Analyse von Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und Human Gut Microbiota mit In-Vitro-Badfermentationssystemen
Summary
Beschrieben ist hier ein Protokoll, um die Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und menschlichen Darmmikrobiota mit In-vitro-Batch-Fermentationssysteme zu untersuchen.
Abstract
Menschliche Darmmikroorganismen sind in letzter Zeit zu einem wichtigen Ziel der Forschung bei der Förderung der menschlichen Gesundheit und der Prävention von Krankheiten geworden. Daher sind Untersuchungen von Wechselwirkungen zwischen Endobiotika (z.B. Medikamente und Präbiotika) und Darmmikrobiota zu einem wichtigen Forschungsthema geworden. In-vivo-Experimente mit menschlichen Freiwilligen sind jedoch aufgrund von Bioethik und wirtschaftlichen Zwängen nicht ideal für solche Studien. Als Ergebnis wurden Tiermodelle verwendet, um diese Wechselwirkungen in vivo zu bewerten. Dennoch sind Tiermodellstudien nach wie vor durch bioethische Überlegungen begrenzt, zusätzlich zu unterschiedlichen Zusammensetzungen und Diversitäten von Mikrobiota bei Tieren und Menschen. Eine alternative Forschungsstrategie ist der Einsatz von Batch-Fermentationsexperimenten, die eine Bewertung der Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und Darmmikrobiota in vitro ermöglichen. Zur Bewertung dieser Strategie wurden bifidobakterielle (Bif) Exopolysaccharide (EPS) als repräsentatives Xenobiotikum verwendet. Anschließend wurden die Wechselwirkungen zwischen Bif EPS und humaner Darmmikrobiota mit verschiedenen Methoden wie dünnschichtige Chromatographie (TLC), kompositorische Analyse der bakteriengemeinschaft mit 16S rRNA-Gen-Hochdurchsatzsequenzierung und Gaschromatographie untersucht. von kurzkettigen Fettsäuren (SCFAs). Hier wird ein Protokoll zur Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und menschlicher Darmmikrobiota mit In-vitro-Batch-Fermentationssystemen vorgestellt. Wichtig ist, dieses Protokoll kann auch geändert werden, um allgemeine Wechselwirkungen zwischen anderen Endobiotika und Darmmikrobiota zu untersuchen.
Introduction
Gut Mikrobiota spielen eine wichtige Rolle bei der Funktion des menschlichen Darms und in der Wirtgesundheit. Folglich sind Darmmikrobiota in letzter Zeit ein wichtiges Ziel für die Prävention und Therapie von Krankheiten geworden1. Darüber hinaus interagieren Darmbakterien mit Wirtsdarmzellen und regulieren grundlegende Wirtsprozesse, einschließlich stoffwechselnder Aktivitäten, Nährstoffverfügbarkeiten, Modulation des Immunsystems und sogar Gehirnfunktion und Entscheidungsfindung2,3 . Endobiotika haben erhebliches Potenzial, die bakterielle Zusammensetzung und Vielfalt der Darmmikrobiota zu beeinflussen. So, Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und menschlichen Darm Mikrobiota haben zunehmende Forschungsaufmerksamkeitangezogen 4,5,6,7,8,9.
Es ist schwierig, Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und humaner Darmmikrobiota in vivo aufgrund von Bioethik und wirtschaftlichen Zwängen zu bewerten. Zum Beispiel können Experimente, die die Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und menschlicher Darmmikrobiota untersuchen, nicht ohne Erlaubnis der Food and Drug Administration durchgeführt werden, und die Rekrutierung von Freiwilligen ist teuer. Daher werden für solche Untersuchungen häufig Tiermodelle verwendet. Die Verwendung von Tiermodellen ist jedoch aufgrund unterschiedlicher Mikrobiotazusammensetzungen und Diversität in tier- und menschenverbundenen Gemeinschaften begrenzt. Eine alternative In-vitro-Methode zur Erforschung der Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und menschlicher Darmmikrobiota ist der Einsatz von Batch-Kulturexperimenten.
Exopolysaccharide (EPS) sind Präbiotika, die wesentlich zur Erhaltung der menschlichen Gesundheit beitragen10. Verschiedene EPS, die aus verschiedenen Monosaccharid-Zusammensetzungen und -Strukturen bestehen, können unterschiedliche Funktionen aufweisen. Frühere Analysen haben die Zusammensetzung der Bif EPS bestimmt, die das repräsentative Xenobiotikum sind, das in der aktuellen Studie11ins Visier genommen wird. Die wirtassoziierten metabolischen Effekte wurden jedoch hinsichtlich der EPS-Zusammensetzung und -Vielfalt nicht berücksichtigt.
Das hier beschriebene Protokoll verwendet die fäkale Mikrobiota von 12 Freiwilligen, um Bif EPS zu fermentieren. Die Dünnschichtchromatographie (TLC), die 16S rRNA-Gen-Hochdurchsatzsequenzierung und die Gaschromatographie (GC) werden dann in Kombination verwendet, um die Wechselwirkungen zwischen EPS und humaner Darmmikrobiota zu untersuchen. Deutliche Vorteile dieses Protokolls im Vergleich zu In-vivo-Experimenten sind seine niedrigen Kosten und die Vermeidung von störenden Effekten aus dem Stoffwechsel des Wirts. Darüber hinaus kann das beschriebene Protokoll in anderen Studien verwendet werden, die Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und menschlicher Darmmikrobiota untersuchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In den letzten zehn Jahren wurden bedeutende Fortschritte beim Verständnis der Zusammensetzung und Der Aktivitäten der menschlichen Darmmikrobiota erzielt. Als Folge dieser Studien ist das holobionische Konzept entstanden, das die Wechselwirkungen zwischen Wirten und assoziierten mikrobiellen Gemeinschaften darstellt, wie z.B. zwischen Menschen und ihrer Darmmikrobiota19,20. Darüber hinaus werden Menschen sogar jetzt als Superorganismen betrachtet<sup class="x…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde von der National Nature Science Foundation of China (Nr. 31741109), der Hunan Natural Science Foundation (Nr. 2018JJ3200) und dem Konstruktprogramm der angewandten charakteristischen Disziplin an der Hunan University of Science and Engineering finanziert. Wir danken LetPub (www.letpub.com) für seine sprachliche Unterstützung bei der Erstellung dieses Manuskripts.
Materials
| 0.22 µm membrane filters | Millipore | SLGP033RB | Use to filter samples |
| 0.4-mm Sieve | Thermo Fischer | 308080-99-1 | Use to prepare human fecal samples |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-Gal) | Solarbio | X1010 | Use to prepare color plate |
| Acetic | Sigma-Aldrich | 71251 | Standard sample for SCFA |
| Agar | Solarbio | YZ-1012214 | The component of medium |
| Anaerobic chamber | Electrotek | AW 400SG | Bacteria culture and fermentation |
| Autoclave | SANYO | MLS-3750 | Use to autoclave |
| Bacto soytone | Sigma-Aldrich | 70178 | The component of medium |
| Baking oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | Use to heat and bake |
| Beef Extract | Solarbio | G8270 | The component of medium |
| Bifidobacterium longum Reuter | ATCC | ATCC® 51870™ | Bacteria |
| Bile Salts | Solarbio | YZ-1071304 | The component of medium |
| Butyric | Sigma-Aldrich | 19215 | Standard sample for SCFA |
| CaCl2 | Solarbio | C7250 | Salt solution of medium |
| Capillary column | SHIMADZU-GL | InertCap FFAP (0.25 mm × 30 m × 0.25 μm) | Used to SCFA detection |
| Casein Peptone | Sigma-Aldrich | 39396 | The component of medium |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall ST 8 | Use for centrifugation |
| CoSO4.7H2O | Solarbio | C7490 | The component of medium |
| CuSO4.5H2O | Solarbio | 203165 | The component of medium |
| Cysteine-HCl | Solarbio | L1550 | The component of medium |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | Use to prepare vitamin K1 |
| FeSO4.7H2O | Solarbio | YZ-111614 | The component of medium |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | 399388 | Used to TLC |
| Gas chromatography | Shimadzu Corporation | GC-2010 Plus | Used to SCFA detection |
| Glass beaker | Fisher Scientific | FB10050 | Used for slurry preparation |
| Glucose | Solarbio | G8760 | The component of medium |
| Haemin | Solarbio | H8130 | The component of medium |
| HCl | Sigma-Aldrich | 30721 | Basic solution used to adjust the pH of the buffers |
| Isobutyric | Sigma-Aldrich | 46935-U | Standard sample for SCFA |
| Isovaleric Acids | Sigma-Aldrich | 129542 | Standard sample for SCFA |
| K2HPO4 | Solarbio | D9880 | Salt solution of medium |
| KCl | Solarbio | P9921 | The component of medium |
| KH2PO4 | Solarbio | P7392 | Salt solution of medium |
| LiCl.3H2O | Solarbio | C8380 | Use to prepare color plate |
| Meat Extract | Sigma-Aldrich-Aldrich | 70164 | The component of medium |
| Metaphosphoric Acid | Sigma-Aldrich | B7350 | Standard sample for SCFA |
| MgCl2.6H2O | Solarbio | M8160 | The component of medium |
| MgSO4.7H2O | Solarbio | M8300 | Salt solution of medium |
| MISEQ | Illumina | MiSeq 300PE system | DNA sequencing |
| MnSO4.H20 | Sigma-Aldrich | M8179 | Salt solution of medium |
| Mupirocin | Solarbio | YZ-1448901 | Antibiotic |
| NaCl | Solarbio | YZ-100376 | Salt solution of medium |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | 792519 | Salt solution of medium |
| NanoDrop ND-2000 | NanoDrop Technologies | ND-2000 | Determine DNA concentrations |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 30620 | Basic solution used to adjust the pH of the buffers |
| n-butanol | ChemSpider | 71-36-3 | Used to TLC |
| NiCl2 | Solarbio | 746460 | The component of medium |
| Orcinol | Sigma-Aldrich | 447420 | Used to prepare orcinol reagents |
| Propionic | Sigma-Aldrich | 94425 | Standard sample for SCFA |
| QIAamp DNA Stool Mini Kit | QIAGEN | 51504 | Extract bacterial genomic DNA |
| Ready-to-use PBS powder | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A610100-0001 | Used to prepare the lipid suspension |
| Resazurin | Solarbio | R8150 | Anaerobic Equipment |
| Speed Vacuum Concentrator | LABCONCO | CentriVap | Use to prepare EPSs |
| Starch | Solarbio | YZ-140602 | Use to the carbon source |
| Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 150692 | Used to prepare orcinol reagents |
| T100 PCR | BIO-RAD | 1861096 | PCR amplification |
| TLC aluminium sheets | MerckMillipore | 116835 | Used to TLC |
| Trypticase Peptone | Sigma-Aldrich | Z699209 | The component of medium |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | T7293 | The component of medium |
| Tween 80 | Solarbio | T8360 | Salt solution of medium |
| Valeric | Sigma-Aldrich | 75054 | Standard sample for SCFA |
| Vitamin K1 | Sigma-Aldrich | V3501 | The component of medium |
| Vortex oscillator | Scientific Industries | Vortex.Genie2 | Use to vortexing |
| Yeast Extract | Sigma-Aldrich | Y1625 | The component of medium |
| ZnSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | Z0251 | The component of medium |
References
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