Обнаружение и мониторинг опухолев, связанных с циркуляцией ДНК в биожидкости пациентов

Все методы, описанные здесь, были одобрены Институциональным наблюдательным советом Калифорнийского университета в Сан-Франциско (Сан-Франциско, Калифорния; IRB #14-13895) и Национальная система здравоохранения для детей (Вашингтон, О.К.; IRB #1339). Виды были собраны и изучены после получения информированного согласия от пациента или опекуна пациента. 1. Согласие пациентов в соответствии с протоколом IRB для сбора и хранения биологических образцов Сбор образцов пациента после письменного информированного согласия, полученного от каждого пациента или опекуна пациента, для участия в клинических испытаниях или для биовосстановления, утвержденного соответствующим Институциональным наблюдательным советом. Пациенты, включенные в это исследование были диагностированы с опухолью мозга радиографически. Критерии исключения не использовались. Виды были собраны и изучены после получения информированного согласия от пациента или опекуна пациента. 2. Сбор крови и разделение плазмы или сыворотки Соберите образец крови с помощью 10,0 мл обратить в трубки для сбора крови. При сборе крови для плазмы, используйте K2- или K3-EDTA трубки, гепарин или cfDNA трубки сбора крови. При сборе крови для сыворотки, используйте гелево-барьерные трубки, содержащие активатор сгустка и гель, чтобы отделить сыворотку.ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как 10 мл рекомендуется для включения повторных экспериментов, не менее 3 мл будет достаточно. Тщательно инвертируйте трубку для сбора 10 раз, чтобы смешать образец крови с реагентами трубки для сбора. Оставьте образцы крови, из которых сыворотка будет собрана при комнатной температуре в течение 30 минут, чтобы кровь сгусток. При обработке крови для получения плазмы немедленно переходите к шагу 2.4.ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы, обрабатываемые для плазмы, могут храниться на льду не более 2 ч до центрифугирования. Тем не менее, быстрый переход от крови обратить к обработке сводит к минимуму деградации cfDNA. Центрифуга трубки сбора крови на 2000 х г в течение 15 минут в центрифуге набор до 4 градусов по Цельсию, чтобы отделить плазму или сыворотку от белых и красных слоев кровяных клеток. Заботясь о том, чтобы не нарушать слой белых кровяных клеток (который образует тонкую линию между верхним слоем плазмы/сыворотки и нижним слоем упакованных красных кровяных телец), пипетка верхний слой плазмы/сыворотки (которая может быть ясной, желтой или розовой по цвету) одинаково в 1 мл aliquots в стерильные полипропиленовые винтовые колпаки криовиалы. Запишите идентификационный номер предмета, тип образца (плазму или сыворотку) и дату сбора на этикетке криовиалов. Храните криовиалы в морозильной камере -80 градусов до использования. Если морозильник -80 градусов недоступен, храните образцы при -20 градусов по Цельсию в течение одной недели. 3. Сбор и обработка CSF Соберите CSF из шунта, поясничного прокола или хирургического вмешательства.ПРИМЕЧАНИЕ: Такие процедуры должны проводиться только в том случае, если это необходимо врачам. Дополнительный образец сверх того, что необходимо для клинического использования, может быть использован в исследовательских целях. Измерьте объем собранного CSF и сделайте к сведению его цвет (кровавый, желтый, ясный). Centrifuge сбора трубки на 10000 х г в течение 10 минут при 4 кв КС, чтобы гранулы клеточного мусора. Передача CSF супернатант в равной степени в 500 аликвотвов в полипропиленовый винт крышки криовиалы. Запись идентификационного номера объекта, типа образца и даты сбора образцов на этикетке криовцев. Хранить при -80 градусах по Цельсию до использования. 4. Извлечение cfDNA из жидких образцов Выполните протокол извлечения cfDNA в рамках инструкций в справочнике комплекта комплекта извлечения cfDNA12. Очистите скамейку и оборудование с 10% отбеливателя и 70% этанола.ПРИМЕЧАНИЕ: Использование капота ПЦР, регулярная смена перчаток и частое обеззараживание скамейки и оборудования с 10% отбеливателем и 70% этанолом во время всех этапов протокола важно, чтобы избежать загрязнения образца. Приготовьте аликвоты реагентов, например, буферы для мытья, из комплекта для извлечения, чтобы избежать перекрестного загрязнения. Оттепель пациентов на льду до начала добычи. Для плазмы/ сыворотки, оттаивать 1 мл aliquot образца. Для CSF, оттепель 500 qL aliquot образца.ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги lysis (4.5-4.8) протокола экстракции отличают между плазмой/сывороткой и CSF, но от шага 4.9 onwards, протокол идентичны для обоих типов биожидкости. Установите нагревательный блок до 60 градусов по Цельсию для использования во время этапа лиза (4,6). Подготовьте буфер лиза и несущую РНК-смесь в трубке 15 мл, добавив 5,6 л РНК и 0,9 мл буфера лисиса на образец12. Для плазмы/сыворотки добавьте 100 юаней протеиназа K, 1 мл образца и 0,8 мл люизисной буфера/носителя РНК-смеси, приготовленной в шаге 4,4 к помеченной трубке 2,0 мл. Смешайте пульс вихрем для 30 s на высокой скорости12. Для CSF добавьте 125 л протеиназа K, 500 л образца, 1 мл люцисного буфера/носителя РНК-смеси и 250 мл буфера лиза ткани в трубку 2,0 мл. Доведите полный объем до 2 мл, добавив 125 л 1x фосфатно-буферного солья (PBS). Смешайте пульс вихрем для 30 s на высокой скорости12. Инкубировать образцы в течение 30 мин при 60 градусах ПоЦельси в нагревательном блоке12. Удалите образцы из нагревательного блока и понизите температуру до 56 градусов по Цельсию. Верните образцы на скамейку и перенесите лисат в новые помеченные трубки 15 мл. Для плазмы / сыворотки, добавить 1,8 мл нуклеиновой кислоты связывания буфераи смесь для 30 с импульсом вихря12. Для CSF добавьте 3,6 мл связывающего буфера нуклеиновой кислоты и смешайте по 30 с импульсным вихрем12. Инкубировать образцы на 5 мин на льду12. Вставьте колонку в вакуумный разъем. Откройте колонку и вставьте 20 мл трубки удлинитель в колонке12. Pipette содержимое трубки 15 мл непосредственно в нижней части трубки удлинитель, избегая оставляя капли на стенах трубки удлинитель. При выключенном вакуумном разъеме включите вакуумный насос. После того, как давление построено до 900 мбар, откройте клапан вакуумного разъема. Образец теперь будет проходить через столбец. После того, как весь лисат был слив из колонки, выключите насос и откройте люк для вакуумного разъема, снимая градиент давления. Как только давление достигнет 0 мбар, закройте клапан вакуумного разъема и люк. Удалите 20 мл трубки удлинитель, стараясь не пройти расширитель одной колонки над соседней колонкой, так как это может перекрестного загрязнения образцов. Утилизировать трубчатый удлинитель. Добавьте 600 л буфера первой стирки в столбец12. Оставьте крышки трубок открытыми и включите вакуумный насос. Пусть датчик давления достигает 900 мбар, а затем включите переключатель на вакуумный разъем в открытое положение, чтобы привлечь буфер стирки через колонку. Выключите вакуумный насос, откройте люк, чтобы выпустить давление, и снимите давление до 0 мбар. Поверните клапан вакуумного разъема в замкнутое положение. Добавьте 750 qL буфера второй стирки к столбце и повторите шаги 4.16-4.1712. Добавьте в колонку 750 кЛ этанола класса МБ и повторите шаги 4.16-4.1712. Закройте крышку колонны и поместите колонку в новую трубку коллекции 2,0 мл. Утилизировать вакуумный разъем12. Центрифуга трубки с колонкой на 20000 х г в течение 3 мин при комнатной температуре12. Поместите колонку в новую трубку сбора и откройте крышку трубки. Поместите лабораторную ткань сверху и инкубировать при 56 градусах по Цельсию в течение 10 мин12. Поместите столбец в чистую 1,5 мл ПЦР-чистой трубки и пипетки 100 л элекционного буфера (или молекулярной биологии класса H2O (MB H2O)) прямо в центр колонны. Не прикасайтесь к столбце кончиком пипетки. Закройте крышку и оставьте при комнатной температуре на 3 мин. Центрифуга при температуре 20 000 х при комнатной температуре в течение 1 мин до elute cfDNA12. Пипетка eluate обратно в колонку и инкубировать при комнатной температуре в течение 3 минут. Повторите центрифугацию на полной скорости в течение 1 мин, чтобы elute cfDNA второй раз, чтобы увеличить урожайность (в порядке производителя). Храните cfDNA в помеченных DNase/RNase бесплатных ПЦР-чистых трубок при 4 градусах Цельсия или перейдите непосредственно к шагу 5. 5. Вакуумная концентрация cfDNA Вставьте и уравновейдите трубки, содержащие eluted cfDNA в держатели на вакуумный концентратор. Откройте крышки трубок. Установите температуру вакуумного концентратора до 23 градусов по Цельсию. Включите вакуумный концентратор, затем включите паровую ловушку. Образцы центрифуги в течение 40 мин или до достижения окончательного объема 10,5-11 л. Если объем ниже 10,5 л, добавьте буфер суспензии ДНК или MB H2O, чтобы достичь конечного объема в 10,5 л. Pipette полный объем вдоль стен окни трубки для удаления остаточных фрагментов ДНК. Кратко центрифуги образцов на столешницацентры для сбора капель на стенах труб. Приступить непосредственно к этапу предампрятия (шаг 8) или хранить образцы при 4 градусах Цельсия. Оберните крышки труб в лабораторной пленке, чтобы избежать загрязнения, если они хранятся для последующего использования. 6. Проектирование и подготовка праймеров и зондов Дизайн вперед и обратный грунтовки, и wildtype и мутант LNA зондов, для цели (ы) интерес. Коммерчески заказать лиофилизированные грунтовки и зонды (см. таблицу материалов).ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательности для грунтовок и зондов, нацеленных на H3F3A p.K27M и другие целевые мутации для детских глиом средней линии, можно найти в дополнительной таблице 3 Panditharatna et al., 20188. Перед открытием лиофилизированных грунтовок и зондов, кратко центрифуги труб. Добавьте соответствующий объем буфера суспензии ДНК или MB H2O, как указано на листе спецификации продукта, чтобы повторно приостановить лиофилизированные грунтовки и зонды до концентрации 100 мкм. Аккуратно вихрь, пипетка вверх и вниз несколько раз, чтобы смешать и кратко центрифуги грунтовки и зонды с помощью столешницы центрифуги. Подготовьте 10 аликотов праймеров и зондов, добавив 10 qL из 100 мкм запаса до 90 л буфера суспензии ДНК или MB H2O. Подготовьте 1 qM aliquots передних и обратных грунтовок (которые будут использоваться для преамплизации), добавив 10 qL из 10 КМ праймер до 90 qL буфера суспензии ДНК или MB H2O. Храните грунтовки и зонды при 4 градусах Цельсия в герметичных темных контейнерах. Оберните лабораторную пленку вокруг крышки, чтобы избежать загрязнения, и крышка зондов в алюминиевой фольге, чтобы избежать воздействия света. Храните зонды при -20 градусов по Цельсию для длительного хранения, если они не используются регулярно. 7. Выбор положительных элементов управления Выберите образец геномной ДНК (gDNA) с известной концентрацией ДНК, которая таит в себе мутацию интереса на известной аллеличной частоте, которая будет использоваться в качестве положительного контроля. Используйте 0.025 нг положительного контроля опухолевой ткани ДНК в шаге предампрягения (шаг 8).ПРИМЕЧАНИЕ: Этот вход ДНК обеспечивает надежный положительный сигнал на dPCR (как определяется путем выполнения серийных разбавлений опухолевой ткани gDNA укрывательство H3F3A p.K27M мутации8)при минимизации количества образца требуется. 8. Преамплификация целевых аллелей ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол предамации в порядке Джексона и др., 201613. Очистите скамейку и оборудование с 10% отбеливателя и 70% этанола. Получить 1 ММ вперед и обратный праймеры, образцы cfDNA, GDNA положительный контроль, и ДНК-полимераза мастер смеси, и установить на льду. Рассчитайте объем реагентов, необходимых для предусилия желаемого количества образцов cfDNA и положительного контроля, для односепекса или мультиплексной предусилификации следующим образом: Для односепфиксной преусилиции (для предувлажнения wildtype и мутантных аллелей для одной мутации интереса), подготовить пЦР реакции смесь, добавив 17,5 л ДНК полимеразы мастер смеси, и 3,5 л вперед и обратного грунтовки (100 нм) на образец13. Для мультиплексной преусилиции (для предамплификации двух наборов wildtype и мутантных аллелей для двух мутаций, представляющих интерес), приготовьте смесь реакции ПЦР, добавив 17,5 л миполимного миполиза ДНК и 1,75 л каждого набора передних и обратных грунтовок (50 нм) на образец 13.ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте достаточное количество смеси реакции ПЦР для количества образцов плюс 10% дополнительно для учета любой ошибки пипетки. Распределить 24,5 л смеси реакции ПЦР в каждую скважину 8-хорошо ПЦР полосы трубки13. Распределить 10,5 л образца ДНК в соответствующую скважину, чтобы довести общий объем реакции до 35 ЛЛ13. Аккуратно pipette полный объем вверх и вниз в 10 раз, чтобы смешать. Выполните усиление ПЦР при 98 градусах по Цельсию в течение 3 мин; 9 циклов 98 градусов по Цельсию на 10 с, температура annealing в течение 3 мин, 72 градуса по Цельсию на 30 с; и расширение на 72 кс в течение 2 мин13. Перенесите полный объем преампложденного продукта на маркированные DNase/RNase бесплатные ПЦР-чистые трубки и разбавьте в 140 Л TE ДНК суспензии буфера (pH 8.0)13. Заверните крышки труб оков в лабораторную пленку. Храните преамплированный продукт при 4 градусах Цельсия. Для длительной консервации, хранить при -20 градусах Цельсия. 9. Обнаружение и количественная оценка целевой ДНК с использованием dPCR Очистите скамейку и оборудование с 10% отбеливателя и 70% этанола. Установите 10 праймеров и зондов, генотипирование мастер-микс, и образцы ДНК на льду. Храните капельное стабилизирующее масло при комнатной температуре. Аккуратно вихрь и кратко центрифуга всех реагентов, кроме капель стабилизации нефти. Убедитесь, что сжатый азотный газовый баллон, прикрепленный к прибору для производства капель и инструменту количественной оценки(Таблицаматериалов), установлен на уровне 90 пси. Включите инструмент, генерирующий падение, и компьютер с программным обеспечением инструмента. Запустите программное обеспечение и нажмите Начало инициализации. Запустите флеш высокого давления на инструменте генерации капель, если он не был использован в течение одной недели или более. Подготовьте реакционную смесь dPCR для 8 скважин прокладки пЦР плюс 10% дополнительно, добавив 220 л генотипирующей мастерской смеси, 8,8 л каждый из 10 мкм диких и мутантных зондов, 39,6 л каждый из 10 мкм вперед и обратных грунтовок, и 17,6 л капель стабилизирующего масла14 х к0 >. Аккуратно смешайте реакционную смесь dPCR, протяните полный объем вверх и вниз в 10-20 раз. Не вихрь или центрифуга после капли стабилизирующего масла был добавлен в реакционную смесь. Получить ПЦР 8-хорошо полосы трубки и обойтись 38 Зл реакции смеси dPCR непосредственно в нижней части каждого колодца14. Удалите любые пузырьки с чистой наконечником пипетки.ПРИМЕЧАНИЕ: ПЦР полосы труб, которые взаимосвязаны или упакованы плотно вместе может привести к статическим электрическим зарядам, вызывая слияние и шумный сигнал при анализе данных dPCR. Чтобы избежать этого, aliquot полосы труб в отдельные мешки биоопасности, избежать чрезмерной упаковки мешки, и держать трубки от трения вместе. Добавьте 12 зЛ преампложденного образца ДНК к соответствующим скважинам прокладки ПЦР. Для отрицательного контроля добавьте 12 л МБ Н2O.ПРИМЕЧАНИЕ: Проанализируйте образцы cfDNA в репликатных скважинах. Для CSF, анализировать по крайней мере в дубликате, и для плазмы / сыворотки анализировать каждый образец в тройной. Аккуратно пипетка полный объем вверх и вниз в 10 раз, чтобы смешать смесь реакции с образцом ДНК. Получить новый чип приборопроизводства и пипетку полного объема из скважин 1-8 из прокладки ПЦР в соответствующие каналы A-H в чипе. Избегайте прикосновения к нижней части каналов с кончиком пипетки. Получить новую чистую прокладку пЦР трубки и вставить в капельки генерирующих инструмент. Сканирование или вручную введите идентификатор чипа, генерирующего капельку, в программное обеспечение на приборном компьютере. Введите имена для каждого из 8 каналов. Нажмите Нажмите Запустите запустить, чтобы начать dropletizing образцов. Когда капля завершена, удалите прокладку прокладки ПЦР трубки и нанесите колпачки полоски трубки. Перенесите прокладку трубки на термальный велосипедист и баланс с другой полосой трубки, содержащей 80 злитровую воду на скважину. Программа термальных условий цикла14 как: 95 градусов по Цельсию в течение 10 мин; 45 циклов по две температуры: 95 градусов по Цельсию на 30 с и температура 2 мин; 98 кВ в течение 10 мин; и удерживайте при 10 градусах Цельсия. Установите скорость рампы до 0,5 градуса по Цельсию/с и установите объем выборки до 80 qL14. Когда тепловой цикл завершен, удалить полоску трубки и передачи на инструмент количественной оценки. Снимите пЦР-полоски и замените высокоскоростными колпачками. Включите инструмент количественной оценки и подключенный компьютер с программным обеспечением приборов. Запустите программное обеспечение инструмента и нажмите Setup aRun. Поместите полоску трубки в инструмент количественной оценки. Получить новый чип количественного инструмента и сканирование или вручную ввести идентификатор чипа в инструмент. Вставьте чип в машину. Поместите металлический щит на верхней части чипа и закройте крышку инструмента. В программном обеспечении компьютера введите имя для запуска dPCR и для каждого из 8 каналов (A-H). Выберите Быстрый режим (который должен быть использован с высокой скоростью шапки) и нажмите Кнопка Начало, чтобы начать количественную оценку. Когда количественная оценка будет завершена, удалите металлический щит (чтобы сохранить и повторно использовать) и утилизировать прокладку пЧР трубки и чипа. На приборном компьютере журнал Run Log будет содержать файлы результатов для каждого запуска. Используйте файлы .fcs для каждого образца для анализа с помощью программного обеспечения аналитика. 10. Анализ данных Запустите программное обеспечение аналитика и откройте файлы .fcs для анализа необработанных спектральных данных. Под анализом Вид, выберите Intact. Под Sample View щелкните коробки рядом с каждым из 8 образцов, чтобы в каждой коробке была галочка. Программное обеспечение будет график сигналов для мутантов (FAM) и wildtype (HEX) аллели вдоль x- и y-осей, соответственно. Используйте вычисленная матричная функция, чтобы подать заявку на спектральную компенсацию на нетронутых каплях, в зависимости от инструкций производителя15. Отрегулируйте настройки оси под опционами Axis. Установите x-оси до минимума 0 и максимум 30 000, а y-оси до минимума -5000 и максимум 10000. При выявлении скоплений капель отрегулируйте осевы, чтобы уменьшить пустое пространство на графике.ПРИМЕЧАНИЕ: Положение скоплений мутантов и диких типов будет зависеть от используемых зондов, флюорофора и их концентрации. Выберите образец, соответствующий положительной контрольной опухолевой ткани gDNA, чтобы установить отрицательные (кластер ближе всего к происхождению), мутант (кластер ближе всего к x-оси) и дикий тип (кластер ближе всего к y-оси) ворота. Убедитесь, что кластеры отличаются и легко идентифицируются в успешном асссе. Примените настройки ворот для положительного контроля ко всем образцам, нажав на положительный образец контроля и нажав на опцию применения всех настроек квыбранным образцам. Под графическим представлением щелкните вкладку «Несколько образцов» для просмотра участков для всех выбранных образцов. Экспорт изображения как . Файл TIF. Под вкладкой Workspace в левом верхнем верхнем конце экрана выберите экспортный анализ (CSV) и сохраните анализируемый файл данных в виде файла .csv. Откройте файл .csv в программном обеспечении для электронной таблицы для просмотра отрицательных, диких и мутантных капель для каждого образца. Рассчитайте MAF, разделив количество капли мутантов, по сумме скорректированного мутанта Пуассона плюс количество капель дикого типа для каждого образца.ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте Пуассон исправлено рассчитывать, потому что Статистика Пуассона объяснить тот факт, что положительные капли могут содержать больше, чем одна копия целевой ДНК, и, таким образом, суммируя положительные капли не может дать точное количество16.