Deteção e monitoração do ADN de circulação associado do tumor em Biofluids pacientes

Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pelo Conselho de revisão institucional da Universidade da Califórnia em São Francisco (São Francisco, CA; IRB #14-13895) e o sistema nacional de saúde da criança (Washington, D.C.; IRB #1339). Os espécimes foram coletados e estudados após a obtenção do consentimento informado do paciente ou tutor do paciente. 1. pacientes consentantes protocolo IRB para coleta e armazenamento de espécimes biológicos Coletar amostras de pacientes após o consentimento informado por escrito é obtido de cada paciente, ou o tutor do paciente, para a participação em um ensaio clínico ou para biororepositório como aprovado pelo respectivo Conselho de revisão institucional. Os pacientes incluídos neste estudo foram diagnosticados com um tumor cerebral radiograficamente. Não foram utilizados critérios de exclusão. Os espécimes foram coletados e estudados após a obtenção do consentimento informado do paciente ou tutor do paciente. 2. coleta de sangue e separação de plasma ou soro Colete a amostra de sangue usando um sorteio de 10,0 mL em tubos de coleta de sangue. Se coleta de sangue para plasma, use K2-ou k3-tubos de EDTA, heparina ou tubos de coleta de sangue cfdna. Se coleta de sangue para o soro, use tubos de gel-barreira contendo o ativador de coágulo e gel para separar o soro.Nota: Enquanto 10 mL é recomendado para habilitar experimentos replicar, um mínimo de 3 mL será suficiente. Inverta cuidadosamente o tubo de recolha 10 vezes para misturar a amostra de sangue com os reagentes do tubo de recolha. Deixe as amostras de sangue a partir das quais o soro será coletado à temperatura ambiente durante 30 min para permitir que o sangue coagule. Se o processamento de sangue para obter o plasma, prossiga imediatamente para o passo 2,4.Nota: As amostras que estão sendo processadas para o plasma podem ser mantidas no gelo por um máximo de 2 h antes da centrifugação. No entanto, uma rápida transição da tração do sangue para o processamento minimiza a degradação do cfDNA. Centrifugue os tubos da coleção do sangue em 2.000 x g por 15 minutos em um centrifugador ajustado a 4 ° c para separar o plasma ou o soro das camadas brancas e vermelhas do glóbulo. Tomando cuidado para não perturbar a camada de glóbulos brancos (que forma uma linha fina entre o plasma superior/camada sérica e camada inferior de glóbulos vermelhos embalados), pipeta a camada superior de plasma/soro (que pode ser claro, amarelo ou cor de rosa) igualmente em 1 mL alíquotas em cryovials estéreis do parafuso-tampão do polypropylene. Registre o número de identificação do sujeito, o tipo de amostra (plasma ou soro) e a data de coleta no rótulo dos cryovials. Guarde os cryovials no congelador-80 ° c até o uso. Se a-80 ° c freezer não estiver disponível, armazene as amostras a-20 ° c por até uma semana. 3. coleta e processamento do CSF Colete o CSF de uma derivação, de uma punctura lombar, ou de uma cirurgia.Nota: Tais procedimentos só devem ser conduzidos se considerados necessários pelos clínicos. A amostra extra além do que é necessário para o uso clínico pode ser usada para finalidades da pesquisa. Meça o volume de CSF coletado e anote sua cor (sangrenta, amarela, desobstruída). Centrifugue o tubo de recolha a 10.000 x g durante 10 min a 4 ° c para sedimento dos detritos celulares. Transfira o sobrenadante do CSF ingualmente em 500 μL de alíquotas em cryovials da tampa de parafuso do polypropylene. Registre o número de identificação do sujeito, o tipo de amostra e a data da coleta de amostras no rótulo dos cryovials. Armazene em-80 ° c até o uso. 4. extração de cfDNA de espécimes líquidos Execute o protocolo de extração de cfDNA de acordo com as instruções do manual do kit de extração cfDNA12. Limpe o espaço e o equipamento do banco com o alvejante de 10% e o etanol 70%.Nota: O uso de uma capa do PCR, a mudança regular das luvas e a descontaminação freqüente do espaço e do equipamento de banco com alvejante de 10% e o etanol de 70% durante todas as etapas do protocolo são importantes evitar a contaminação da amostra. Prepare alíquotas de reagentes, por exemplo, tampões de lavagem, do kit de extração para evitar contaminação cruzada. Descongelar amostras de pacientes no gelo antes de iniciar a extração. Para plasma/soro, descongelar 1 mL de alíquota da amostra. Para o LCR, descongelar 500 μL de alíquota da amostra.Nota: As etapas do lysis (4.5-4.8) do protocolo da extração diferem entre o plasma/soro e o CSF, mas da etapa 4,9 avante, o protocolo é idêntico para ambos os tipos de biofluids. Ajuste um bloco de aquecimento a 60 ° c para o uso durante a etapa do lysis (4,6). Prepare o tampão de Lise e a mistura de RNA transportadora em um tubo de 15 mL adicionando 5,6 μL de RNA portador e 0,9 mL de tampão de Lise por amostra12. Para plasma/soro, adicione 100 μL de proteinase K, 1 mL de amostra e 0,8 mL de mistura de RNA tampão/portador de Lise preparada na etapa 4,4 para um tubo de 2,0 mL rotulado. Misture por pulso vortexing para 30 s em alta velocidade12. Para o LCR, Adicionar 125 μL de proteinase K, 500 μL da amostra, 1 mL de tampão de Lise/mistura de RNA portador e 250 μL de tampão de Lise tecidual em um tubo de 2,0 mL. Coloque o volume total até 2 mL adicionando 125 μL de soro fisiológico com tampão de fosfato 1x (PBS). Misture por pulso vortexing para 30 s em alta velocidade12. Incubar amostras durante 30 min a 60 ° c no bloco de aquecimento12. Retire as amostras do bloco de aquecimento e abaixe a temperatura para 56 ° c. Retorne amostras para o banco e transfira o lisado em novos tubos de 15 mL rotulados. Para plasma/soro, adicione 1,8 mL de buffer de ligação de ácido nucleico e misture por 30 s por pulso vortexing12. Para o LCR, adicione 3,6 mL de tampão de ligação de ácido nucleico e misture por 30 s por pulso vortexing12. Incubar amostras por 5 min no gelo12. Insira a coluna no conector de vácuo. Abra a coluna e insira um extensor de tubo de 20 mL na coluna12. Pipeta o conteúdo do tubo de 15 mL diretamente na parte inferior do extensor do tubo, evitando deixar gotículas nas paredes do extensor do tubo. Com o interruptor do conector de vácuo fechado, ligue a bomba de vácuo. Uma vez que a pressão foi construída para 900 mbar, abra a válvula do conector de vácuo. O exemplo agora irá fluir através da coluna. Uma vez que todo o lisado foi drenado da coluna, desligue a bomba e abra o alçapão ao conector do vácuo, aliviando o inclinação da pressão. Uma vez que a pressão atinge 0 mbar, feche a válvula do conector de vácuo e o alçapão. Retire o extensor do tubo de 20 mL, tendo cuidado para não passar o extensor de uma coluna sobre uma coluna vizinha, pois isso pode contaminar amostras. Elimine o extensor do tubo. Adicionar 600 μL do primeiro tampão de lavagem à coluna12. Deixe as tampas dos tubos abertos e gire sobre a bomba de vácuo. Deixe o calibre de pressão alcangar 900 mbar, a seguir gire o interruptor no conector do vácuo à posição aberta para extrair o amortecedor da lavagem através da coluna. Desligue a bomba de vácuo, abra o alçapão para liberar a pressão, e aliviar a pressão para 0 mbar. Gire a válvula do conector de vácuo para a posição fechada. Adicionar 750 μL de segundo tampão de lavagem à coluna e repetir os passos 4.16-4.1712. Adicione 750 μL de etanol grau MB à coluna e repita os passos 4.16-4.1712. Feche a tampa da coluna e coloque a coluna dentro de um novo tubo de coleta de 2,0 mL. Elimine o conector de aspiração12. Centrifugue o tubo com a coluna a 20.000 x g durante 3 min à temperatura ambiente12. Coloque a coluna em um novo tubo de coleta e abra a tampa do tubo. Coloc um tecido do laboratório sobre a parte superior e incubar em 56 ° c por 10 minutos12. Coloque a coluna em um tubo limpo de 1,5 mL de PCR-Clean e pipetar 100 μL de tampão de eluição (ou grau de biologia molecular H2o (MB h2o)) diretamente no centro da coluna. Não toque na coluna com uma ponta de pipeta. Feche a tampa e deixe à temperatura ambiente durante 3 min. Centrifugador em 20.000 x g na temperatura ambiente por 1 minuto a eluir cfdna12. Pipetar o eluado de volta para a coluna e incubar à temperatura ambiente durante 3 min. Repita a centrifugação em plena velocidade por 1 min para eluir cfdna uma segunda vez para aumentar o rendimento (como por recomendação do fabricante). Armazene o cfDNA no rotulado DNase/RNase Free PCR-Limpe os tubos a 4 ° c ou Prossiga diretamente para a etapa 5. 5. concentração de vácuo de cfDNA Insira e equilibre os tubos contendo cfdna eluída em suportes no concentrador de vácuo. Abra as tampas dos tubos. Ajuste a temperatura do concentrador do vácuo a 23 ° c. Gire sobre o concentrador do vácuo, a seguir gire sobre a armadilha do vapor. Centrifugue amostras para 40 minutos ou até que um volume final de 10.5-11 μL esteja alcangado. Se o volume estiver abaixo de 10,5 μL, adicione o tampão de suspensão do ADN ou o MB H2o para alcançar um volume final de 10,5 μL. Pipeta o volume cheio ao longo das paredes do tubo para remover fragmentos residuais do ADN. Centrifugue momentaneamente as amostras em um centrifugador do tabletop para coletar gotas nas paredes dos tubos. Prossiga diretamente para a etapa de pré-amplificação (etapa 8) ou armazene amostras a 4 ° c. Enrole as tampas dos tubos em um filme de laboratório para evitar a contaminação se eles são armazenados para uso posterior. 6. concepção e preparação de primers e sondas Projete primers para diante e reverso, e pontas de prova do tipo selvagem e do mutante LNA, para o alvo (s) do interesse. Ordem comercial primários e sondas liofilizadas (consulte a tabela de materiais).Nota: as sequências de primers e sondas visando H3F3A p. K27M e outras mutações-alvo para gliomas de linha média pediátrica podem ser encontradas na tabela complementar 3 de Panditharatna et al., 20188. Antes de abrir os primers e sondas liofilizados, centrifugue brevemente os tubos. Adicione o volume apropriado de tampão de suspensão do ADN ou MB H2o, como anotou na folha da especificação de produto, para Ressuspender os primers e as pontas de prova liofilizados a uma concentração de 100 μm. Suavemente vortex, pipeta para cima e para baixo várias vezes para misturar e rapidamente centrifugar primers e sondas usando uma centrífuga de mesa. Prepare alíquotas de 10 μM de primers e sondas adicionando 10 μL de estoque de 100 μM a 90 μL de tampão de suspensão de DNA ou MB H2O. Prepare alíquotas de 1 μM de primers para a frente e reverso (para ser usado para pré-amplificação), adicionando 10 μL do primer de 10 μM a 90 μL de tampão de suspensão de DNA ou MB H2O. Armazene primers e sondas a 4 ° c em recipientes escuros herméticos. Enrole a película de laboratório em torno das tampas para evitar a contaminação, e cubra pontas de prova na folha de alumínio para evitar a exposição à luz. Armazene pontas de prova em-20 ° c para o armazenamento a longo prazo se não estão sendo usados regularmente. 7. seleção de controles positivos Selecione a amostra (s) de DNA genômica do tecido tumoral (gDNA) com concentração de DNA conhecida, que abriga a mutação de interesse em uma frequência alélica conhecida para ser usada como um controle positivo. Use 0, 25 ng de DNA de tecido tumoral de controle positivo na etapa de pré-amplificação (etapa 8).Nota: Esta entrada de DNA fornece um sinal positivo robusto na dPCR (conforme determinado pela realização de diluições seriais do tecido tumoral gDNA que abrigando a mutação H3F3A p. K27M8) enquanto minimiza a quantidade de amostra necessária. 8. pré-amplificação dos alelos alvo Nota: O protocolo de pré-amplificação é como por Jackson et al., 201613. Limpe o espaço e o equipamento do banco com o alvejante de 10% e o etanol 70%. Obtenha 1 μM de primers para a frente e reverso, amostras de cfDNA, controles positivos de gDNA, e mistura mestre da polimerase do ADN, e ajuste no gelo. Calcule o volume de reagentes necessários para pré-amplificar o número desejado de amostras de cfDNA e controle positivo, tanto para a pré-amplificação singleplex ou multiplex como segue: Para a pré-amplificação singleplex (para pré-amplificar os alelos do tipo tipo selvagem e Mutant para uma única mutação de interesse), prepare a mistura de reação de PCR adicionando 17,5 μL de mistura mestre de polimerase de DNA e 3,5 μL de primers para frente e reverso (100 nm) por amostra13. Para pré-amplificação Multiplex (para pré-amplificar dois conjuntos de alelos tipo selvagem e mutantes para duas mutações de interesse), prepare a mistura de reação de PCR adicionando 17,5 μL de mistura mestre de polimerase de DNA e 1,75 μL de cada conjunto de primers para frente e reverso (50 nm) por amostra trezeanos.Nota: Prepare suficiente mistura de reação de PCR para o número de amostras mais 10% extra para dar conta de qualquer erro de pipetagem. Dispense 24,5 μL da mistura da reação do PCR em cada poço de um tubo de tira do PCR de 8 poços13. Dispensar 10,5 μL de amostra de ADN para o poço adequado para trazer o volume total de reacção para 35 μL13. Gentilmente pipeta o volume total para cima e para baixo 10 vezes para misturar. Realize a amplificação do PCR em 98 ° c por 3 minutos; 9 ciclos de 98 ° c para 10 s, temperatura de recozimento por 3 min, 72 ° c por 30 s; e uma extensão em 72 ° c por 2 min13. Transfira o volume completo de produto pré-amplificado para tubos de PCR-Clean livres rotulados com DNase/RNase e diluir em 140 μL de tampão de suspensão de DNA (pH 8,0)13. Enrole as tampas dos tubos em filme de laboratório. Armazene o produto pré-amplificado a 4 ° c. Para a preservação a longo prazo, armazene em-20 ° c. 9. detecção e quantificação do DNA alvo usando dPCR Limpe o espaço e o equipamento do banco com o alvejante de 10% e o etanol 70%. Defina primers e sondas de 10 μM, mistura mestre de genotipagem e amostras de DNA no gelo. Guarde o óleo de estabilização de gotas à temperatura ambiente. Vórtice suavemente e centrifugue brevemente todos os reagentes excepto óleo de estabilização de gotas. Assegure-se de que o cilindro de gás de nitrogênio comprimido anexado ao instrumento gerador de gotas e o instrumento de quantificação (tabela de materiais) seja fixado em 90 psi. Ative o instrumento gerador de gota e o computador com o software do instrumento. Inicie o software e clique em Iniciar inicializando. Execute um flush de alta pressão no instrumento gerador de gota se ele não tiver sido usado em uma semana ou mais. Prepare a mistura da reação de dPCR para 8 poços do tubo da tira do PCR mais 10% extra, adicionando 220 μL da mistura mestra genotipagem, 8,8 μL cada um de 10 μM de pontas do tipo e de sondas do mutante, 39,6 μL cada um de 10 μM para diante e primers reversos, e 17,6 μL do óleo estabilizando da gota14 . Misture delicadamente a mistura da reação de dPCR pipetando o volume cheio acima e para baixo 10-20 vezes. Não vórtice ou centrifugador após o óleo de estabilização da gota ter sido adicionado à mistura de reacção. Obtenha um tubo de tira do PCR 8-well e dispense 38 μL da mistura da reação de dPCR diretamente na parte inferior de cada poço14. Remova todas as bolhas com uma ponta de pipeta limpa.Nota: Os tubos de tira do PCR que são Interlocked ou embalados firmemente junto podem conduzir às cargas elétricas estáticas, causando a coalescência e o sinal ruidoso ao analisar dados de dPCR. Para evitar este, os tubos de tira da alíquota em sacos separados do Biohazard, evitam a embalagem excedente os sacos, e mantêm os tubos da fricção junto. Adicionar 12 μL de amostra de DNA pré-amplificada aos poços apropriados do tubo de tira de PCR. Para o controle negativo, adicione 12 μL de MB H2O.Nota: Analise amostras de cfDNA em poços replicantes. Para o LCR, analisar pelo menos em duplicado, e para plasma/soro analisar cada amostra em triplicado. Pipetar suavemente o volume completo para cima e para baixo 10 vezes para misturar a mistura de reacção com a amostra de ADN. Obter um novo chip de instrumento gerador de gotas e pipetar o volume total de poços 1-8 do tubo de tiras de PCR para os canais correspondentes a-H no chip. Evite tocar na parte inferior dos canais com uma ponta de pipeta. Obter um novo tubo de tira de PCR limpo e inserir no instrumento gerador de gotas. Digitalize ou insira manualmente o ID do chip do instrumento gerador de gotas no software no computador do instrumento. Digite os nomes para cada um dos 8 canais. Clique em iniciar a execução para começar a dropletizing amostras. Quando o dropletization terminou, remova o tubo da tira do PCR e aplique tampões do tubo de tira. Transfira o tubo de tira para um termociclador e balance com outro tubo de tira contendo 80 μL de água por poço. Programe as condições térmicas de ciclagem14 como: 95 ° c por 10 min; 45 ciclos de duas temperaturas: 95 ° c por 30 s e temperatura de recozimento por 2 min; 98 ° c por 10 min; e segure a 10 ° c. Ajuste a taxa de rampa para 0,5 ° c/s e ajuste o volume da amostra para 80 μL14. Quando o ciclo térmico estiver completo, retire o tubo de tira e transfira para o instrumento de quantificação. Remova tampões de tira do PCR e substitua-os com tampões de alta velocidade. Ative o instrumento de quantificação e o computador conectado com o software do instrumento. Inicie o software do instrumento e clique em Setup a Run. Coloque o tubo de tira no instrumento de quantificação. Obter um novo chip de instrumento de quantificação e digitalizar ou inserir manualmente o chip ID no instrumento. Insira o chip na máquina. Coloque o escudo metálico em cima do chip e feche a tampa do instrumento. No software de computador, incorpore um nome para o funcionamento de dPCR e para cada um dos 8 canaletas (A-H). Selecione o modo rápido (que deve ser usado com tampas de alta velocidade) e clique em Iniciar para iniciar a quantificação. Quando a quantificação estiver concluída, retire o escudo metálico (a ser guardado e reutilizado) e elimine o tubo de tiras de PCR e o chip. No computador do instrumento, o log de execução conterá arquivos de resultado para cada execução. Use os arquivos. FCS para cada amostra para analisar com o software do analista. 10. análise de dados Inicie o software de Analista e abra os arquivos. FCS para analisar dados espectrais brutos. Em modo de exibição de análise, selecione intacto. Em modo de exibição de amostra, clique nas caixas ao lado de cada uma das 8 amostras para que haja uma marca de seleção em cada caixa. O software plotará os sinais para os alelos mutantes (Fam) e tipo selvagem (Hex) ao longo dos eixos x e y, respectivamente. Use a função de matriz calculada para aplicar a compensação espectral em gotas intactas, de acordo com as instruções do fabricante15. Ajuste as configurações do eixo em opções do eixo. Defina o eixo x para um mínimo de 0 e máximo de 30.000 e o eixo y para um mínimo de-5.000 e máximo de 10.000. Quando os clusters de gotas foram identificados, ajuste os eixos para reduzir o espaço vazio no gráfico.Nota: A posição dos aglomerados mutantes e tipo selvagem dependerá das sondas utilizadas, do fluoróforo e da sua concentração. Selecione a amostra correspondente ao tecido tumoral de controle positivo gDNA para definir o negativo (cluster mais próximo da origem), mutante (cluster mais próximo ao eixo x) e tipo selvagem (cluster mais próximo ao eixo y) portões. Assegure-se de que os clusters sejam distintos e facilmente identificados em um ensaio bem-sucedido. Aplique as configurações do portão para o controle positivo a todas as amostras clicando com o botão direito do mouse na amostra de controle positivo e clicando na opção para aplicar todas as configurações a amostras selecionadas. Na visualização gráfica, clique na guia vários exemplos para exibir plotagens para todas as amostras selecionadas. Exporte a imagem como um. Arquivo TIF. Na guia espaço de trabalho , na parte superior esquerda da tela, selecione Exportar análise (CSV) e salve o arquivo de dados analisado como um arquivo. csv. Abra o arquivo. csv no software de planilha para exibir contagens de gotas negativas, de tipo curinga e mutantes para cada amostra. Calcule a MAF dividindo a contagem de gotas de mutante corrigida por Poisson pela soma do mutante corrigido de Poisson mais contagens de gotas de tipo selvagem para cada amostra.Nota: Use a contagem corrigida de Poisson porque as estatísticas de Poisson respondem por esse fato de que as gotas positivas podem conter mais de uma única cópia do DNA alvo e, assim, somar as gotas positivas pode não produzir uma contagem exata16.