Анализ взаимодействия между эндобиотики и человека кишки микробиоты использованием в пробирке ванны системы брожения
Summary
Описано здесь протокол для изучения взаимодействия между эндобиотики и кишечника человека микробиоты с использованием in vitro пакетных систем брожения.
Abstract
Микроорганизмы кишечника человека в последнее время стали важной целью исследований в области укрепления здоровья человека и профилактики заболеваний. Следовательно, исследования взаимодействия между эндобиотиками (например, препаратами и пребиотиками) и микрофлорой кишечника стали важной темой исследования. Тем не менее, эксперименты in vivo с человеческими добровольцами не являются идеальными для таких исследований из-за биоэтики и экономических ограничений. В результате, животные модели были использованы для оценки этих взаимодействий in vivo. Тем не менее, исследования моделей на животных по-прежнему ограничены соображениями биоэтики, в дополнение к различным композициям и разнообразию микробиоты у животных по сравнению с людьми. Альтернативной стратегией исследования является использование пакетных экспериментов брожения, которые позволяют оценить взаимодействия между эндобиотиками и кишечной микробиотой in vitro. Для оценки этой стратегии, бифидобактерии (Bif) экзополисахариды (EPS) были использованы в качестве представителя ксенобиотик. Затем взаимодействия между Bif EPS и микрофлорой кишечника человека были исследованы с помощью нескольких методов, таких как тонкослойная хроматография (TLC), бактериальный композиционный анализ сообщества с 16S rRNA гена высокой пропускной способности секвенирования, и газовой хроматографии короткоцепочечных жирных кислот (СКФО). Представлен протокол для изучения взаимодействия между эндобиотики и кишечной микрофлоры кишечника человека с использованием in vitro пакетных ферментации систем. Важно отметить, что этот протокол также может быть изменен для изучения общих взаимодействий между другими эндобиотиками и кишечной микробиотой.
Introduction
Микробиота кишки играет важную роль в функционировании кишечника человека и в здоровье хозяина. Следовательно, кишечная микробиота в последнее время стали важной мишенью для профилактики заболеваний и терапии1. Кроме того, кишечные бактерии взаимодействуют с клетками кишечника и регулируют фундаментальные процессы пребывания, включая метаболическую деятельность, наличие питательных веществ, модуляцию иммунной системы и даже функцию мозга и принятие решений2,3 . Эндобиотики обладают значительным потенциалом для влияния на бактериальный состав и разнообразие кишечной микробиоты. Таким образом, взаимодействие между эндобиотиками и микрофлорой кишечника человека привлекло все большее внимание к исследованиям4,5,6,7,8,9.
Трудно оценить взаимодействие между эндобиотиками и микрофлорой кишечника человека in vivo из-за биоэтики и экономических ограничений. Например, эксперименты, исследующие взаимодействие между эндобиотиками и микрофлорой кишечника человека, не могут быть проведены без разрешения Управления по контролю за продуктами и лекарствами, а набор добровольцев обходится дорого. Следовательно, животные модели часто используются для таких исследований. Тем не менее, использование моделей животных ограничено из-за различных композиций микробиоты и разнообразия в животных против человека связанных общин. Альтернативный метод in vitro для изучения взаимодействий между эндобиотиками и микрофлорой кишечника человека — это использование экспериментов по пакетной культуре.
Экзополисахариды (EPS) являются пребиотиками, которые вносят значительный вклад в поддержание здоровья человека10. Различные EPS, которые состоят из различных моносахаридных композиций и структур могут проявлять различные функции. Предыдущие анализы определили состав Bif EPSs, которые являются репрезентативными ксенобиотами, предназначенными в текущем исследовании11. Однако связанные с хост метаболическими эффектами не были учтены в отношении состава и разнообразия EPS.
В описанном здесь протоколе используется фекальная микробиота от 12 добровольцев для брожения Bif EPS. Тонкослойная хроматография (TLC), ген 16S rRNA высокой пропускной способности секвенирования, и газовая хроматография (ГК) затем используются в комбинации для исследования взаимодействий между ЭПС и микрофлоры кишечника человека. Отличительными преимуществами этого протокола по сравнению с экспериментами in vivo являются его низкая стоимость и избегание вмешательства в обмен веществ хозяина. Кроме того, описанный протокол может быть использован в других исследованиях, которые исследуют взаимодействия между эндобиотиками и микрофлорой кишечника человека.
Protocol
Representative Results
Discussion
За последнее десятилетие был достигнут значительный прогресс в понимании состава и деятельности микрофлоры кишечника человека. Как следствие этих исследований, концепция голобиона возникла, которая представляет собой взаимодействие между хостом и связанных с ними микробных сообщес…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было профинансировано Национальным фондом естественных наук Китая (No 31741109), Фондом естественных наук Хунаня (No 2018JJ3200), а также программой строительства прикладной характерной дисциплины в Хунаньском университете науки и техники. Мы благодарим LetPub (www.letpub.com) за лингвистическую помощь в подготовке этой рукописи.
Materials
| 0.22 µm membrane filters | Millipore | SLGP033RB | Use to filter samples |
| 0.4-mm Sieve | Thermo Fischer | 308080-99-1 | Use to prepare human fecal samples |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-Gal) | Solarbio | X1010 | Use to prepare color plate |
| Acetic | Sigma-Aldrich | 71251 | Standard sample for SCFA |
| Agar | Solarbio | YZ-1012214 | The component of medium |
| Anaerobic chamber | Electrotek | AW 400SG | Bacteria culture and fermentation |
| Autoclave | SANYO | MLS-3750 | Use to autoclave |
| Bacto soytone | Sigma-Aldrich | 70178 | The component of medium |
| Baking oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | Use to heat and bake |
| Beef Extract | Solarbio | G8270 | The component of medium |
| Bifidobacterium longum Reuter | ATCC | ATCC® 51870™ | Bacteria |
| Bile Salts | Solarbio | YZ-1071304 | The component of medium |
| Butyric | Sigma-Aldrich | 19215 | Standard sample for SCFA |
| CaCl2 | Solarbio | C7250 | Salt solution of medium |
| Capillary column | SHIMADZU-GL | InertCap FFAP (0.25 mm × 30 m × 0.25 μm) | Used to SCFA detection |
| Casein Peptone | Sigma-Aldrich | 39396 | The component of medium |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall ST 8 | Use for centrifugation |
| CoSO4.7H2O | Solarbio | C7490 | The component of medium |
| CuSO4.5H2O | Solarbio | 203165 | The component of medium |
| Cysteine-HCl | Solarbio | L1550 | The component of medium |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | Use to prepare vitamin K1 |
| FeSO4.7H2O | Solarbio | YZ-111614 | The component of medium |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | 399388 | Used to TLC |
| Gas chromatography | Shimadzu Corporation | GC-2010 Plus | Used to SCFA detection |
| Glass beaker | Fisher Scientific | FB10050 | Used for slurry preparation |
| Glucose | Solarbio | G8760 | The component of medium |
| Haemin | Solarbio | H8130 | The component of medium |
| HCl | Sigma-Aldrich | 30721 | Basic solution used to adjust the pH of the buffers |
| Isobutyric | Sigma-Aldrich | 46935-U | Standard sample for SCFA |
| Isovaleric Acids | Sigma-Aldrich | 129542 | Standard sample for SCFA |
| K2HPO4 | Solarbio | D9880 | Salt solution of medium |
| KCl | Solarbio | P9921 | The component of medium |
| KH2PO4 | Solarbio | P7392 | Salt solution of medium |
| LiCl.3H2O | Solarbio | C8380 | Use to prepare color plate |
| Meat Extract | Sigma-Aldrich-Aldrich | 70164 | The component of medium |
| Metaphosphoric Acid | Sigma-Aldrich | B7350 | Standard sample for SCFA |
| MgCl2.6H2O | Solarbio | M8160 | The component of medium |
| MgSO4.7H2O | Solarbio | M8300 | Salt solution of medium |
| MISEQ | Illumina | MiSeq 300PE system | DNA sequencing |
| MnSO4.H20 | Sigma-Aldrich | M8179 | Salt solution of medium |
| Mupirocin | Solarbio | YZ-1448901 | Antibiotic |
| NaCl | Solarbio | YZ-100376 | Salt solution of medium |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | 792519 | Salt solution of medium |
| NanoDrop ND-2000 | NanoDrop Technologies | ND-2000 | Determine DNA concentrations |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 30620 | Basic solution used to adjust the pH of the buffers |
| n-butanol | ChemSpider | 71-36-3 | Used to TLC |
| NiCl2 | Solarbio | 746460 | The component of medium |
| Orcinol | Sigma-Aldrich | 447420 | Used to prepare orcinol reagents |
| Propionic | Sigma-Aldrich | 94425 | Standard sample for SCFA |
| QIAamp DNA Stool Mini Kit | QIAGEN | 51504 | Extract bacterial genomic DNA |
| Ready-to-use PBS powder | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A610100-0001 | Used to prepare the lipid suspension |
| Resazurin | Solarbio | R8150 | Anaerobic Equipment |
| Speed Vacuum Concentrator | LABCONCO | CentriVap | Use to prepare EPSs |
| Starch | Solarbio | YZ-140602 | Use to the carbon source |
| Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 150692 | Used to prepare orcinol reagents |
| T100 PCR | BIO-RAD | 1861096 | PCR amplification |
| TLC aluminium sheets | MerckMillipore | 116835 | Used to TLC |
| Trypticase Peptone | Sigma-Aldrich | Z699209 | The component of medium |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | T7293 | The component of medium |
| Tween 80 | Solarbio | T8360 | Salt solution of medium |
| Valeric | Sigma-Aldrich | 75054 | Standard sample for SCFA |
| Vitamin K1 | Sigma-Aldrich | V3501 | The component of medium |
| Vortex oscillator | Scientific Industries | Vortex.Genie2 | Use to vortexing |
| Yeast Extract | Sigma-Aldrich | Y1625 | The component of medium |
| ZnSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | Z0251 | The component of medium |
References
- Maarten, V. D. G., Blottière Hervé, M., Doré, J. Humans as holobionts: implications for prevention and therapy. Microbiome. 6 (1), 81 (2018).
- Allen, A. P., Dinan, T. G., Clarke, G., Cryan, J. F. A psychology of the human brain-gut-microbiome axis. Social and Personality Psychology Compass. 11 (4), e12309 (2017).
- Arora, T., Bäckhed, F. The gut microbiota and metabolic disease: current understanding and future perspectives. Journal of Internal Medicine. 280, 39-349 (2016).
- Maurice, C., Haiser, H., Turnbaugh, P. Xenobiotics shape the physiology and gene expression of the active human gut microbiome. Cell. 152 (1-2), 39-50 (2013).
- Carmody, R. N., Turnbaugh, P. J. Host-microbial interactions in the metabolism of therapeutic and diet-derived xenobiotics. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4173-4181 (2014).
- Lu, K., Mahbub, R., Fox, J. G. Xenobiotics: interaction with the intestinal microflora. ILAR Journal. 56 (2), 218-227 (2015).
- Taguer, M., Maurice, C. The complex interplay of diet, xenobiotics, and microbial metabolism in the gut: implications for clinical outcomes. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 99 (6), 588-599 (2016).
- Anubhav, D., Meenakshi, S., Shankar, G. T., Mande, S. S., Wilson, B. A. Xenobiotic metabolism and gut microbiomes. PLoS One. 11 (10), e0163099 (2016).
- Koppel, N., Rekdal, V. M., Balskus, E. P. Chemical transformation of xenobiotics by the human gut microbiota. Science. 356 (6344), 1246-1257 (2017).
- Hidalgo-Cantabrana, C., et al. Genomic overview and biological functions of exopolysaccharide biosynthesis in Bifidobacterium spp. Applied and Environmental Microbiology. 80 (1), 9-18 (2014).
- Liu, G., et al. Effects of bifidobacteria-produced exopolysaccharides on human gut microbiota in vitro. Applied Microbiology and Biotechnology. , 1-10 (2018).
- Tang, R., et al. Gut microbial profile is altered in primary biliary cholangitis and partially restored after UDCA therapy. Gut. 67 (3), 534-541 (2018).
- Kuczynski, J., et al. Using QIIME to analyze 16S rRNA gene sequences from microbial communities. Current Protocols in Microbiology. 27 (1), 1-28 (2012).
- Hiltemann, S. D., Boers, S. A., van der Spek, P. J., Jansen, R., Hays, J. P., Stubbs, A. P. Galaxy mothur Toolset (GmT): a user-friendly application for 16S rRNA gene sequencing analysis using mothur. GigaScience. , (2018).
- Wang, Q., Garrity, G. M., Tiedje, J. M., Cole, J. R. Naïve Bayesian classifier for rapid assignment of rRNA sequences into the new bacterial taxonomy. Applied and Environmental Microbiology. 73 (16), 5261-5267 (2007).
- Schloss, P. D., et al. Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology. 75 (23), 7537-7541 (2009).
- Bai, S., et al. Comparative study on the in vitro effects of pseudomonas aeruginosa and seaweed alginates on human gut microbiota. Plos One. 12 (2), e0171576 (2017).
- Zhang, Z., Xie, J., Zhang, F., Linhardt, R. J. Thin-layer chromatography for the analysis of glycosaminoglycan oligosaccharides. Analytical Biochemistry. 371, 118-120 (2007).
- Simon, J. C., Marchesi, J. R., Mougel, C., Selosse, M. A. Host-microbiota interactions: from holobiont theory to analysis. Microbiome. 7 (5), (2019).
- Postler, T. S., Ghosh, S. Understanding the Holobiont: how microbial metabolites affect human health and shape the immune system. Cell Metabolism. 26 (1), 110-130 (2017).
- Kramer, P., Bressan, P. Humans as superorganisms: how microbes, viruses, imprinted genes, and other selfish entities shape our behavior. Perspectives on Psychological Science. 10 (4), 464-481 (2015).
- Malfertheiner, P., Nardone, G. Gut microbiota: the forgotten organ. Digestive Diseases. 29 (6), (2011).
- Andoh, A. The gut microbiota is a new organ in our body. The Japanese journal of Gastro-Enterology. 112 (11), 1939-1946 (2015).
- Mika, A., Van, W. T., González, A., Herrera, J. J., Knight, R., Fleshner, M. Exercise is more effective at altering gut microbial composition and producing stable changes in lean mass in juvenile versus adult male f344 rats. PLoS One. 10 (5), e0125889 (2015).
- Hugenholtz, F., de Vos, W. M. Mouse models for human intestinal microbiota research: a critical evaluation. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (1), 149-160 (2018).
- Takagi, R., et al. A single-batch fermentation system to simulate human colonic microbiota for high-throughput evaluation of prebiotics. PLoS One. 11 (8), e0160533 (2016).
- Ning, T., Gong, X., Xie, L., Ma, B. Gut microbiota analysis in rats with methamphetamine-induced conditioned place preference. Frontiers in Microbiology. 8 (1), 1620 (2017).
