Hasta Biofluidinde tümör Ilişkili sirkülasyon DNA 'Sı tespiti ve Izlenmesi

Burada açıklanan tüm yöntemler California San Francisco Üniversitesi Kurumsal Inceleme Kurulu tarafından onaylanmıştır (San Francisco, CA; IRB #14-13895) ve çocuk ulusal sağlık sistemi (Washington, D.C.; IRB #1339). Örneklerin toplanması ve hasta veya hastanın velisi bilgilendirilmiş onay aldıktan sonra incelenmiştir. 1. biyolojik numunelerin toplanması ve saklanması için ıRB protokolünün altında hüküm yapan hastalar Her hasta veya hastanın velisi, ilgili kurumsal Inceleme Kurulu tarafından onaylanmış bir klinik deneme veya biorepository katılım için yazılı bilgilendirilmiş onay alındıktan sonra hasta örneklerini toplayın. Bu çalışmada bulunan hastalar radyografi ile beyin tümörü tanısı konuldu. Hiçbir dışlama ölçütü kullanıldı. Örneklerin toplanması ve hasta veya hastanın velisi bilgilendirilmiş onay aldıktan sonra incelenmiştir. 2. kan toplama ve plazma veya serum ayrılması Kan toplama tüplerine bir 10,0 mL çizmek kullanarak kandaki numuneyi toplayın. Plazma için kan toplama, K2-veya k3-EDTA tüpler, heparin veya cfdna kan toplama tüpleri kullanın. Serum için kan toplama, pıhtılaşma aktivatörü ve ayrı serum jel içeren jel bariyer tüpler kullanın.Not: 10 mL çoğaltır denemeleri etkinleştirmek için tavsiye edilirken, en az 3 mL yeterli olacaktır. Dikkatli bir şekilde toplama tüpünü ters çevir 10 kez toplama tüp reaktifler ile kan örneği karıştırmak için. Serum, kan pıhtısına izin vermek için oda sıcaklığında 30 dakika içinde toplanacak olan kan örneklerini bırakın. Eğer kan işleme plazma elde etmek için, adım 2,4 hemen ilerleyin.Not: Plazma için işlenmiş numuneler santrifüjleme öncesinde en fazla 2 saat buz üzerinde tutulabilir. Ancak, kan çekmek için hızlı bir geçiş işleme cfDNA düşüşü en aza indirir. Santrifüjte kan toplama tüpleri 2.000 x g ‘de 15 dakika santrifüj olarak 4 °c ‘ ye ayarlı plazma veya serum beyaz ve kırmızı kan hücresi katmanlarından ayırmak için. Beyaz kan hücresi tabakasını rahatsız etmemek (üst plazma/serum tabakası ve paketlenmiş kırmızı kan hücrelerinin alt tabakası arasında ince bir çizgi oluşturan), plazma/serum üst katmanını pipet (açık, sarı veya pembe renkte olabilir) 1 mL alquots ‘da eşit Steril Polipropilen vida-Cap kriyovials içine. Konu kimlik numarasını, numune tipini (plazma veya serum) ve toplama tarihini kriyovilerin etiketine kaydedin. -80 °C ‘ deki dondurucuyu kullanıma kadar saklayın. A-80 °C dondurucu mevcut değilse, örnekleri-20 °C ‘ de bir haftaya kadar saklayın. 3. CSF toplama ve Işleme Bir şant, lomber delinme veya ameliyattan CSF toplayın.Not: Bu tür prosedürler sadece klinisyenler tarafından gerekli görülürse yapılmalıdır. Klinik kullanım için gerekli olan ek numunenin ötesinde araştırma amacıyla kullanılabilir. Toplanan CSF hacmini ölçün ve rengini not edin (kanlı, sarı, net). 10.000 x g ‘de toplama tüpünü 4 °c ‘ de 10 dakika boyunca santrifüj ederek hücresel enkaz Pelet. CSF süpernatant 500 μL plakaya Polipropilen vida kapağı kriyovials içine eşit transfer. Konu kimlik numarasını, numune tipini ve numune toplama tarihini kriyovilerin etiketiyle kaydedin. Kullanıma kadar-80 °C ‘ de saklayın. 4. sıvı örneklerden cfDNA ekstraksiyonu Cfdna ekstraksiyon seti el kitabı12’ deki yönergelere göre CFD çıkarma protokolünü gerçekleştirin. % 10 çamaşır suyu ve% 70 etanol ile tezgah alanı ve ekipman temizleyin.Not: Bir PCR kaput kullanımı, eldiven düzenli değişen ve tezgah alanı ve ekipman sık dekontaminasyon 10% çamaşır suyu ve 70% etanol protokolün tüm adımlar sırasında örnek kontaminasyonu önlemek için önemlidir. Çapraz kontaminasyon önlemek için ekstraksiyon kiti, örneğin, yıkama tamponları, reaktiflerin plakaya hazırlayın. Çıkarma başlamadan önce hasta örneklerini buzda çözün. Plazma/serum için, numune 1 ml kısım çözüyor. CSF için, çözülme 500 μL örnekteki alquot.Not: Ekstraksiyon protokolünün liziz adımları (4.5-4.8) plazma/serum ve CSF arasında farklılık gösterir, ancak adım 4,9 den itibaren, protokol her iki biofluid türü için aynıdır. Lizis adımı sırasında kullanım için 60 °C ‘ ye bir ısıtma bloğu ayarlayın (4,6). Liziz tamponu ve Carrier RNA karışımını 15 ml ‘lik bir tüpte, 5,6 μL Carrier RNA ve 0,9 ml lizis buffer örneği için12ekleyerek hazırlayın. Plazma/serum için 100 μL proteinaz K, 1 ml örnek ve 0,8 ml lizis buffer/Carrier RNA karışımı, adım 4,4 ‘ de etiketli bir 2,0 ml tüpüne eklenir. Yüksek hızda 30 s için nabız vortekslenir tarafından Mix12. CSF için, 125 μL proteinaz K, 500 μL, 1 mL liziz tampon/taşıyıcı RNA karışımı ve 2,0 mL tüpüne 250 μL doku liziz tamponu ekleyin. 125 μL 1x fosfat-tamponlu tuz (PBS) ekleyerek 2 mL ‘ye kadar tam hacim getirin. Yüksek hızda 30 s için nabız vortekslenir tarafından Mix12. Isıtma bloğu12’ de 60 °c ‘ de 30 dakika için numuneleri Inküye. Isıtma bloğundan numuneleri çıkarın ve sıcaklığı 56 °C ‘ ye indirin. Numuneleri banka dönün ve lysate ‘yi yeni etiketli 15 mL tüplere aktarın. Plazma/serum için, 1,8 mL nüklik asit bağlayıcı tamponu ekleyin ve 30 s için darbe voroserleme12′ ye karıştırın. CSF için, 3,6 mL nüklik asit bağlama tamponu ekleyin ve 30 s için karışım12Pulse vorfatleme Örnekler, buz12’ de 5 dk. Sütunu vakum konektörüne takın. Sütunu açın ve12sütununa 20 ml ‘lik bir tüp Extender ekleyin. Tüp Extender duvarlarında damlacıklar bırakarak kaçınarak, tüp Extender altına doğrudan 15 mL tüp içeriğini pipet. Vakum konnektörü kapalıyken, vakum pompası üzerinde geçiş yapın. Basınç 900 mbar ‘a kurulduktan sonra, vakum konektörünün vanasını açın. Örnek şimdi sütun üzerinden akacak. Tüm lysate sütundan boşaltıldı sonra, pompa kapatın ve vakum konektörü için kapı açmak, basınç gradyan giderici. Basınç 0 mbar ulaştığında, vakum konnektörü ve trapdoor valfi kapatın. 20 mL tüp Extender ‘ı, bu örnekleri çapraz-kontamine gibi bir sütun bir komşu sütun üzerinde Extender geçmesi dikkatli olmak kaldırın. Tüp Extender ‘ı atın. Ekleme 600 μL ilk yıkama arabelleği sütun12. Tüplerin kapakları açık bırakın ve vakum pompası açın. Basınç ölçer 900 mbar ulaşmasına izin, sonra sütun üzerinden yıkama tampon çizmek için açık konumuna vakum konnektörünün anahtarı açın. Vakum Pompası kapatın, basınç serbest bırakmak için kapı açın ve 0 mbar basıncı rahatlatmak. Vakum konektörünün vanasını kapalı konuma getirin. Sütun için ikinci yıkama arabelleği 750 μL ekleyin ve 4.16-4,1712arasındaki adımları yineleyin. Sütun için 750 μL MB dereceli etanol ekleyin ve 4.16-4,1712arasındaki adımları yineleyin. Sütunun kapağını kapatın ve sütunu yeni bir 2,0 mL toplama tüpünün içine yerleştirin. Vakum konektörünün bertaraf edilmesi12. 20.000 x g cinsinden sütun ile tüp Santrifüjü oda sıcaklığında 3 dakika12. Yeni bir koleksiyon tüpü içine sütun yerleştirin ve tüp kapağını açın. Üst üste bir laboratuar dokusu yerleştirin ve 56 °C ‘ de 10 dk12için Inküye yapın. Sütunu temiz 1,5 ml PCR-Clean tüp ve pipet 100 μL elüsyon tampon (veya moleküler biyoloji sınıfı h2o (MB h2o)) doğrudan sütunun ortasına yerleştirin. Bir pipet ucu ile sütuna dokunmayın. Kapağı kapatın ve oda sıcaklığında 3 dakika bırakın. 20.000 x g ‘de Santrifüjü oda sıcaklığında 1 dakika için elute cfdna12. Tekrar sütuna geri pipette ve 3 dakika oda sıcaklığında inküye. Santrifüjünü tam hızda tekrarlayın (üreticinin tavsiyesine göre), verimi artırmak için ikinci kez cfDNA ‘yı 1 dakika boyunca elüt edin. CfDNA ‘Yı 4 °C ‘ de etiketli DNase/RNase ücretsiz PCR-Clean tüplerinde saklayın veya doğrudan adım 5 ‘ e geçin. 5. cfDNA vakum konsantrasyonu Vakum konsantratördeki tutucuların içine eltilmiş cfDNA içeren tüpleri takın ve dengeleyin. Tüplerin kapakları açık. Vakum konsantratörün sıcaklığını 23 °C ‘ ye ayarlayın. Vakum konsantratörü açın, sonra buhar tuzağı açın. 40 dk veya 10.5-11 μL son hacmine kadar Santrifüjü örnekleri ulaşılır. Hacim 10,5 μL altında ise, 10,5 μL son hacmine ulaşmak için DNA süspansiyon tamponu veya MB H2O ekleyin. Kalan DNA parçalarını çıkarmak için tüpün duvarları boyunca tam hacmi pipet. Tüplerin duvarlarında damlacıklar toplamak için bir masa santrifüjinde örnekleri kısaca santrifüjler. Doğrudan ön amplifikasyon adımına (adım 8) veya 4 °C ‘ de depolama örneklerine geçin. Daha sonra kullanım için depolanırsa kontaminasyonu önlemek için bir laboratuar filminde tüpler kapakları sarma. 6. astar ve probların tasarımı ve hazırlanması İlgi hedef (ler) için ileri ve ters astar ve wildtype ve mutant LNA probları tasarım. Ticari olarak liyofilize astar ve problar (bkz. malzeme tablosu).Not: H3F3A p. K27M ve Pediatrik orta çizgi gliomlar için diğer hedef mutasyonları hedefleyen astar ve problar Için diziler Panditharatna ve ark., 20188’ in tamamlayıcı tablo 3 ‘ te bulunabilir. Liyofilize astar ve sondaları açmadan önce, tüpleri kısaca santrifüjler. DNA süspansiyon tampon veya MB H2O uygun hacmi ekleyin, ürün spesifikasyonu sayfasında belirtildiği gibi, 100 μM konsantrasyonuna liyofilize astar ve probları yeniden pelletini. Hafifçe girdap, pipet yukarı ve aşağı birkaç kez mix ve kısaca santrifüjler ve prob kullanarak bir masa Santrifüjü. 90 μL DNA süspansiyon tamponunu veya MB H2O ‘Ya 10 μl 100 μm stok ekleyerek 10 μm astar ve problar hazırlayın. 90 μL DNA süspansiyon tamponunu veya MB H2O ‘Ya 10 μm astar eklenerek, 1 μm ileri ve ters astar (ön amplifikasyon için kullanılmak üzere). Astar ve sondaları hava geçirmez koyu kaplarda 4 °C ‘ de saklayın. Kontaminasyonu önlemek için kapaklar etrafında laboratuvar filmi Wrap ve ışığa maruz kalmasını önlemek için alüminyum folyo prob kapak. Uzun süreli depolama için-20 °C ‘ de düzenli olarak kullanılmakta olmayan problar saklayın. 7. pozitif kontroller seçimi Tümör dokusu genomik DNA (gDNA) numunesi (ler), bilinen bir allelik frekansdaki ilgi mutasyonunu olumlu bir kontrol olarak kullanılacak olan DNA konsantrasyonu ile seçin. Ön amplifikasyon adımında pozitif kontrol tümör dokusu DNA ‘Sı 0,025 ng kullanın (adım 8).Not: Bu DNA girişi, dPCR üzerinde sağlam bir pozitif sinyal sağlar (gibi H3F3A p. K27M mutasyonu kullanarak tümör dokusu gdna seri dilüsyonları gerçekleştirerek belirlenir8) gerekli numune miktarını minimize ederken. 8. hedef alleles ‘in ön amplifikasyonu Not: Ön amplifikasyon Protokolü Jackson ve al., 201613’ e göre. % 10 çamaşır suyu ve% 70 etanol ile tezgah alanı ve ekipman temizleyin. 1 μM ileri ve ters astar, cfDNA örnekleri, gDNA pozitif kontroller ve DNA polimeraz ana karışımı elde eder ve buzun üzerinde ayarlayın. Aşağıdaki gibi singleplex veya Multiplex önamplifikasyon için istenen sayıda cfDNA örneğini ve pozitif kontrolü önceden yükseltmek için gereken reaktiflerin hacmini hesaplayın: Singleplex ön amplifikasyon için (wildtype ve mutant alelleri ‘i tek bir ilgi mutasyonu için önceden yükseltmek), 17,5 μL DNA polimeraz ana karışımı ekleyerek PCR reaksiyon karışımını hazırlayın ve örnek13başına 3,5 μL ileri ve ters astar (100 Nm) girin. Multiplex ön amplifikasyon için (iki adet wildtype ve mutant alelleri setinin iki mutasyona uğratılması için), örnek başına 17,5 μL DNA polimeraz ana karışımı ve her bir ileri ve ters astar (50 Nm) kümesi için 1,75 μL ekleyerek PCR reaksiyon karışımını hazırlayın 13olmak üzere.Not: numunelerin sayısı için yeterli PCR reaksiyon karışımını hazırlayın ve herhangi bir pipetleme hatası için% 10 ekstra ilave edin. 8-iyi PCR şerit tüp13her iyi içine PCR reaksiyon karışımı μl 24,5 dispense. Toplam reaksiyon hacmini 35 μL13’ e getirmek Için 10,5 ΜL DNA örneğinden uygun şekilde dispense edilir. Karıştırın için tam ses seviyesini 10 kez yukarı ve aşağı hafifçe pipet atın. 98 °C ‘ de 3 dakika boyunca PCR amplifikasyonu gerçekleştirin; 9 döngü 98 °C için 10 s, tavlama sıcaklığı 3 dakika, 72 °C için 30 s; ve 72 °C ‘ de 2 dk13için bir uzatma. Ön amplifikatörleşmiş ürünün tam hacmini etiketli DNase/RNase ücretsiz PCR-Clean tüplerine ve 140 μL TE DNA süspansiyon tamponunu (pH 8,0)13’ te seyreltmeden aktarın. Laboratuvar filminde tüplerin kapakları sarın. Ön amplifikatörleşmiş ürünü 4 °C ‘ de saklayın. Uzun süreli koruma için-20 °C ‘ de saklayın. 9. dPCR kullanarak hedef DNA ‘nın algılanması ve ölçülmesini % 10 çamaşır suyu ve% 70 etanol ile tezgah alanı ve ekipman temizleyin. 10 μM astar ve problar, Genotipleme ana karışımı ve buz üzerinde DNA örnekleri ayarlayın. Damlacık dengeleyen yağı oda sıcaklığında saklayın. Damlacık stabilize yağ dışında tüm reaktifleri yavaşça girdap ve kısaca santrifüjler. Damlacık üreten cihaza bağlı sıkıştırılmış nitrojen gaz silindirinin ve ölçüm cihazının (malzeme tablosu) 90 psi olarak ayarlandığından emin olun. Cihaz yazılımı ile damla üreten aleti ve bilgisayarı açın. Yazılımı başlatın ve başlatmayı Başlat ‘ı tıklatın. Bir hafta veya daha fazla kullanılmadı Eğer damla üreten enstrüman üzerinde yüksek basınçlı floş çalıştırın. PCR şerit tüpünün 8 kuyuları için dPCR reaksiyonu karışımı artı% 10 ekstra, 220 μL Genotipleme ana karışımı ekleyerek, 8,8 μL her biri 10 μm wildtype ve mutant problar, 39,6 μL her biri 10 μM ileri ve ters astar ve 17,6 μL damlacık stabilizasyon yağı14 . DPCR reaksiyon karışımını, tam ses seviyesini yukarı ve aşağı 10-20 kez pipetleme ile nazikçe karıştırın. Reaksiyon karışımına damlacık stabilizasyon yağı eklendikten sonra Vortex veya santrifüjleme yapmayın. Bir PCR 8-kuyu şeridi tüpü alın ve 38 μL dPCR reaksiyonu karışımı doğrudan her iyi14’ ün altına dağıtın. Temiz pipet ucu ile herhangi bir kabarcıklar çıkarın.Not: Interlocked veya sıkıca birlikte paketlenmiş PCR şerit tüpler statik elektrik şarj neden olabilir, koalescence ve gürültülü sinyal dpcr verileri analiz ederken neden. Bu önlemek için, ayrı biyotehlike torbalar içine kısım şerit tüpler, çanta aşırı paketleme önlemek ve birlikte sürtünme tüpler tutmak. PCR şerit tüpünün uygun kuyularına 12 μL preamplified DNA örneği ekleyin. Negatif denetim için 12 μL MB H2O ekleyin.Not: CfDNA örneklerini çoğaltılan kuyularda analiz edin. CSF için, en azından yinelenen analiz ve plazma/serum triplicate her örnek analiz. Reaksiyonunu DNA örneğiyle karıştırmak için tam ses seviyesini 10 kat yukarı ve aşağı hafifçe pipet atın. Yeni bir damlacık üreten enstrüman çipini edinin ve PCR şerit tüpünün 1-8 kuyularından tam hacmi yongalı ilgili kanallar A-H içine pipet alın. Kanalların alt kısmına pipet ucu ile dokunmaktan kaçının. Yeni bir temiz PCR şerit tüp alın ve damlacık üreten enstrüman içine takın. Tarama veya manuel cihaz bilgisayardaki yazılım içine damlacık üreten enstrüman çip KIMLIĞI girin. 8 kanalın her biri için adlar girin. Dropletizing örnekleri başlatmak için Çalıştır ‘ı tıklatın. Dropletization tamamlandığında, PCR şerit tüp çıkarın ve şerit tüp kapakları uygulayın. Şerit tüpünü termal bisikletçiler ve denge ile 80 μL su içeren başka bir şerit tüpüne aktarın. Termal Bisiklet koşullarını program14 as: 95 °c 10 dk; 45 iki sıcaklık döngüsü: 95 °C 30 s ve tavlama sıcaklığı 2 dakika; 98 °C için 10 dk; ve 10 °C ‘ de tutun. Rampa hızını 0,5 °C/s ‘ye ayarlayın ve numune hacmini 80 μL14olarak ayarlayın. Termal Bisiklet tamamlandığında, şerit tüpünü çıkarın ve ölçüm aletle aktarın. PCR şerit kapakları çıkarın ve yüksek hızlı kapaklar ile değiştirin. Ölçüm cihazı ve bağlı bilgisayarı enstrüman yazılımı ile açın. Enstrüman yazılımını başlatın ve Kur ‘U Çalıştır’ı tıklatın. Şerit tüpünü ölçüm cihazının içine yerleştirin. Yeni bir ölçüm aleti çipini edinin ve çip KIMLIĞINI elle tarayın veya manuel olarak girin. Yongası makineye takın. Metal kalkanı çipin üstüne yerleştirin ve cihazın kapağını kapatın. Bilgisayar yazılımında, dPCR çalıştırmak için bir ad girin ve her biri için 8 kanal (A-H). Hızlı mod ‘u seçin (yüksek hızlı kapaklar ile kullanılmalıdır) ve ölçüme başlamak için Başlat ‘a tıklayın. Miktarım tamamlandığında, metal kalkanı çıkarın (kaydedilecek ve yeniden kullanılabilir) ve PCR şerit tüpünü ve çipini bertaraf edin. Enstrüman bilgisayarında, Run log her çalıştırma için sonuç dosyaları içerir. Analist yazılımıyla analiz etmek için her örnek için. FCS dosyalarını kullanın. 10. veri analizi Analist yazılımını başlatın ve ham spektral verileri çözümlemek için. FCS dosyalarını açın. Analiz görünümü altında bozulmamışöğesini seçin. Örnek görünüm altında, her kutuda onay işareti olması için 8 örneğinin yanındaki kutuları tıklatın. Yazılım, sırasıyla x ve y eksenleri boyunca mutant (FAM) ve wildtype (hex) alelleri için sinyaller çizecektir. Üreticinin talimatlarına göre, bozulmamış damlacıklar üzerinde spektral tazminat uygulamak için hesaplanan matris işlevini kullanın15. Eksen Seçenekleri altında eksen ayarlarını yapın. X ekseni en az 0 ve en fazla 30.000 ve y ekseni en az-5.000 ve en fazla 10.000 için ayarlayın. Damlacık kümeleri belirlendiğinde, grafikte boş alanı azaltmak için eksenleri ayarlayın.Not: Mutant ve wildtype kümeleri pozisyonu kullanılan problar bağlıdır, fluorophore ve onların konsantrasyon. Negatif (kaynak en yakın küme), mutant (x ekseni en yakın küme) ve wildtype (y ekseni için en yakın küme) kapıları ayarlamak için pozitif kontrol tümör dokusu gDNA karşılık gelen örnek seçin. Kümelerin farklı ve kolayca başarılı bir tahlil tanımlandığından emin olun. Pozitif denetim örneği üzerinde sağ tıklayarak ve tüm ayarları seçili örneklere uygulamakiçin bu seçeneği tıklatarak, pozitif denetimin kapı ayarlarını tüm örneklere uygulayın. Grafik görünümünün altında, seçili tüm örneklerin grafiklerini görüntülemek için birden çok örnek sekmesini tıklatın. Görüntüyü a olarak dışa aktarın. TıF dosyası. Ekranın sol üst kısmındaki çalışma alanı sekmesinin altında dışa aktarma çözümlemesi ‘ni (CSV) seçin ve analiz edilen veri dosyasını. csv dosyası olarak kaydedin. Her örnek için negatif, joker karakter ve mutant damlacık sayılarını görüntülemek üzere elektronik tablo yazılımında. csv dosyasını açın. Kullanarak MAF hesaplayın Poisson düzeltilmiş mutant damlacık sayımı her örnek için Poisson düzeltilmiş mutant artı wildtype damlacık sayar toplamı ile.Not: Poisson düzeltilmiş sayımı kullanın çünkü Poisson istatistik bu gerçeği için pozitif damlacıklar hedef DNA tek bir kopyasını daha içerebilir ve böylece pozitif damlacıkları özetlemek doğru bir sayı16verim olmayabilir için hesap.