogelijk van belang zijn voor de katalytische mechanismen van dit intrigerende enzym. FAHD1 werd voor het eerst beschreven om te kunnen splitsen acylpyruvates (acetylpyruvate, fumarylpyruvate)¹¹. Later werd geconstateerd dat FAHD1 ook opereert als een decarboxylase van Oxaloacetaat¹². Hoewel de substraten acylpyruvate en Oxaloacetaat zijn verschillende chemische delen, de chemische transformaties aandeel mechanistically de strategische Splitsing van een gemeenschappelijke single C³-c⁴ obligatie, energiek vergemakkelijkt als de c³-C⁴ de banen van de band verblijf orthogonale aan π-orbits van c²-carbonyl¹⁵. Een dergelijke conformatie laat resonantie stabilisatie van de C³-carbanion tijdelijk gevormd tijdens het splijt proces. De FAHD1 substraten (Oxaloacetaat en acylpyruvates) zijn flexibele molecules en kunnen in tautomerische (Keto-Enol) evenals C²-gehydrateerde vormen bestaan (figuur 9a). De evenwichten tussen de verschillende soorten worden voornamelijk bepaald door de aard van de gebruikte buffer samenstelling, pH en aanwezigheid van metaalionen. In het volgende bespreken we hypothetische mechanistische scenario’s geïnspireerd door de analyse van X-Ray kristalstructuren die de katalytische centrum van FAHD1 onthuld.

Figuur 9 : Details over het voorgestelde katalytische mechanisme van menselijke FAHD1.
(A) Oxaloacetaat bestaat in kristallijne staat evenals in neutrale oplossing hoofdzakelijk in Z-Enol vorm²⁴. Echter, onder fysiologische pH-voorwaarden de 2-Keto vorm is de overheersende vertegenwoordiging²⁵. (B) chemische schets van de hFAHD1 holte¹⁵ met mg-gebonden Oxaloacetaat (links) en acylpyruvate (rechts, met R¹ als organische rust; de rode pijl duidt op een nucleofiele aanval van de aangrenzende gestabiliseerde watermolecuul) (zie discussie). (C) vergelijking van goedgekeurde conformaties voor c³-c⁴ splitsing in decarboxylase (b tot c) en hydrolase (b ‘ tot c) mechanisme van FAHD1: beide processen resulteren in mg-complexe pyruvaat-enolate (zie discussie). Intermediairs b en b ‘ zullen naar verwachting worden gestabiliseerd door Q109, zoals geschetst in panel B (zie discussie). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

De Decarboxylase activiteit van FAHD1

Oxaloacetaat bestaat in kristallijne staat evenals in neutrale oplossing hoofdzakelijk in Z-Enol vorm²⁴. Maar het was aangetoond dat onder fysiologische pH-omstandigheden (buffer voorwaarden bij pH 7,4) de 2-Keto vorm is de overheersende vertegenwoordiging van Oxaloacetaat²⁵ (figuur 9a), en dat enolization is niet een voorwaarde voor decarboxylatie²⁷. Van de nota, mg^{2 +} ionen hebben geen invloed op de verhouding van de Oxaloacetaat soorten bij een pH van 7,4 of minder dan²⁸. Omzetting van de Oxaloacetaat Keto-vorm in het katalytische centrum van FAHD1 (geleid door de gebonden oxalaat in het complexe enzym (VOB: 6FOG¹⁵)) bleek residu Q109 als een conformationele regulator van de gebonden Oxaloacetaat¹⁵. Zoals uiteengezet in een ander artikel¹⁵, waterstof binding aan de carbamoylfosfaat groep van Q109 stabiliseert een Oxaloacetaat-conformatie als gevolg van rotatie rond de c²-c³ binding (figuur 9b, linker paneel). Als gevolg van deze rotatie neemt de C³-c⁴ binding (te gekloofd) een bijna orthogonale dispositie ten opzichte van de π-orbitalen van de c²-carbonyl (figuur 9C). Koolstofdioxide kan worden vrijgegeven. Het primaire product van dit proces zou resonantie gestabiliseerd mg-enolate van pyruvaat. Het is bekend van onderzoeken van Oxaloacetaat-mg complexen dat de enolate vormt de meest stabiele complex²⁸^,²⁹. Uitgaande van een vergelijkbare stabiliteit voor een mg-pyruvaat enolate-complex de cofactor van FAHD1 zou kunnen worden geblokkeerd, maar lysine residu K123 kan protonate de pyruvaat-enolate in een evenwicht te verbieden verlies van de cofactor¹⁵.

De gegeven interpretatie suggereert pyruvaat Enol als een onderscheiden tussenproduct in de katalytische ODx functie van FAHD1. Bij deze stap in het hypothetische model geeft de experimentele data geen verdere indicatie waarom het gesloten deksel open zou moeten staan om het product vrij te geven. Het kan echter worden afgeleid, dat het voorgestelde mechanisme ziet eruit als een enzymremming door het product: de kristalstructuur onthult een behouden watermolecuul gehouden in directionele oriëntatie richting de FAHD1 katalytische centrum door residuen H30 en E33 gepresenteerd in een korte Helix¹⁵, die wordt geïnduceerd op ligand binding en dekselsluiting. Als primaire Enol in een evenwicht met enolate zou blijven, zou de resonantie gestabiliseerde enolate aan pyruvaat door de watermolecule kunnen worden geblust. De resulterende hydroxyl zou in staat zijn om de pyruvaat te verleggen van de mg-cofactor waarop het deksel zou openen. Ten slotte zou het katalytische centrum worden hersteld in de mitochondriale omgeving. In dit hypothetische scenario, de holte watermolecuul zou opereren als een zuur, respectievelijk.

Hydrolase activiteit van FAHD1

Hydrolase activiteit van een enzym vereist impliciet de tussenliggende vorming van een hydroxyl-nucleofiel. Dit mechanisme wordt meestal aangetroffen in combinatie met zuur-base katalytische activiteit. De overgangstoestand van de reactie moet worden voorbereid via conformationele controle door kritische aminozuur kant ketens in de holte. In analogie met de bespreking van de decarboxylase functie, enzym-gebonden acylpyruvate in 2-Keto vorm zal worden gebracht onder conformationele controle door waterstof-bonding van de 4-carbonyl zuurstof naar Q109 (figuur 9b, rechter paneel). De kristalstructuur van oxalaat FAHD1 (VOB: 6FOG) onthult een geconserveerde watermolecuul gehouden in directionele oriëntatie richting de FAHD1 katalytische centrum door residuen H30 en E33 gepresenteerd in een korte Helix¹⁵. De E33-H30 dyade is bevoegd om deprotonate de directionele gepositioneerd water en de daaruit voortvloeiende hydroxyl is in ideale houding aan te vallen de 4-carbonyl van acylpyruvate gepresenteerd onder conformationele controle door Q109¹⁵.

Van de nota, een soortgelijk mechanisme is voorgesteld voor FAH¹⁸. Aanval door de hydroxyl nucleofiel zal naar verwachting resulteren in een oxyanion soort, dat is gestabiliseerd op de orbitale gecontroleerde C³-c⁴ obligatie splitsing (figuur 9C). In dit model, de C³-c⁴ Bond rotatie (figuur 9C) gebeurt na de nucleofiele aanval door de gevormde hydroxyl aangegeven in figuur 9b (dat wil zeggen, het bereidt de acylpyruvate voor de obligatie splitsing). De primaire producten zouden azijnzuur en mg-pyruvaat enolate. In dit hypothetische scenario kan het azijnzuur de enol aan pyruvaat en vervolgens de verplaatsing van het product helpen. Boven een pH van 7,5 en in de aanwezigheid van mg-ionen, acylpyruvates bestaan in een evenwicht tussen Keto-en Enol-vormen, de laatste in lichte voorkeur³⁰. Waarschijnlijk beide vormen zijn in staat om te binden aan de cofactor van FAHD1 onder de volgende dekselsluiting. De verwerking van enolic acylpyruvate substraten door het enzym wordt belemmerd wegens de vlakke structuur van het Enol-vorm. De C³-c⁴ splitsing zou resulteren in een vinyl carbanion zonder resonantie stabilisatie.

Daarom stellen wij een katalytische ketonization stap voor te bereiden op de aanval van de hydroxyl nucleofiel op de acryl carbonyl. Dit proces van ketonization, echter, zou controle over Proton verplaatsingen door FAHD1 residu’s vereisen, die een inherent isomerase activiteit aan FAHD1 zouden toeschrijven. Het is gemeld dat de zuurgraad van mg-gebonden Enol waterstof onthult een 10000-voudige stijging ten opzichte van de niet-gecomplexeerde vorm²⁸. Een deprotonatie van de mg gebonden Enol-vorm zou haalbaar zijn door un-geprotoneerd K123. De deprotonatie van K123 kan worden bijgestaan door de carboxylate van D102. Een netwerk van de waterstofband dat door residu’s wordt gevormd D102-K47-K123 kon als noodzakelijk Proton Relais in het katalytische centrum van FAHD1¹⁵werken. Een dergelijke gevormde intermediaire enolate kan dan worden geblust door een E33-H30-H₂0 triade onder ketonization van het substraat¹⁵. De 2-Keto vorm zou komen onder conformationele controle van Q109, en de gelijktijdig gevormde hydroxyl zou aanvallen de acryl carbonyl. De samengevatte bespreking impliceert een controle van FAHD1 over een watermolecule voor het schakelen tussen zuur en basis door samenspel van holte-vormende residu’s.

Toekomstige toepassingen of richtingen van de methode

De toekomstige toepassingen van de hier beschreven methodes zijn talrijk. Een overvloed aan prokaryote leden van de FAH Superfamily wacht nog steeds functionele karakterisering. Zelfs de beschikbare informatie over de katalytische activiteiten van bekende FAH superfamilie leden is schaars en in de meeste gevallen gebaseerd op theoretische veronderstellingen in plaats van experimentele gegevens. Toepassing van de methoden die hier beschreven voor prokaryote FAH Superfamily-leden is afhankelijk van de specifieke onderzoek belangen in bacteriologie. Aan de andere kant, de recente demonstratie dat eukaryote FAH familieleden essentiële rollen spelen in verschillende cellulaire compartimenten (bijv., cytosol VS mitochondria) wijst op de noodzaak om beter te karakteriseren deze eiwitten (drie van die zijn tot dusver geïdentificeerd), in het bijzonder omdat de huidige gegevens suggereren dat sommige niet-gekenmerkte eiwitten kunnen uitvoeren verschillende functies in de context van mitochondriale biologie, veroudering onderzoek, en kankeronderzoek. Er wordt voorgesteld dat de volledige moleculaire en fysiologische karakterisering van deze eukaryote FAH familieleden kunnen belangrijk inzicht te geven in de belangrijkste gebieden van het hedendaagse onderzoek in de biomedische sector. Meer onderzoek naar de mechanismen van FAHD1 (en aanverwante enzymen) zijn nodig om beter te begrijpen mechanismen ten grondslag liggen aan de BI-functionaliteit van FAHD1, die nog steeds niet volledig verduidelijkt. Aanvullende studies met FAHD1 mutanten, NMR-onderzoeken, en structurele studies over inhibitor complexen kunnen helpen bij het oplossen van de ware mechanistische scenario’s waarvoor FAHD1 lijkt te zijn bevoegd. Bovendien, computer-aided design van Enol bootst in staat om te binden aan de mg-cofactor zal uiteindelijk leiden tot krachtige remmers van FAHD1.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs zijn zeer dankbaar voor deskundige technische bijstand door Annabella Pittel en de piloot methode ontwikkeling door Haymo Pircher.

Materials

BL21(DE3) pLysS competent E. coli	Promega	L1195	High-efficiency protein expression from gene with T7 promoter and ribosome binding site
pET E. coli T7 Expression Vectors	MERCK	–	http://www.merckmillipore.com/AT/de/life-science-research/genomic-analysis/dna-preparation-cloning/pet-expression-vectors/qFSb.qB.mLQAAAFA6.VkiQ0G,nav
0.45 µm filter units	MERCK	SLHP033NS	Millex-HP, 0.45 µm, PES 33 mm, not steril
0.22 µm filter units	MERCK	SLGP033RS	Millex-HP, 0.22 µm, PES 33 mm, not steril
Eppendof tubes 1.5 mL	VWR	525-1042	microcentrifugal tubes; autoclaved
15 mL Falcon	VWR	734-0451	centrifugal tubes
50 mL Falcon	VWR	734-0448	centrifugal tubes
PS Cuvettes Spectrophotometer Semi-Micro	VWR	30622-758	VIS transparent cuvettes
UV Cuvettes Spectrophotometer Semi-Micro	VWR	47727-024	UV/VIS transparent cuvettes
isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG)	ROTH	2316	chemical used for induction of protein expression with the DE3/pET system
imidazole	ROTH	X998	chemical used for elution of polyhistidine (6xHis) sequences from a nickel-charged affinity resin
Glass Econo-Column Columns	Bio-Rad	–	http://www.bio-rad.com/de-at/product/glass-econo-column-columns?ID=2cfb1c6e-32e8-4c72-b532-dd39013d707d&pcp_loc=catprod
chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C0378	antibiotic for bacterial growth selection; resistance endióded in pLysS plasmid of BL21(DE3) E. coli; 25 µg/mL final concentration
kanamycin	Sigma-Aldrich	60615	antibiotic for bacterial growth selection; to be used if this resistance is encoded in the employed pET vector; 50 µg/mL final concentration
ampicillin	Sigma-Aldrich	A1593	antibiotic for bacterial growth selection; to be used if this resistance is encoded in the employed pET vector; 100 µg/mL final concentration
Ultra-15, MWCO 10 kDa	Sigma-Aldrich	Z706345	centrifigal filters for protein enrichment; https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/z706345?lang=de®ion=AT
Ultra-0.5 Centrifugal Filter Units	Sigma-Aldrich	Z677108	centrifigal filters for protein enrichment; https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/ALDRICH/Z677108?lang=de&region=AT&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold5-2
oxaloacetic acid	Sigma-Aldrich	O4126	TCA metabolite
sodium oxlalate	Sigma-Aldrich	71800	a competitive inhibitor of FAH superfamily enzymes
Dialysis tubing cellulose membrane	Sigma-Aldrich	D9277	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d9277; or comparable
Ni-NTA agarose	Thermo-Fischer	R90101	a nickel-charged affinity resin that can be used to purify recombinant proteins containing a polyhistidine (6xHis) sequence
96-Well UV Microplate	Thermo-Fischer	8404	UV/VIS transparent flat-bottom 96 well plates
PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa	Thermo-Fischer	26616	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26616?SID=srch-hj-26616
ÄKTA FPLC system	GE Healthcare Life Sciences	–	using the FPLC system by GE Healthcare; different custom versions exist; this work used the "ÄKTA pure" system
HiTrap Phenyl HP column	GE Healthcare Life Sciences	–	https://www.gelifesciences.com/en/it/shop/chromatography/prepacked-columns/hydrophobic-interaction/hitrap-phenyl-hp-p-05630
Mono S 10/100 GL	GE Healthcare Life Sciences	–	https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/ion-exchange/mono-s-cation-exchange-chromatography-column-p-00723
Mono Q 10/100 GL	GE Healthcare Life Sciences	–	https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/ion-exchange/mono-q-anion-exchange-chromatography-column-p-00608
HiLoad Superdex column 75 pg (G75)	GE Healthcare Life Sciences	–	https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/size-exclusion/hiload-superdex-75-pg-preparative-size-exclusion-chromatography-columns-p-05800
HiLoad Superdex column 200 pg (G200)	GE Healthcare Life Sciences	–	https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/size-exclusion/hiload-superdex-200-pg-preparative-size-exclusion-chromatography-columns-p-06283
TECAN microplate reader	TECAN Life Sciences	–	https://lifesciences.tecan.com/microplate-readers
acetylpyruvate	MoleculeCrafting.HuGs e.U.	–	custom synthesis
benzoylpyruvate	MoleculeCrafting.HuGs e.U.	–	custom synthesis
VDX™ plate (24 wells)	Hampton	HR3-142	24 well plates used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion
paraffin oil	Hampton	HR3-411	used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion
coverslips (22 mm)	Karl Hecht KG	14043	coverslips used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion
Luria broth (LB) medium	self-prepared	–	a general growth medium for E. coli: 5 g/L yeast extract; 10 g/L peptone from casein; 10 g/L sodium chloride; 12 g/L agar-agar
NZCYM medium	self-prepared	–	a better growth medium for E. coli, used for amplification: 10 g/L NZ amine; 5 g/L NaCl; 5 g/L yeast extract; 1 g/L casamino acids; 2 g/L MgSO4; adjust pH to 7.4
Luria broth (LB) agarose plates	self-prepared	–	autoclaved agarose plates containing LB-medium and antibiotics for bacterial groth selection; https://www.addgene.org/protocols/pouring-lb-agar-plates/
Ni-NTA running buffer	self-prepared	–	20 mM Tris-HCl pH 7,4; 50-300 mM NaCl; 10-200 mM imidazole; ranges: optimal value varies among FAHD proteins
Ni-NTA elution buffer	self-prepared	–	20 mM Tris-HCl pH 7,4; 50-300 mM NaCl; 200-500 mM imidazole; ranges: optimal value varies among FAHD proteins
HIC running buffer	self-prepared	–	44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 100 mM NaCl; 20 mM DTT; adjust to pH 7
HIC running buffer AS	self-prepared	–	HIC running buffer saturated with ammonium sulfate (AS); adjust to pH 7: 70 g ammonium sulfate + 90 mL buffer, stirred overnight in the cold room; adjust to pH 7.0
Mono S low salt buffer	self-prepared	–	44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 10-300 mM NaCl; ranges: optimal value varies among FAHD proteins
Mono S high salt buffer	self-prepared	–	44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 1-2 M NaCl; ranges: optimal value varies among FAHD proteins
Mono Q low salt buffer	self-prepared	–	20 mM Tris-HCl; 15 mM NaCl; adjust to pH 8.0
Mono Q high salt buffer	self-prepared	–	20 mM Tris-HCl; 1 M NaCl; 10 % glycerol; adjust to pH 8.0
G75 / G200 running buffer	self-prepared	–	15 mM Tris-HCl; 300 mM NaCl; adjust to pH 7.4
enzyme assay buffer	self-prepared	–	50 mM Tris-HCl pH7.4; 100 mM KCl; 1 mM MgCl₂
protein crystallization buffer	self-prepared	–	G75 / G200 running buffer with 1 mM DTT
reservoir solution for crystallization	self-prepared	–	100 mM Na-HEPES pH 7.5; 5-20 % (w/v) PEG4k; 10 mM-200 mM MgCl₂

References

Brouns, S. J. J., et al. Structural Insight into Substrate Binding and Catalysis of a Novel 2-Keto-3-deoxy-d-arabinonate Dehydratase Illustrates Common Mechanistic Features of the FAH Superfamily. Journal of Molecular Biology. 379, 357-371 (2008).
Timm, D. E., Mueller, H. A., Bhanumoorthy, P., Harp, J. M., Bunick, G. J. Crystal structure and mechanism of a carbon-carbon bond hydrolase. Structure (London, England: 1993). 7, 1023-1033 (1999).
Weiss, A. K. H., Loeffler, J. R., Liedl, K. R., Gstach, H., Jansen-Dürr, P. The fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) superfamily of enzymes: multifunctional enzymes from microbes to mitochondria. Biochemical Society Transactions. 46, 295 (2018).
Guimarães, S. L., et al. Crystal Structures of Apo and Liganded 4-Oxalocrotonate Decarboxylase Uncover a Structural Basis for the Metal-Assisted Decarboxylation of a Vinylogous β-Keto Acid. Biochemistry. 55, 2632 (2016).
Zhou, N. Y., Fuenmayor, S. L., Williams, P. A. nag genes of Ralstonia (formerly Pseudomonas) sp. strain U2 encoding enzymes for gentisate catabolism. Journal of Bacteriology. 183, 700 (2001).
Izumi, A., et al. Structure and Mechanism of HpcG, a Hydratase in the Homoprotocatechuate Degradation Pathway of Escherichia coli. Journal of Molecular Biology. 370, 899-911 (2007).
Manjasetty, B. A., et al. X-ray structure of fumarylacetoacetate hydrolase family member Homo sapiens FLJ36880. Biological Chemistry. 385, 935-942 (2004).
Tame, J. R. H., Namba, K., Dodson, E. J., Roper, D. I. The crystal structure of HpcE, a bifunctional decarboxylase/isomerase with a multifunctional fold. Biochemistry. 41, 2982-2989 (2002).
Ran, T., et al. Crystal structures of Cg1458 reveal a catalytic lid domain and a common catalytic mechanism for the FAH family. The Biochemical Journal. 449, 51-60 (2013).
Ran, T., Wang, Y., Xu, D., Wang, W. Expression, purification, crystallization and preliminary crystallographic analysis of Cg1458: A novel oxaloacetate decarboxylase from Corynebacterium glutamicum. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 67, 968-970 (2011).
Pircher, H., et al. Identification of human Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing Protein 1 (FAHD1) as a novel mitochondrial acylpyruvase. Journal of Biological Chemistry. 286, 36500-36508 (2011).
Pircher, H., et al. Identification of FAH domain-containing protein 1 (FAHD1) as oxaloacetate decarboxylase. Journal of Biological Chemistry. 290, 6755-6762 (2015).
Petit, M., Koziel, R., Etemad, S., Pircher, H., Jansen-Dürr, P. Depletion of oxaloacetate decarboxylase FAHD1 inhibits mitochondrial electron transport and induces cellular senescence in human endothelial cells. Experimental Gerontology. 92, 7-12 (2017).
Etemad, S., et al. Oxaloacetate decarboxylase FAHD1 – a new regulator of mitochondrial function and senescence. Mechanisms of Ageing and Development. 177, 22-29 (2019).
Weiss, A. K. H., et al. Structural basis for the bi-functionality of human oxaloacetate decarboxylase FAHD1. Biochemical Journal. 475, 3561-3576 (2018).
Taferner, A., et al. FAH domain-containing protein 1 (FAHD-1) Is required for mitochondrial function and locomotion activity in C. elegans. PLoS ONE. 10, 1-15 (2015).
Mizutani, H., Kunishima, N. Purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of the fumarylacetoacetase family member TTHA0809 from Thermus thermophilus HB8. Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization Communications. 63, 792-794 (2007).
Bateman, R. L., Bhanumoorthy, P., Witte, J. F., McClard, R. W., Grompe, M., Timm, D. E., et al. Mechanistic Inferences from the Crystal Structure of Fumarylacetoacetate Hydrolase with a Bound Phosphorus-based Inhibitor. Journal of Biological Chemistry. 276, 15284-15291 (2001).
Zeng, F., et al. Efficient strategy for introducing large and multiple changes in plasmid DNA. Scientific Reports. 8, 1714 (2018).
Higuchi, R., Krummel, B., Saiki, R. K. A general method of in vitro preparation and specific mutagenesis of DNA fragments: study of protein and DNA interactions. Nucleic Acids Research. 16, 7351-7367 (1988).
Jansen-Duerr, P., Pircher, H., Weiss, A. K. H. The FAH Fold Meets the Krebs Cycle. Molecular Enzymology and Drug Targets. 2, 1-5 (2016).
Rupp, B. Origin and use of crystallization phase diagrams. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71, 247-260 (2015).
Rupp, B. . Biomolecular Crystallography: Principles, Practice, and Application to Structural Biology. , (2010).
Flint, D. H., Nudelman, A., Calabrese, J. C., Gottlieb, H. E. Enol oxalacetic acid exists in the Z form in the crystalline state and in solution. The Journal of Organic Chemistry. 57, 7270-7274 (1992).
Pogson, C. I. I., Wolfe, R. G. G. Oxaloacetic acid tautomeric and hydrated forms in solution. Biochemical and Biophysical Research Communications. 46, 1048-1054 (1972).
Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L., Kost, A. T. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nature Biotechnology. 23, 567-575 (2005).
Steinberger, R., Westheimer, F. H. Metal Ion-catalyzed Decarboxylation: A Model for an Enzyme System 1. Journal of the American Chemical Society. 73, 429-435 (1951).
Tate, S. S., Grzybowski, A. K., Datta, S. P. The stability constants of the magnesium complexes of the keto and enol isomers of oxaloacetic acid at 25. Journal of Chemical Society. , 1381-1389 (1964).
Tate, S. S., Grzybowski, A. K., Datta, S. P. The acid dissociations of the keto and enol isomers of oxaloacetic acid at 25. Journal of Chemical Society. 1372, 1380 (1964).
Brecker, L., et al. Synthesis of 2,4-diketoacids and their aqueous solution structures. New Journal of Chemistry. 23, 437-446 (1999).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Weiss, A. K. H., Holzknecht, M., Cappuccio, E., Dorigatti, I., Kreidl, K., Naschberger, A., Rupp, B., Gstach, H., Jansen-Dürr, P. Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins. J. Vis. Exp. (148), e59729, doi:10.3791/59729 (2019).

Automatically Generated