تحليل التفاعلات بين بطانة الرحم وميكروبيوتا الأمعاء البشرية باستخدام أنظمة تخمير الحمام في المختبر
Summary
يوصف هنا هو بروتوكول للتحقيق في التفاعلات بين بطانة الرحم وميكروبيوتا الأمعاء البشرية باستخدام أنظمة التخمير دفعة في المختبر.
Abstract
وقد أصبحت الكائنات الحية الدقيقة المعوية البشرية في الآونة الأخيرة هدفا هاما للبحوث في مجال تعزيز صحة الإنسان والوقاية من الأمراض. وبالتالي، أصبحت التحقيقات في التفاعلات بين الاندوبايوتكس (مثل الأدوية والبريبايوتكس) وميكروبيوتا الأمعاء موضوعا ً بحثيًا مهمًا. ومع ذلك، في التجارب الحية مع المتطوعين الإنسان ليست مثالية لمثل هذه الدراسات بسبب أخلاقيات البيولوجيا والقيود الاقتصادية. ونتيجة لذلك، تم استخدام النماذج الحيوانية لتقييم هذه التفاعلات في الجسم الحي. ومع ذلك، لا تزال الدراسات النموذجية الحيوانية محدودة باعتبارات أخلاقيات البيولوجيا، بالإضافة إلى اختلاف التراكيب والتنوعات في الكائنات الحية الدقيقة في الحيوانات مقابل البشر. استراتيجية بحثية بديلة هي استخدام تجارب التخمير الدفعية التي تسمح بتقييم التفاعلات بين بطانة الرحم وميكروبيوتا الأمعاء في المختبر. لتقييم هذه الاستراتيجية، تم استخدام ثنائي ة البكتيريا (بيف) اكسوبوليساكاريدس (EPS) كممثل xenobiotic. ثم، تم التحقيق في التفاعلات بين Eps BIF وميكروبيوتا الأمعاء البشرية باستخدام عدة طرق مثل الكروماتوغرافيا رقيقة الطبقة (TLC)، والتحليل التركيبي المجتمعي البكتيري مع تسلسل الإنتاجية العالية 16S rRNA، والكروماتوغرافيا الغازية من الأحماض الدهنية قصيرة السلسلة (SCFAs). يقدم هنا بروتوكول للتحقيق في التفاعلات بين بطانة الرحم وميكروبيوتا الأمعاء البشرية باستخدام أنظمة التخمير دفعة في المختبر. والأهم من ذلك، يمكن أيضا تعديل هذا البروتوكول للتحقيق في التفاعلات العامة بين بطانة الرحم الأخرى وميكروبيوتا الأمعاء.
Introduction
تلعب الكائنات المجهرية في الأمعاء دورًا هامًا في أداء الأمعاء البشرية وفي صحة المضيف. وبالتالي، أصبحت ميكروبيوتا الأمعاء مؤخرا هدفا هاما للوقاية من الأمراض والعلاج1. وعلاوة على ذلك، تتفاعل بكتيريا الأمعاء مع الخلايا المعوية المضيفة وتنظم العمليات الأساسية المضيفة، بما فيذلك الأنشطة الأيضية، وتوافر المواد الغذائية، وتعديل الجهاز المناعي، وحتى وظيفة الدماغ وصنع القرار 2،3 . إن بطانة الرحم لديها إمكانات كبيرة للتأثير على التركيب البكتيري وتنوع ميكروبيوتا الأمعاء. وهكذا، جذبت التفاعلات بين بطانة الرحم وميكروبيوتاالأمعاء البشرية زيادة الاهتمام البحثي 4،5،6،7،8،9.
من الصعب تقييم التفاعلات بين الانبوبيوتكس وميكروبيوتا الأمعاء البشرية في الجسم الحي بسبب أخلاقيات البيولوجيا والقيود الاقتصادية. على سبيل المثال، لا يمكن إجراء التجارب التي تحقق في التفاعلات بين بطانة الرحم وميكروبيوتا الأمعاء البشرية دون إذن من إدارة الغذاء والدواء، وتوظيف المتطوعين مكلف. وبالتالي، كثيرا ما تستخدم النماذج الحيوانية لمثل هذه التحقيقات. ومع ذلك، فإن استخدام النماذج الحيوانية محدود بسبب اختلاف التراكيب المجهرية والتنوع في المجتمعات الحيوانية مقابل المجتمعات المرتبطة بالإنسان. وهناك طريقة بديلة في المختبر لاستكشاف التفاعلات بين بطانة الرحم وميكروبيوتا الأمعاء البشرية من خلال استخدام تجارب الثقافة دفعة.
إكسوبوليساكاريدس (EPSS) هي البريبايوتكس التي تسهم بشكل كبير في الحفاظ على صحة الإنسان10. يمكن أن تظهر EPSs المتميزة التي تتكون من تركيبات وهياكل أحادية السكريات وظائف متميزة. وقد حددت التحليلات السابقة تكوين BIF EPSs، والتي هي xenobiotic ممثل المستهدفة في الدراسة الحالية11. ومع ذلك، لم يتم النظر في الآثار الأيضية المرتبطة بالمضيف فيما يتعلق بتكوين EPS والتنوع.
يستخدم البروتوكول الموضح هنا الميكروبيوتا البرازية من 12 متطوعًا لتخمير الـ Bif EPSs. ثم يتم استخدام الكروماتوغرافيا ذات الطبقة الرقيقة (TLC)، وتسلسل الجينات ذات الإنتاجية العالية 16S rRNA، والكروماتوغرافيا الغازية (GC) في تركيبة للتحقيق في التفاعلات بين EPSs وميكروبيوتا الأمعاء البشرية. مزايا متميزة من هذا البروتوكول بالمقارنة مع التجارب في الجسم الحي هي انخفاض تكلفته وتجنب آثار التدخل من التمثيل الغذائي للمضيف. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام البروتوكول الموصوف في دراسات أخرى تحقق في التفاعلات بين بطانة الرحم وميكروبيوتا الأمعاء البشرية.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد أحرز تقدم كبير نحو فهم تكوين ميكروبيوتا الأمعاء البشرية وأنشطتها على مدى العقد الماضي. ونتيجة لهذه الدراسات، ظهر مفهوم الهولوبيوت، الذي يمثل التفاعلات بين المضيفين والمجتمعات الميكروبية المرتبطة بها، كما هو الحال بين البشر وميكروبيوتا الأمعاء19،20. وع…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذه الدراسة من قبل المؤسسة الوطنية لعلوم الطبيعة في الصين (رقم 31741109)، ومؤسسة هونان للعلوم الطبيعية (رقم 2018JJ3200)، وبرنامج بناء الانضباط المميز التطبيقي في جامعة هونان للعلوم والهندسة. نشكر ليتبوب (www.letpub.com) على مساعدتها اللغوية أثناء إعداد هذه المخطوطة.
Materials
| 0.22 µm membrane filters | Millipore | SLGP033RB | Use to filter samples |
| 0.4-mm Sieve | Thermo Fischer | 308080-99-1 | Use to prepare human fecal samples |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-Gal) | Solarbio | X1010 | Use to prepare color plate |
| Acetic | Sigma-Aldrich | 71251 | Standard sample for SCFA |
| Agar | Solarbio | YZ-1012214 | The component of medium |
| Anaerobic chamber | Electrotek | AW 400SG | Bacteria culture and fermentation |
| Autoclave | SANYO | MLS-3750 | Use to autoclave |
| Bacto soytone | Sigma-Aldrich | 70178 | The component of medium |
| Baking oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | Use to heat and bake |
| Beef Extract | Solarbio | G8270 | The component of medium |
| Bifidobacterium longum Reuter | ATCC | ATCC® 51870™ | Bacteria |
| Bile Salts | Solarbio | YZ-1071304 | The component of medium |
| Butyric | Sigma-Aldrich | 19215 | Standard sample for SCFA |
| CaCl2 | Solarbio | C7250 | Salt solution of medium |
| Capillary column | SHIMADZU-GL | InertCap FFAP (0.25 mm × 30 m × 0.25 μm) | Used to SCFA detection |
| Casein Peptone | Sigma-Aldrich | 39396 | The component of medium |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall ST 8 | Use for centrifugation |
| CoSO4.7H2O | Solarbio | C7490 | The component of medium |
| CuSO4.5H2O | Solarbio | 203165 | The component of medium |
| Cysteine-HCl | Solarbio | L1550 | The component of medium |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | Use to prepare vitamin K1 |
| FeSO4.7H2O | Solarbio | YZ-111614 | The component of medium |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | 399388 | Used to TLC |
| Gas chromatography | Shimadzu Corporation | GC-2010 Plus | Used to SCFA detection |
| Glass beaker | Fisher Scientific | FB10050 | Used for slurry preparation |
| Glucose | Solarbio | G8760 | The component of medium |
| Haemin | Solarbio | H8130 | The component of medium |
| HCl | Sigma-Aldrich | 30721 | Basic solution used to adjust the pH of the buffers |
| Isobutyric | Sigma-Aldrich | 46935-U | Standard sample for SCFA |
| Isovaleric Acids | Sigma-Aldrich | 129542 | Standard sample for SCFA |
| K2HPO4 | Solarbio | D9880 | Salt solution of medium |
| KCl | Solarbio | P9921 | The component of medium |
| KH2PO4 | Solarbio | P7392 | Salt solution of medium |
| LiCl.3H2O | Solarbio | C8380 | Use to prepare color plate |
| Meat Extract | Sigma-Aldrich-Aldrich | 70164 | The component of medium |
| Metaphosphoric Acid | Sigma-Aldrich | B7350 | Standard sample for SCFA |
| MgCl2.6H2O | Solarbio | M8160 | The component of medium |
| MgSO4.7H2O | Solarbio | M8300 | Salt solution of medium |
| MISEQ | Illumina | MiSeq 300PE system | DNA sequencing |
| MnSO4.H20 | Sigma-Aldrich | M8179 | Salt solution of medium |
| Mupirocin | Solarbio | YZ-1448901 | Antibiotic |
| NaCl | Solarbio | YZ-100376 | Salt solution of medium |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | 792519 | Salt solution of medium |
| NanoDrop ND-2000 | NanoDrop Technologies | ND-2000 | Determine DNA concentrations |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 30620 | Basic solution used to adjust the pH of the buffers |
| n-butanol | ChemSpider | 71-36-3 | Used to TLC |
| NiCl2 | Solarbio | 746460 | The component of medium |
| Orcinol | Sigma-Aldrich | 447420 | Used to prepare orcinol reagents |
| Propionic | Sigma-Aldrich | 94425 | Standard sample for SCFA |
| QIAamp DNA Stool Mini Kit | QIAGEN | 51504 | Extract bacterial genomic DNA |
| Ready-to-use PBS powder | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A610100-0001 | Used to prepare the lipid suspension |
| Resazurin | Solarbio | R8150 | Anaerobic Equipment |
| Speed Vacuum Concentrator | LABCONCO | CentriVap | Use to prepare EPSs |
| Starch | Solarbio | YZ-140602 | Use to the carbon source |
| Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 150692 | Used to prepare orcinol reagents |
| T100 PCR | BIO-RAD | 1861096 | PCR amplification |
| TLC aluminium sheets | MerckMillipore | 116835 | Used to TLC |
| Trypticase Peptone | Sigma-Aldrich | Z699209 | The component of medium |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | T7293 | The component of medium |
| Tween 80 | Solarbio | T8360 | Salt solution of medium |
| Valeric | Sigma-Aldrich | 75054 | Standard sample for SCFA |
| Vitamin K1 | Sigma-Aldrich | V3501 | The component of medium |
| Vortex oscillator | Scientific Industries | Vortex.Genie2 | Use to vortexing |
| Yeast Extract | Sigma-Aldrich | Y1625 | The component of medium |
| ZnSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | Z0251 | The component of medium |
References
- Maarten, V. D. G., Blottière Hervé, M., Doré, J. Humans as holobionts: implications for prevention and therapy. Microbiome. 6 (1), 81 (2018).
- Allen, A. P., Dinan, T. G., Clarke, G., Cryan, J. F. A psychology of the human brain-gut-microbiome axis. Social and Personality Psychology Compass. 11 (4), e12309 (2017).
- Arora, T., Bäckhed, F. The gut microbiota and metabolic disease: current understanding and future perspectives. Journal of Internal Medicine. 280, 39-349 (2016).
- Maurice, C., Haiser, H., Turnbaugh, P. Xenobiotics shape the physiology and gene expression of the active human gut microbiome. Cell. 152 (1-2), 39-50 (2013).
- Carmody, R. N., Turnbaugh, P. J. Host-microbial interactions in the metabolism of therapeutic and diet-derived xenobiotics. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4173-4181 (2014).
- Lu, K., Mahbub, R., Fox, J. G. Xenobiotics: interaction with the intestinal microflora. ILAR Journal. 56 (2), 218-227 (2015).
- Taguer, M., Maurice, C. The complex interplay of diet, xenobiotics, and microbial metabolism in the gut: implications for clinical outcomes. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 99 (6), 588-599 (2016).
- Anubhav, D., Meenakshi, S., Shankar, G. T., Mande, S. S., Wilson, B. A. Xenobiotic metabolism and gut microbiomes. PLoS One. 11 (10), e0163099 (2016).
- Koppel, N., Rekdal, V. M., Balskus, E. P. Chemical transformation of xenobiotics by the human gut microbiota. Science. 356 (6344), 1246-1257 (2017).
- Hidalgo-Cantabrana, C., et al. Genomic overview and biological functions of exopolysaccharide biosynthesis in Bifidobacterium spp. Applied and Environmental Microbiology. 80 (1), 9-18 (2014).
- Liu, G., et al. Effects of bifidobacteria-produced exopolysaccharides on human gut microbiota in vitro. Applied Microbiology and Biotechnology. , 1-10 (2018).
- Tang, R., et al. Gut microbial profile is altered in primary biliary cholangitis and partially restored after UDCA therapy. Gut. 67 (3), 534-541 (2018).
- Kuczynski, J., et al. Using QIIME to analyze 16S rRNA gene sequences from microbial communities. Current Protocols in Microbiology. 27 (1), 1-28 (2012).
- Hiltemann, S. D., Boers, S. A., van der Spek, P. J., Jansen, R., Hays, J. P., Stubbs, A. P. Galaxy mothur Toolset (GmT): a user-friendly application for 16S rRNA gene sequencing analysis using mothur. GigaScience. , (2018).
- Wang, Q., Garrity, G. M., Tiedje, J. M., Cole, J. R. Naïve Bayesian classifier for rapid assignment of rRNA sequences into the new bacterial taxonomy. Applied and Environmental Microbiology. 73 (16), 5261-5267 (2007).
- Schloss, P. D., et al. Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology. 75 (23), 7537-7541 (2009).
- Bai, S., et al. Comparative study on the in vitro effects of pseudomonas aeruginosa and seaweed alginates on human gut microbiota. Plos One. 12 (2), e0171576 (2017).
- Zhang, Z., Xie, J., Zhang, F., Linhardt, R. J. Thin-layer chromatography for the analysis of glycosaminoglycan oligosaccharides. Analytical Biochemistry. 371, 118-120 (2007).
- Simon, J. C., Marchesi, J. R., Mougel, C., Selosse, M. A. Host-microbiota interactions: from holobiont theory to analysis. Microbiome. 7 (5), (2019).
- Postler, T. S., Ghosh, S. Understanding the Holobiont: how microbial metabolites affect human health and shape the immune system. Cell Metabolism. 26 (1), 110-130 (2017).
- Kramer, P., Bressan, P. Humans as superorganisms: how microbes, viruses, imprinted genes, and other selfish entities shape our behavior. Perspectives on Psychological Science. 10 (4), 464-481 (2015).
- Malfertheiner, P., Nardone, G. Gut microbiota: the forgotten organ. Digestive Diseases. 29 (6), (2011).
- Andoh, A. The gut microbiota is a new organ in our body. The Japanese journal of Gastro-Enterology. 112 (11), 1939-1946 (2015).
- Mika, A., Van, W. T., González, A., Herrera, J. J., Knight, R., Fleshner, M. Exercise is more effective at altering gut microbial composition and producing stable changes in lean mass in juvenile versus adult male f344 rats. PLoS One. 10 (5), e0125889 (2015).
- Hugenholtz, F., de Vos, W. M. Mouse models for human intestinal microbiota research: a critical evaluation. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (1), 149-160 (2018).
- Takagi, R., et al. A single-batch fermentation system to simulate human colonic microbiota for high-throughput evaluation of prebiotics. PLoS One. 11 (8), e0160533 (2016).
- Ning, T., Gong, X., Xie, L., Ma, B. Gut microbiota analysis in rats with methamphetamine-induced conditioned place preference. Frontiers in Microbiology. 8 (1), 1620 (2017).
