患者の生体流体における腫瘍関連循環DNAの検出とモニタリング

ここに記載されているすべての方法は、カリフォルニア大学サンフランシスコ校(カリフォルニア州サンフランシスコ)の機関審査委員会によって承認されています。IRB #14-13895)と子供の国民保健システム(ワシントンD.C.;IRB #1339)検体は、患者または患者の保護者からインフォームド・コンセントを得た後に収集され、研究された。 1. 生物標本の採取と保管に関するIRBプロトコルに従った患者の同意 各患者または患者の保護者から書面による同意を得た後、臨床試験に参加したり、それぞれの機関レビュー委員会によって承認されたバイオレポジトリに関する書面による同意を得た後に患者サンプルを収集します。 本研究に含まれる患者は、脳腫瘍と放射線で診断された。除外基準は使用されませんでした。検体は、患者または患者の保護者からインフォームド・コンセントを得た後に収集され、研究された。 2. 血漿または血清の採取と分離 採血管に10.0mLの引き込みで血液サンプルを採取する。血漿用の血液を採取する場合は、K2-またはK3-EDTAチューブ、ヘパリンまたはcfDNA採血管を使用してください。血清用の血液を採取する場合は、血栓活性化剤とゲルを含むゲルバリアチューブを使用して血清を分離します。注:反復実験を可能にするためには10 mLが推奨されますが、最低でも3mLで十分です。 採取管を慎重に10回反転させ、血液サンプルを回収管試薬と混合します。 血清を室温で30分間採取して血液を凝固させる血液サンプルを残します。血漿を得るために血液を処理する場合は、直ちにステップ2.4に進みます。注:プラズマ用に処理されるサンプルは、遠心分離の前に最大2時間氷上に保持され得る。しかし、血液採取から処理への急速な移行は、cfDNAの劣化を最小限に抑えます。 遠心分離管は2,000 x gで、遠心分離機で15分間、4°Cに設定し、血漿または血清を白血球層と赤血球層から分離します。 白血球層(上部血漿/血清層とパックされた赤血球の下層との間に細い線を形成する)を邪魔しないように注意し、血漿/血清の最上層(透明、黄色、またはピンク色)を1mLのアリコートで均等にピペットする滅菌ポリプロピレンねじキャップクライオビアルに。 被験者識別番号、検体タイプ(血漿または血清)、および回収日を凍結物のラベルに記録します。 使用するまで-80°C冷凍庫に凍結液を保管してください。-80 °C冷凍庫が利用できない場合は、最大1週間-20°Cでサンプルを保管してください。 3. CSFの収集と処理 シャント、腰椎穿刺、または手術からCSFを収集します。注:このような手順は、臨床医が必要と認めた場合にのみ行われるべきです。臨床使用に必要な余分なサンプルは、研究目的で使用することができます。 収集されたCSFの体積を測定し、その色(血まみれ、黄色、透明)を書き留める。 回収管を10,000 x gで遠心分離し、4°Cで10分間、細胞の破片をペレット化します。 CSF上清を500μLアリコートで均等にポリプロピレンスクリューキャップクライオビアルに移します。 被験者識別番号、検体の種類、および標本収集の日付を、クライオビアルのラベルに記録します。使用するまで-80°Cで保管してください。 4. 液体試料からのcfDNAの抽出 cfDNA抽出キットハンドブック12の指示に従って、cfDNA抽出プロトコルを実行します。 10%の漂白剤および70%のエタノールでベンチスペースおよび装置をきれいにする。注:PCRフードの使用、手袋の定期的な交換、10%の漂白剤と70%のエタノールを備えたベンチスペースと機器の頻繁な除染は、サンプル汚染を避けるために重要です。 試薬のアリコート(例えば、洗浄バッファー)を抽出キットから準備して、クロスコンタミネーションを避けます。 抽出を開始する前に氷上の患者サンプルを解凍する。プラズマ/血清の場合は、サンプルの1 mLアリコートを解凍します。CSFの場合は、サンプルの500μLアリコートを解凍します。注:抽出プロトコルのLysisステップ(4.5-4.8)は血漿/血清とCSFの間で異なりますが、ステップ4.9以降では、プロトコルは両方のタイプの生体流体で同一です。 リシス工程(4.6)中に使用するために、加熱ブロックを60°Cに設定します。 15 mLチューブにライシスバッファーおよびキャリアRNA混合物を調べ、5.6μLのキャリアRNAと0.9mLのライシスバッファーをサンプル12当たり添加する。 血漿/血清の場合、100 μLのタンパク質ナーゼK、1mLのサンプル、および0.8 mLのリシスバッファー/キャリアRNA混合物を標識された2.0 mLチューブに加えます。高速12で30sのパルス渦によって混合する。 CSFの場合は、125 μL のタンパク質ナーゼ K、サンプルの 500 μL、1 mL のリシス バッファー/キャリア RNA 混合物、および 250 μL 組織リシス バッファーを 2.0 mL チューブに追加します。1xリン酸緩衝生理食べ物(PBS)の125 μLを加えることによって、2 mLまでの完全な容積を持って来なさい。高速12で30sのパルス渦によって混合する。 加熱ブロック12で60°Cで30分間サンプルをインキュベートする。 加熱ブロックからサンプルを取り出し、温度を56°Cに下げます。サンプルをベンチに戻し、ライサートを新しいラベル付き15 mLチューブに移します。 血漿/血清の場合、パルス渦12によって30sの核酸結合バッファーとミックスの1.8 mLを追加する。 CSFの場合は、3.6mLの核酸結合バッファーを追加し、パルス渦12で30sに混合する。 氷12で5分間サンプルをインキュベートする。 カラムを真空コネクタに挿入します。列を開き、20 mL チューブ エクステンダーを列12に挿入します。 チューブエクステンダーの底部に直接15 mLチューブの内容物をピペットし、チューブエクステンダーの壁に液滴を残さないようにします。 真空コネクタのスイッチを閉じた状態で、真空ポンプをオンにします。圧力が900 mbarに構築されたら、真空コネクタのバルブを開きます。これで、サンプルが列を通過します。 すべてのリセートがカラムから排出されたら、ポンプをオフにし、圧力勾配を緩和し、真空コネクタにトラップドアを開きます。圧力が0mbarに達したら、真空コネクタとトラップドアのバルブを閉じます。 20 mLチューブエクステンダーを取り外し、サンプルをクロス汚染する可能性があるため、隣接するカラムの上に1つのカラムのエクステンダーを通過しないように注意してください。チューブエクステンダーを廃棄します。 列12に最初の洗浄バッファーの600 μLを加えます。 チューブの蓋を開いたままにして、真空ポンプをオンにします。圧力計が900mbarに達し、真空コネクタのスイッチを開いた位置に回し、洗浄バッファをカラムに引き出します。 真空ポンプをオフにし、トラップドアを開けて圧力を解放し、圧力を0mbarに緩和します。真空コネクタのバルブを閉じた位置に回します。 カラムに750 μLの2番目の洗浄バッファーを追加し、手順を繰り返します 4.16-4.1712. カラムにMBグレードのエタノールの750 μLを追加し、手順を繰り返します 4.16-4.1712. カラムの蓋を閉じ、新しい2.0 mLコレクションチューブ内にカラムを入れます。真空コネクタ12を廃棄する。 室温12で3分間20,000 x gのカラムでチューブを遠心分離します。 カラムを新しいコレクションチューブに入れ、チューブの蓋を開けます。上に実験室のティッシュを置き、10分12のために56 °Cでインキュベートする。 カラムをクリーンな1.5 mL PCRクリーンチューブに入れ、溶出バッファー(または分子生物学グレードH2O(MBH2O))のピペット100 μLをカラムの中央に直接入れます。ピペット先端でカラムに触れないでください。蓋を閉め、室温で3分間放置します。 室温で20,000 x gの遠心分離機を1分間、cfDNA12を溶出させる。 溶出物をカラムに戻し、室温で3分間インキュベートします。 (メーカーの推奨に従って)収率を上げるため、cfDNAを2回溶出させるために、1分間フルスピードで遠心分離を繰り返します。 cfDNAをラベル付きDNase/RNaseフリーPCRクリーンチューブに4°Cで保管するか、ステップ5に直接進みます。 5. cfDNAの真空濃度 真空濃縮器のホルダーに、eluted cfDNAを含むチューブを挿入し、バランスを取ります。チューブのふたを開きます。真空濃縮器の温度を23°Cに設定します。 真空濃縮器をオンにし、蒸気トラップをオンにします。遠心分離機サンプルは40分間、または10.5-11 μLの最終容積に達するまでです。 体積が10.5 μL未満の場合は、DNA懸濁液バッファーまたはMB H2 Oを追加して、最終的な体積10.5 μLに達します。 残留DNA断片を除去するために、チューブの壁に沿って完全なボリュームをピペット。 簡単に遠心分離機の上のサンプルを遠心分離し、チューブの壁に液滴を収集します。 予備増幅工程(ステップ8)に直接進むか、4°Cでサンプルを保存します。 実験室用フィルムにチューブのふたを巻き付け、後で使用するために保管する場合は汚染を避けてください。 6. プライマーとプローブの設計と準備 目的のターゲットに対して、前方および逆プライマー、およびワイルドタイプおよび変異型 LNA プローブを設計します。商業的に凍結乾燥プライマーおよびプローブを発注する(材料の表を参照)。注:H3F3A p.K27Mおよび小児中線神経膠腫に対する他の標的変異を標的とするプライマーおよびプローブの配列は、パンジタラトナら2018 8の補足表3に見出すことができる。 凍結乾燥プライマーとプローブを開く前に、チューブを簡単に遠心分離します。製品仕様シートに記載されているように、適切な量のDNA懸濁液バッファーまたはMB H2Oを添加し、凍結乾燥プライマーおよびプローブを100μMの濃度に再懸濁させる。 穏やかに渦、ピペット上下に数回、卓上遠心分離機を使用してプライマーとプローブを混合し、簡単に遠心分離機を使用します。 DNA懸濁液バッファーまたは MB H2O の 90 μL に 10 μM ストックの 10 μL を加えて、プライマーおよびプローブの 10 μM アリコートを調べ取ります。 前方および逆プライマーの1 μMアリコート(プリアンプ化に使用)を調べ、10 μMプライマーの10μLをDNA懸濁液バッファーまたはMB H2Oの90 μLに加えて調べます。 プライマーとプローブを気密性の高い暗い容器に4°Cに保管してください。実験室用フィルムを蓋の周りに巻いて汚染を防ぐと、光にさらされるのを避けるためにアルミホイルでプローブを覆います。定期的に使用されていない場合は、-20°Cでプローブを保管して長期保存してください。 7. ポジティブコントロールの選択 既知のDNA濃度を有する腫瘍組織ゲノムDNA(gDNA)サンプルを選択し、これは正の対照として使用される既知のアジェリル周波数で目的の変異を収容する。 前増幅工程で0.025ngの陽性対照腫瘍組織DNAを使用する(ステップ8)。注:このDNA入力は、必要なサンプルの量を最小限に抑えながら、dPCR上で強い陽性シグナルを提供します(H3F3A p.K27M変異8を収容する腫瘍組織gDNAの連続希釈を行うことによって決定されます)。 8. ターゲットアレルの事前増幅 注:プリアンプ化プロトコルは、ジャクソンら、201613. 10%の漂白剤および70%のエタノールでベンチスペースおよび装置をきれいにする。 1 μM前方およびリバースプライマー、cfDNAサンプル、gDNA陽性コントロール、およびDNAポリメラーゼマスターミックスを取得し、氷上にセットします。 シングルプレックスまたは多重プリアンプ化のいずれかについて、所望のcfDNAサンプル数と陽性制御をプリ増幅するために必要な試薬の量を次のように計算します。 シングルプレックスプリアンプ化(目的の単一変異に対してワイルドタイプおよび変異アレルをプリ増幅する)については、DNAポリメラーゼマスターミックスの17.5 μLを加えてPCR反応混合物を調べ、サンプル13当たり3.5μLの前方プライマーとリバースプライマー(100 nM)を調べます。 多重前増幅(目的の2つの変異に対して2組のワイルドタイプと変異対立遺伝子をプリ増幅する)の場合、DNAポリメラーゼマスターミックスの17.5 μLとサンプルあたりのフォワードおよびリバースプライマー(50 nM)の各セットの1.75 μLを加えることによってPCR反応混合物を調作する13.注:サンプル数に十分なPCR反応混合物を準備し、ピペッティングエラーを考慮して10%余分にします。 8ウェルPCRストリップチューブ13の各ウェルにPCR反応混合物の24.5 μLを分配する。 10.5 μLのDNAサンプルを適切なウェルに分配し、総反応量を35 μL13にします。ミックスする10回、フルボリュームをゆっくりとピペット。 98 °CでPCR増幅を3分間行います。10 sのための98 °Cの9サイクル、3分のための焼化温度、30sのための72 °C;そして2分13のための72 °Cの延長。 予備増幅された製品の全容積を標識されたDNase/RNaseフリーPCRクリーンチューブに移し、140 μL TE DNA懸濁液バッファー(pH 8.0)13で希釈します。 実験室用フィルムでチューブのふたを包みます。予お増幅製品を4°Cに保管してください。長期保存のため、-20°Cで保管してください。 9. dPCRを用いた標的DNAの検出と定量 10%の漂白剤および70%のエタノールでベンチスペースおよび装置をきれいにする。 10 μMプライマーとプローブ、ジェノタイピングマスターミックス、および氷上のDNAサンプルを設定します。液滴安定化油を室温で保管してください。 穏やかに渦と簡単に液滴安定化油を除くすべての試薬を遠心分離します。 液滴発生器に取り付けられた圧縮窒素ガスボンベと定量計(材料表)が90psiに設定されていることを確認します。 ドロップ生成インストゥルメントとインストゥルメントソフトウェアを使用してコンピュータの電源を入れます。ソフトウェアを起動し、[初期化の開始] をクリックします。 1 週間以上使用されていない場合は、ドロップ生成装置に高圧フラッシュを実行します。 PCRストリップチューブの8ウェルに対してdPCR反応混合物を準備し、10%余分に、ジェノタイピングマスターミックスの220 μL、10 μMワイルドタイプと変異プローブの各8.8 μL、10 μM前方および逆プライマーの39.6 μL、および17.6 μLの液滴安定化オイル14μLを追加します。>. dPCR反応混合物を10~20回上下にピペッティングしてゆっくりと混合します。液滴安定化油を反応混合物に添加した後は渦や遠心分離機を行わな。 PCR 8ウェルストリップチューブを取得し、各ウェル14の底部に直接dPCR反応混合物の38 μLを分配する。きれいなピペットの先端で任意の気泡を削除します。注:連動または密に詰め込まれたPCRストリップチューブは、静電気電荷を引き起こし、dPCRデータを分析する際に合体およびノイズの多い信号を引き起こす可能性があります。これを避けるために、アリコートストリップチューブを別々のバイオハザードバッグに入れ、袋の過剰梱包を避け、チューブが一緒にこすれないようにしてください。 PCRストリップチューブの適切なウェルに12 μLのプリアンプ化されたDNAサンプルを追加します。負のコントロールの場合は、MB H2O の 12 μL を追加します。注:複製ウェルでcfDNAサンプルを分析します。CSFの場合は、少なくとも複製して分析し、プラズマ/血清については各サンプルを三極化で分析します。 反応混合物をDNAサンプルと混合するために、10回上下にフルボリュームをゆっくりとピペットします。 新しい液滴発生インストルメントチップを入手し、PCRストリップチューブのウェル1~8からチップ内の対応するチャンネルA-Hにフルボリュームをピペットします。ピペット先端でチャンネルの底部に触れないようにしてください。 新しいクリーンなPCRストリップチューブを入手し、液滴発生器に挿入します。インストゥルメントコンピュータ上のソフトウェアに液滴生成インストルメントチップIDをスキャンまたは手動で入力します。8 チャンネルごとに名前を入力します。[実行を開始]をクリックして、サンプルの液滴化を開始します。 液滴化が完了したら、PCRストリップチューブを取り外し、ストリップチューブキャップを適用します。 ストリップチューブをサーマルサイクラーに移し、ウェルあたり80 μLの水を含む別のストリップチューブとバランスを取ります。 熱循環条件14を10分間95°Cにプログラムします。2つの温度の45サイクル:30sのための95 °Cおよび2分のためのアニーリング温度;98 °C 10 分;10°Cで保持します。 ランプレートを0.5 °C/sに設定し、サンプル体積を80 μL14に設定します。 サーマルサイクリングが完了したら、ストリップチューブを取り外し、定量計器に移します。PCRストリップキャップを取り外し、高速キャップに交換してください。 定量計器と接続されたコンピュータを計測器ソフトウェアでオンにします。計測器ソフトウェアを起動し、[実行のセットアップ]をクリックします。 ストリップチューブを定量装置に入れます。 新しい定量計チップを取得し、スキャンするか、手動でチップIDを計測器に入力します。チップをマシンに挿入します。 金属シールドをチップの上に置き、器具の蓋を閉じます。 コンピュータ ソフトウェアで、dPCR 実行の名前と 8 チャンネル (A-H) の名前を入力します。高速モード(高速キャップで使用する必要があります) を選択し、[開始] をクリックして定量化を開始します。 定量が完了したら、金属シールド(保存して再利用)を取り外し、PCRストリップチューブとチップを廃棄します。計測器コンピュータでは、実行ログに各実行の結果ファイルが含まれます。各サンプルの .fcs ファイルを使用して、アナリスト ソフトウェアを使用して分析します。 10. データ分析 アナリスト ソフトウェアを起動し、.fcs ファイルを開いて生のスペクトル データを分析します。[解析ビュー] で、[そのまま]を選択します。[サンプル ビュー] で、各ボックスにチェック マークが表示されるように、8 つのサンプルの横にあるボックスをクリックします。ソフトウェアは、それぞれX軸とY軸に沿って変異体(FAM)とワイルドタイプ(HEX)の対向性の信号をプロットします。 計算されたマトリックス関数を使用して、製造元の指示15に従って、無傷の液滴のスペクトル補正を適用します。 [軸オプション] の下で軸設定を調整します。X 軸を最小 0 と最大 30,000 に設定し、Y 軸を最小 -5,000 と最大 10,000 に設定します。液滴クラスターが識別された場合は、軸を調整してグラフ内の空き領域を減らします。注:変異型クラスターと野生型クラスターの位置は、使用されるプローブ、蛍色素およびその濃度によって異なります。 陽性コントロール腫瘍組織gDNAに対応するサンプルを選択して、負(原点に最も近いクラスター)、変異体(x軸に最も近いクラスター)、およびワイルドタイプ(Y軸に最も近いクラスター)ゲートを設定します。成功したアッセイでクラスターが明確かつ容易に識別されていることを確認します。 正のコントロール サンプルを右クリックし、選択したサンプルにすべての設定を適用するオプションをクリックして、すべてのサンプルに正のコントロールのゲート設定を適用します。 グラフィカルビューで、[複数のサンプル]タブをクリックして、選択したすべてのサンプルのプロットを表示します。イメージを としてエクスポートします。TIF ファイル。 画面の左上にある[ワークスペース]タブで、[分析のエクスポート(csv)] を選択し、分析されたデータ ファイルを .csv ファイルとして保存します。 スプレッドシート ソフトウェアで .csv ファイルを開き、各サンプルの負、ワイルドタイプ、および変異型の液滴数を表示します。ポアソン補正変異体液滴数をポアソン補正変異体の合計と、各サンプルのワイルドタイプ液滴数の合計で除算してMAFを計算します。注:ポアソン統計は、陽性液滴が標的DNAの1つ以上のコピーを含む可能性があるため、ポアソン補正カウントを使用して、陽性液滴を合計すると正確なカウント16を得ない可能性があります。