Analyse des interactions entre les endobiotiques et le microbiote intestinal humain à l'aide de systèmes de fermentation in vitro de bain
Summary
Décrit ici est un protocole pour étudier les interactions entre les endobiotiques et le microbiote intestinal humain utilisant des systèmes de fermentation in vitro de lot.
Abstract
Les micro-organismes intestinaux humains sont récemment devenus une cible importante de la recherche dans la promotion de la santé humaine et la prévention des maladies. Par conséquent, les études sur les interactions entre les endobiotiques (p. ex., les médicaments et les prébiotiques) et le microbiote intestinal sont devenues un sujet de recherche important. Cependant, les expériences in vivo avec des volontaires humains ne sont pas idéales pour de telles études en raison de la bioéthique et des contraintes économiques. En conséquence, des modèles animaux ont été utilisés pour évaluer ces interactions in vivo. Néanmoins, les études de modèles animaux sont encore limitées par des considérations de bioéthique, en plus de compositions et de diversités différentes du microbiote chez les animaux par rapport aux humains. Une autre stratégie de recherche est l’utilisation d’expériences de fermentation par lots qui permettent d’évaluer les interactions entre les endobiotiques et le microbiote intestinal in vitro. Pour évaluer cette stratégie, les exopolysaccharides bifidobactériens (Bif) ont été utilisés comme xénobiotique représentatif. Ensuite, les interactions entre Bif EPS et le microbiote intestinal humain ont été étudiées à l’aide de plusieurs méthodes telles que la chromatographie à couches minces (TLC), l’analyse compositionnelle de la communauté bactérienne avec le séquençage à haut débit du gène rRNA 16S et la chromatographie gazeuse. d’acides gras à chaîne courte (SCFA). Présenté ici est un protocole pour étudier les interactions entre les endobiotiques et le microbiote intestinal humain à l’aide de systèmes de fermentation par lots in vitro. Fait important, ce protocole peut également être modifié pour étudier les interactions générales entre d’autres endobiotiques et le microbiote intestinal.
Introduction
Le microbiote intestinal joue un rôle important dans le fonctionnement des intestins humains et dans la santé de l’hôte. Par conséquent, le microbiote intestinal est récemment devenu une cible importante pour la prévention et la thérapie des maladies1. En outre, les bactéries intestinales interagissent avec les cellules intestinales hôtes et régulent les processus fondamentaux de l’hôte, y compris les activités métaboliques, les disponibilités nutritives, la modulation du système immunitaire, et même la fonction cérébrale et la prise de décision2,3 . Les endobiotiques ont un potentiel considérable pour influencer la composition bactérienne et la diversité du microbiote intestinal. Ainsi, les interactions entre les endobiotiques et le microbiote intestinal humain ont attiré l’attention croissante de la recherche4,5,6,7,8,9.
Il est difficile d’évaluer in vivo les interactions entre les endobiotiques et le microbiote intestinal humain en raison de la bioéthique et des contraintes économiques. Par exemple, des expériences sur les interactions entre les endobiotiques et le microbiote intestinal humain ne peuvent être réalisées sans la permission de la Food and Drug Administration, et le recrutement de volontaires coûte cher. Par conséquent, les modèles animaux sont souvent utilisés pour de telles enquêtes. Cependant, l’utilisation de modèles animaux est limitée en raison de différentes compositions de microbiotes et de la diversité dans les communautés associées aux animaux par rapport à l’homme. Une autre méthode in vitro pour explorer les interactions entre les endobiotiques et le microbiote intestinal humain est l’utilisation d’expériences de culture par lots.
Les exopolysaccharides (EPS) sont des prébiotiques qui contribuent de manière significative au maintien de la santé humaine10. Les EPS distincts qui se composent de différentes compositions et structures monosaccharides peuvent présenter des fonctions distinctes. Des analyses antérieures ont déterminé la composition des EPS Bif, qui sont le xénobiotique représentatif visé dans la présente étude11. Cependant, les effets métaboliques associés à l’hôte n’ont pas été pris en considération en ce qui concerne la composition et la diversité de l’EPS.
Le protocole décrit ici utilise le microbiote fécal de 12 volontaires pour fermenter les EPS Bif. La chromatographie à couches minces (TLC), le séquençage à haut débit du gène 16S rRNA et la chromatographie gazeuse (GC) sont ensuite utilisés en combinaison pour étudier les interactions entre les SPE et le microbiote intestinal humain. Les avantages distincts de ce protocole par rapport aux expériences in vivo sont son faible coût et l’évitement des effets d’interférence du métabolisme de l’hôte. En outre, le protocole décrit peut être utilisé dans d’autres études qui étudient les interactions entre les endobiotiques et le microbiote intestinal humain.
Protocol
Representative Results
Discussion
Des progrès significatifs ont été réalisés vers la compréhension de la composition et des activités du microbiote intestinal humain au cours de la dernière décennie. À la suite de ces études, le concept holobiont a émergé, qui représente les interactions entre les hôtes et les communautés microbiennes associées, comme entre les humains et leur microbiote intestinal19,20. En outre, les humains sont même maintenant considérés comme des super-org…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été financée par la National Nature Science Foundation of China (no 31741109), la Hunan Natural Science Foundation (no 2018JJJ300) et le programme de construction de la discipline caractéristique appliquée à l’Université des sciences et de l’ingénierie du Hunan. Nous remercions LetPub (www.letpub.com) pour son aide linguistique lors de la préparation de ce manuscrit.
Materials
| 0.22 µm membrane filters | Millipore | SLGP033RB | Use to filter samples |
| 0.4-mm Sieve | Thermo Fischer | 308080-99-1 | Use to prepare human fecal samples |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-Gal) | Solarbio | X1010 | Use to prepare color plate |
| Acetic | Sigma-Aldrich | 71251 | Standard sample for SCFA |
| Agar | Solarbio | YZ-1012214 | The component of medium |
| Anaerobic chamber | Electrotek | AW 400SG | Bacteria culture and fermentation |
| Autoclave | SANYO | MLS-3750 | Use to autoclave |
| Bacto soytone | Sigma-Aldrich | 70178 | The component of medium |
| Baking oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | Use to heat and bake |
| Beef Extract | Solarbio | G8270 | The component of medium |
| Bifidobacterium longum Reuter | ATCC | ATCC® 51870™ | Bacteria |
| Bile Salts | Solarbio | YZ-1071304 | The component of medium |
| Butyric | Sigma-Aldrich | 19215 | Standard sample for SCFA |
| CaCl2 | Solarbio | C7250 | Salt solution of medium |
| Capillary column | SHIMADZU-GL | InertCap FFAP (0.25 mm × 30 m × 0.25 μm) | Used to SCFA detection |
| Casein Peptone | Sigma-Aldrich | 39396 | The component of medium |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall ST 8 | Use for centrifugation |
| CoSO4.7H2O | Solarbio | C7490 | The component of medium |
| CuSO4.5H2O | Solarbio | 203165 | The component of medium |
| Cysteine-HCl | Solarbio | L1550 | The component of medium |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | Use to prepare vitamin K1 |
| FeSO4.7H2O | Solarbio | YZ-111614 | The component of medium |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | 399388 | Used to TLC |
| Gas chromatography | Shimadzu Corporation | GC-2010 Plus | Used to SCFA detection |
| Glass beaker | Fisher Scientific | FB10050 | Used for slurry preparation |
| Glucose | Solarbio | G8760 | The component of medium |
| Haemin | Solarbio | H8130 | The component of medium |
| HCl | Sigma-Aldrich | 30721 | Basic solution used to adjust the pH of the buffers |
| Isobutyric | Sigma-Aldrich | 46935-U | Standard sample for SCFA |
| Isovaleric Acids | Sigma-Aldrich | 129542 | Standard sample for SCFA |
| K2HPO4 | Solarbio | D9880 | Salt solution of medium |
| KCl | Solarbio | P9921 | The component of medium |
| KH2PO4 | Solarbio | P7392 | Salt solution of medium |
| LiCl.3H2O | Solarbio | C8380 | Use to prepare color plate |
| Meat Extract | Sigma-Aldrich-Aldrich | 70164 | The component of medium |
| Metaphosphoric Acid | Sigma-Aldrich | B7350 | Standard sample for SCFA |
| MgCl2.6H2O | Solarbio | M8160 | The component of medium |
| MgSO4.7H2O | Solarbio | M8300 | Salt solution of medium |
| MISEQ | Illumina | MiSeq 300PE system | DNA sequencing |
| MnSO4.H20 | Sigma-Aldrich | M8179 | Salt solution of medium |
| Mupirocin | Solarbio | YZ-1448901 | Antibiotic |
| NaCl | Solarbio | YZ-100376 | Salt solution of medium |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | 792519 | Salt solution of medium |
| NanoDrop ND-2000 | NanoDrop Technologies | ND-2000 | Determine DNA concentrations |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 30620 | Basic solution used to adjust the pH of the buffers |
| n-butanol | ChemSpider | 71-36-3 | Used to TLC |
| NiCl2 | Solarbio | 746460 | The component of medium |
| Orcinol | Sigma-Aldrich | 447420 | Used to prepare orcinol reagents |
| Propionic | Sigma-Aldrich | 94425 | Standard sample for SCFA |
| QIAamp DNA Stool Mini Kit | QIAGEN | 51504 | Extract bacterial genomic DNA |
| Ready-to-use PBS powder | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A610100-0001 | Used to prepare the lipid suspension |
| Resazurin | Solarbio | R8150 | Anaerobic Equipment |
| Speed Vacuum Concentrator | LABCONCO | CentriVap | Use to prepare EPSs |
| Starch | Solarbio | YZ-140602 | Use to the carbon source |
| Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 150692 | Used to prepare orcinol reagents |
| T100 PCR | BIO-RAD | 1861096 | PCR amplification |
| TLC aluminium sheets | MerckMillipore | 116835 | Used to TLC |
| Trypticase Peptone | Sigma-Aldrich | Z699209 | The component of medium |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | T7293 | The component of medium |
| Tween 80 | Solarbio | T8360 | Salt solution of medium |
| Valeric | Sigma-Aldrich | 75054 | Standard sample for SCFA |
| Vitamin K1 | Sigma-Aldrich | V3501 | The component of medium |
| Vortex oscillator | Scientific Industries | Vortex.Genie2 | Use to vortexing |
| Yeast Extract | Sigma-Aldrich | Y1625 | The component of medium |
| ZnSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | Z0251 | The component of medium |
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