איתור וניטור של DNA הקשורים במחזור הגידול ב ביולואידים חולה

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי מועצת הסקירה המוסדית של אוניברסיטת קליפורניה בסן פרנסיסקו (סן פרנסיסקו, CA; IRB14-13895) ומערכת הבריאות הלאומית לילדים (וושינגטון הבירה; IRB1339). דגימות נאספו ולמדו לאחר קבלת הסכמה מושכלת של המטופל או אפוטרופוס של המטופל. 1. מטופלים בהסכמה תחת פרוטוקול IRB לאיסוף ואחסנה של דגימות ביולוגיות לאסוף דגימות החולה לאחר בכתב הסכמה מושכלת מתקבל מכל מטופל, או אפוטרופוס של המטופל, להשתתפות בניסוי קליני או עבור biorepository כפי שאושרו על ידי הלוח המוסדי סקירה מוסדית. מטופלים כלולים במחקר זה אובחנו עם גידול במוח רדיוגרפית. לא נעשה שימוש בקריטריוני אי-הכללה. דגימות נאספו ולמדו לאחר קבלת הסכמה מושכלת של המטופל או אפוטרופוס של המטופל. 2. איסוף דם והפרדה של פלזמה או סרום לאסוף את דגימת הדם באמצעות 10.0 mL לצייר לתוך צינורות איסוף דם. אם איסוף דם עבור פלזמה, השתמש K2-או k3-edta צינורות, הפארין או בדיקת דם cfdna צינורות. במקרה של איסוף דם לנסיוב, השתמשו בצינורות המחסום ג’ל המכילים את קריש הדם הactivator והג’ל לסרום נפרד.הערה: בעוד 10 מ”ל מומלץ לאפשר שכפול ניסויים, מינימום של 3 מ ל יספיק. בזהירות להפוך את צינור הגבייה 10 פעמים כדי לערבב את דגימת הדם עם ריאגנטים הקולקציה האוסף. הניחו את דגימות הדם שממנה ייאספו הנסיוב בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות כדי לאפשר לדם להיקריש. אם לעבד דם כדי להשיג פלזמה, להמשיך מיד לשלב 2.4.הערה: דגימות המעובדים עבור פלזמה ניתן לשמור על הקרח עבור מקסימום 2 h לפני צנטריפוגה. עם זאת, מעבר מהיר מן הדם לצייר לעיבוד ממזער השפלה cfDNA. אוסף צנטריפוגה דם צינורות ב 2,000 x g עבור 15 דקות בצנטריפוגה להגדיר 4 ° צ’ כדי להפריד פלזמה או סרום מן לבן ואדום שכבות תא דם. הטיפול לא להפריע שכבת התאים הלבנים דם (אשר יוצר קו דק בין שכבת הפלזמה/סרום העליון והשכבה התחתונה של כדוריות דם אדומות), פיפטה השכבה העליונה של פלזמה/סרום (אשר עשוי להיות ברור, צהוב, או ורוד בצבע) באופן שווה 1 mL הסוכר לקריובקבוקונים. ברגים מעוקרים של פוליפרופילן הקלט את מספר זיהוי הנושא, סוג הדגימה (פלזמה או סרום) ותאריך איסוף בתווית של הקריובקבוקונים. חנות קריובקבוקונים ב-80 ° c מקפיא עד השימוש. אם a-80 מקפיא ° c לא זמין, לאחסן את הדגימות ב-20 ° c עבור עד שבוע אחד. 3. איסוף ועיבוד שדרתי לאסוף שדרתי מפני הדלף, ניקוב המותניים, או ניתוח.הערה: הליכים כאלה צריכים להתבצע רק אם הם הכרחיים על ידי מטפלים. דוגמה נוספת מעבר לכך אשר הכרחי לשימוש קליני עשוי לשמש למטרות מחקר. למדוד את הנפח של שדרתי שנאסף ולשים לב לצבע שלה (מדמם, צהוב, ברור). צנטריפוגה את צינור האוסף ב 10,000 x g עבור 10 דקות ב 4 ° צ’ כדי לצנפה את הפסולת התאית. באופן שווה ב-500 Μi. לתוך כובעי בורג מפוליפרופילן הקלט את מספר הזיהוי של הנושא, סוג הדגימה והתאריך של אוסף הדגימות על התווית של הקריובקבוקונים. חנות at-80 ° צ’ עד השימוש. 4. הוצאת cfDNA מדגימות נוזל בצע את פרוטוקול החילוץ cfDNA לפי ההוראות של ערכת החילוץ cfDNA מדריך12. נקו את מרחב הספסל וציוד עם 10% אקונומיקה ו 70% אתנול.הערה: שימוש במכסה ה-PCR, שינוי רגיל של כפפות וטיהור תכופים של מרחב הספסל וציוד עם 10% אקונומיקה ו 70% אתנול במהלך כל השלבים של הפרוטוקול חשוב כדי למנוע זיהום לדוגמה. הכינו מאגרים של ריאגנטים, למשל, לשטוף את המאגרים, מערכת החילוץ כדי למנוע זיהום צולב. הפשרת דגימות מטופלים על קרח. לפני תחילת החילוץ עבור פלזמה/סרום, הפשרת 1 מ ל של דגימה. עבור השדרתי, הפשרת 500 μl סדרת מחלקים של דגימה.הערה: צעדי ליזיס (4.5-4.8) של פרוטוקול החילוץ שונים בין פלזמה/סרום לבין שדרתי, אך משלב 4.9 ואילך, הפרוטוקול זהה לשני סוגי היולואידים. הגדר בלוק חימום ל 60 ° c לשימוש במהלך שלב הפירוק (4.6). הכן את מאגר הליזה ואת תערובת RNA המוביל בצינור 15 מ ל על ידי הוספת 5.6 μL של הספק RNA ו 0.9 mL של מאגר הליזה לכל מדגם12. עבור פלזמה/סרום, להוסיף 100 μL פרוטטינוז K, 1 מ ל לדוגמה, ו 0.8 mL של לוליזיס מאגר/המנשא RNA תערובת הכין בשלב 4.4 ל שפופרת בעלת תווית 2.0 mL. מערבבים על ידי מפולס וורטקנג עבור 30 s במהירות גבוהה12. עבור שפופרת שדרתי, להוסיף 125 μL פרוטטינואז K, 500 μL של המדגם, 1 מ ל של הספק מאגר/מנשא RNA תערובת, ו 250 μL לפירוק רקמות מאגר לצינור מדגם 2.0 mL. הביאי את הנפח המלא עד 2 מ ל על-ידי הוספת 125 μL של תמיסת מלח באגירה של 1 x פוספט (PBS). מערבבים על ידי מפולס וורטקנג עבור 30 s במהירות גבוהה12. הדגימות של הדגירה במשך 30 דקות ב 60 ° c בגוש החימום12. הסירו דגימות מבלוק החימום והורידו את הטמפרטורה ל-56 ° c. החזר דגימות אל הספסל והעבר את הליפוסט לתוך שפופרות חדשות של 15 מ”ל. עבור פלזמה/סרום, להוסיף 1.8 mL של חומצות גרעין מחייב bufferand לערבב עבור 30 s על ידי הדופק vortexing12. עבור שדרתי, להוסיף 3.6 mL של חומצות גרעין מאגר כריכה ומערבבים עבור 30 s על ידי הדופק vortexing12. מודקון דגימות עבור 5 דקות על קרח12. הכנס את העמודה לתוך מחבר הוואקום. פתח את העמודה והכנס מאריך שפופרת של 20 מ ל לעמודה12. פיפטה את התוכן של 15 מ”ל שפופרת ישירות לתוך החלק התחתון של המרחיב הצינור, הימנעות משאירים טיפות על קירות הרחבה הצינור. כאשר המתג של מחבר הוואקום סגור, הפעל את משאבת הוואקום. לאחר הלחץ בנוי 900 mbar, לפתוח את שסתום של מחבר ואקום. המדגם יזרום כעת דרך העמודה. לאחר כל lysate כבר רוקן מתוך העמודה, לכבות את המשאבה ולפתוח את דלת הסתרים למחבר ואקום, להקל על הלחץ הדרגתי. לאחר הלחץ מגיע 0 mbar, לסגור את שסתום של מחבר ואקום ואת דלת הסתרים. הסר את מאריך השפופרת של 20 מ”ל, היזהר שלא להעביר את המרחיב של עמודה אחת מעל טור שכן, שכן זה יכול לזהם דגימות מוצלבות. היפטר מextender הצינורית. הוסף 600 μL של מאגר הכביסה הראשון לעמודה12. השאירו מכסים של צינורות לפתוח ולהדליק את משאבת ואקום. תן את מד הלחץ להגיע 900 mbar, ואז להפעיל את המתג על מחבר ואקום למצב פתוח כדי לצייר את המאגר לשטוף דרך הטור. כבה את משאבת ואקום, לפתוח את דלת הסתרים כדי לשחרר לחץ, ולהקל את הלחץ על 0 mbar. הפעל שסתום של מחבר ואקום למצב סגור. הוסף 750 μL של מאגר הכביסה השניה לעמודה וחזור על שלבים 4.16-4.1712. הוסף 750 μL של אתנול כיתה MB לעמודה וחזור על שלבים 4.16-4.1712. סגור את המכסה של העמודה ומלא את העמודה בתוך שפופרת אוסף חדש של 2.0 mL. היפטר ממחבר ואקום12. צנטריפוגה את הצינור עם העמודה ב 20,000 x g עבור 3 דקות בטמפרטורת החדר12. הצב את העמודה לתוך צינור אוסף חדש ופתח את מכסה השפופרת. מניחים רקמת מעבדה מעל החלק העליון ו-הדגירה ב 56 ° c עבור 10 דקות12. מניחים את העמודה לתוך נקי 1.5 mL PCR-ניקוי צינור ופיפטה 100 μL של מאגר הימנעות (או ביולוגיה מולקולרית כיתה H 2 o (MB H2)) ישירות לתוך מרכז הטור. אל תגעו בטור בעזרת עצת פיפטה. סגרו את המכסה ועזבו בטמפרטורת החדר למשך 3 דקות. צנטריפוגה ב 20,000 x g בטמפרטורת החדר עבור 1 דקות עד Elute cfdna12. הפיפטה בחזרה לתוך הטור והדגירה בטמפרטורת החדר במשך 3 דקות. חזור על הצנטריפוגה במהירות מלאה במשך 1 דקות עד לשעה שנייה כדי להגדיל את התשואה (לפי המלצת היצרן). חנות cfDNA בתווית DNase/RNase חינם PCR-clean צינורות ב 4 ° צ’ או להמשיך ישירות לשלב 5. 5. ריכוז ואקום של cfDNA להוסיף ולאזן את הצינורות המכילים cfDNA מחזיקי בתוך מרכז ואקום. פתח את העפעפיים של הצינורות. הגדר את טמפרטורת מרכז הוואקום ל -23 ° c. , תדליק את מרכז הוואקום. ואז תדליק את מלכודת האדים דגימות צנטריפוגה עבור 40 דקות או עד כמות אחרונה של 10.5-11 μL מתמלאת. אם אמצעי האחסון הוא מתחת 10.5 μL, להוסיף מאגר ההשעיה DNA או MB H2O כדי להגיע לנפח הסופי של 10.5 μl. מנקז את הנפח המלא לאורך קירות הצינור כדי להסיר חלקי DNA שיורית. בקצרה צנטריפוגה את הדגימות על צנטריפוגה שולחן לאסוף טיפות על קירות הצינורות. המשך ישירות לשלב הקדם-הגברה (שלב 8) או לאחסון דגימות ב-4 ° c. לעטוף מכסים של צינורות בסרט מעבדה כדי למנוע זיהום אם הם מאוחסנים לשימוש מאוחר יותר. 6. עיצוב והכנת התחל וזונדים עצב קדימה והפוך התחל, ומסוג wildtype בדיקה LNA מוטציה, עבור היעד (ים) של עניין. הסדר מסחרי התחל והבדיקות (עיין בלוח החומרים).הערה: רצפים למטרות התחל והבדיקות המכוונות H3F3A p. K27M ומוטציות היעד אחרים עבור ילדים gliomas קו ביניים ניתן למצוא בטבלה המשלים 3 של Panditharatna ואח ‘, 20188. , לפני שפותחים את התחל והבדיקות. מצנטריפוגה בקצרה את הצינורות הוסף את הנפח המתאים של מאגר ההשעיה של ה-DNA או MB H2O, כפי שצוין על גיליון מפרט המוצר, כדי להשעות את התחל החדש והבדיקות לריכוז של 100 μm. מערבולת בעדינות, פיפטה למעלה ולמטה כמה פעמים כדי לערבב בקצרה צנטריפוגה התחל ובדיקה באמצעות צנטריפוגה שולחן. להכין 10 μM ali, של התחל והבדיקות על ידי הוספת 10 μL של 100 μM מלאי 90 μL של מאגר ההשעיה של DNA או MB H2O. להכין 1 μM ali, של קדימה והפוך התחל (לשמש עבור הגברה), על ידי הוספת 10 μL של 10 μM פריימר כדי 90 μL של מאגר ההשעיה של DNA או MB H2O. החנות התחל והגששים ב -4 ° c במיכלים הדוקים באוויר. לעטוף סרט מעבדה סביב כיסוי כדי למנוע זיהום, ולכסות בדיקות ברדיד אלומיניום כדי למנוע חשיפה לאור. אחסן בדיקה ב-20 ° c עבור אחסון ארוך טווח אם הם לא נמצאים בשימוש קבוע. 7. בחירת פקדים חיוביים בחירת רקמת הגידול גנומית DNA (gDNA) מדגם (עם) עם ריכוז דנ א ידוע, אשר הנמלים את מוטציה של עניין בתדר allelic ידוע לשמש כשליטה חיובית. השתמש 0.025 ng של שליטה חיובית רקמות הגידול DNA בשלב הגברה (שלב 8).הערה: קלט ה-DNA זה מספק אות חיובית חזקה על dPCR (כפי שנקבע על ידי ביצוע דיעות סדרתיות של רקמת הגידול gDNA מחסה H3F3A p. K27M מוטציה8) תוך צמצום כמות המדגם הנדרש. 8. הגברה מראש של אלטלס היעד הערה: פרוטוקול קדם הגברה הוא בהתאם לג ואח ‘, 201613. נקו את מרחב הספסל וציוד עם 10% אקונומיקה ו 70% אתנול. השג 1 μM קדימה והפוך התחל, דגימות cfDNA, הפקדים חיוביים gDNA, ו-DNA פולימראז הורים לערבב, ולהגדיר על קרח. לחשב את עוצמת הקול של הריאגנטים הדרוש כדי להגביר את המספר הרצוי של דגימות cfDNA ושליטה חיובית, עבור אחד בלבד או מולטיפלקס הגברה כדלקמן: עבור הגברה מראש של יחיד (כדי להגביר מראש את סוג ומוטציה אללים המוטציות עבור מוטציה אחת של עניין), להכין את התערובת התגובה PCR על ידי הוספת 17.5 μl של DNA פולימראז מומחה לערבב, ו 3.5 μl של קדימה והפוך התחל (100 nM) לכל מדגם13. עבור הגברה מראש (כדי להגביר שתי סטים של מסוג wildtype ו אללים מוטציות עבור שני המוטציות של עניין), להכין את התערובת התגובה PCR על ידי הוספת 17.5 μl של DNA פולימראז מאסטר לערבב ו 1.75 μl של כל קבוצה של קדימה והפוך התחל (50 nM) לכל מדגם . שלוש עשרההערה: הכינו מספיק שילוב של תגובת PCR עבור מספר הדגימות ועוד 10% תוספת לחשבון עבור כל שגיאת הליטוף. לחלק 24.5 μL של תערובת התגובה PCR לתוך כל טוב של 8-היטב ה-PCR רצועת הצינור13. לחלק 10.5 μL של דגימת DNA לתוך הבאר המתאים כדי להביא את נפח התגובה הכולל ל 35 μL13. מצנעת בעדינות את הנפח המלא למעלה ולמטה 10 פעמים כדי לערבב. לבצע הגברה PCR ב 98 ° צ’ צלזיוס עבור 3 דקות; 9 מחזורים של 98 ° צ’ עבור 10 s, ריפוי טמפרטורה עבור 3 דקות, 72 ° צ’ עבור 30 s; והארכה ב 72 ° c עבור 2 דקות13. להעביר את הנפח המלא של מוצר מוגבר כדי לתייג DNase/RNase חינם PCR-clean צינורות ולדלל ב 140 μL TE ההשעיה של DNA מאגר (pH 8.0)13. עוטפים את העפעפיים של הצינורות בסרט המעבדה. אחסן את המוצר שהיה מוגבר ב-4 ° c. לשימור לטווח ארוך, חנות ב-20 ° c. 9. זיהוי וקוונפיקציה של DNA היעד באמצעות dPCR נקו את מרחב הספסל וציוד עם 10% אקונומיקה ו 70% אתנול. Set 10 μM התחל ובדיקות, מיקס מאסטר הגנוטיפים, ו-DNA דגימות על קרח. מאחסנים את השמן הייצוב של ה-droplet בטמפרטורת החדר. בעדינות מערבולת ובקצרה צנטריפוגה את כל הריאגנטים מלבד droplet ייצוב שמן. ודא שצילינדר הגז הדחוס שמחובר לכלי ה-droplet ולכלי הקוונפיקציה (טבלת חומרים) מוגדר ב-90 psi. הפעל את כלי הייצור הנפתח ואת המחשב עם תוכנת המכשיר. הפעל את התוכנה ולחץ על התחל אתחול. הפעל סומק בלחץ גבוה על כלי הפקת השחרור אם לא נעשה בו שימוש בשבוע או יותר. הכן את התערובת dpcr עבור 8 בארות של צינור ה-PCR ועוד 10% תוספת, על ידי הוספת 220 μl של מיקס בסיס הגנוטיפ, 8.8 μl כל אחד 10 μm מסוג wildtype ו מוטציה, 39.6 μl כל אחד 10 μm קדימה והפוך התחל, ו17.6 μl של droplet ייצוב שמן14 . לערבב בעדינות את התערובת dPCR על ידי ליטוף הנפח המלא למעלה ולמטה 10-20 פעמים. אין ומערבולת או צנטריפוגה לאחר השמן הייצוב droplet נוספה לתערובת התגובה. להשיג את ה-PCR 8-ושפופרת הסטריפ ולוותר 38 μL של התגובה dPCR התגובות ישירות לתוך החלק התחתון של כל באר14. להסיר את כל הבועות עם קצה הצנרת נקי.הערה: הצינורות של רצועת ה-PCR כי הם נעולים או ארוזים היטב ביחד יכול לגרום לחיובים חשמליים סטטיים, גרימת ביולוגית ואות רועש בעת ניתוח נתוני dPCR. כדי למנוע את זה, להתפשט צינורות לתוך שקיות בידוד נפרד, להימנע לארוז את השקיות, ולשמור את הצינורות משפשף יחד. הוסף 12 μL של דגימת דנ א מוגברת לבארות המתאימות של צינור ה-PCR. עבור הפקד השלילי, הוסף 12 μL של MB H2O.הערה: לנתח דגימות cfDNA בשכפול בארות. עבור הנוזל השדרתי, לנתח לפחות בשכפול, ועבור פלזמה/סרום לנתח כל מדגם בטרילקאט. מצנעת בעדינות את הנפח המלא למעלה ולמטה 10 פעמים כדי לערבב את תערובת התגובה עם דגימת ה-DNA. השיגו שבב מכשיר חדש שיוצר droplet ופיפטה את הנפח המלא מבארות 1-8 של צינור ה-PCR לתוך הערוצים המתאימים A-H בשבב. הימנע לגעת בתחתית הערוצים עם טיפ פיפטה. השיגו צינורית ניקוי חדשה של ה-PCR, והכניסו אותו לתוך מכשיר להפקת droplet. סרוק או הכנס באופן ידני את מזהה שבב הכלי של מכשיר ה-droplet לתוכנה במחשב המכשיר. הזן שמות עבור כל אחד משמונה הערוצים. לחץ על התחל את ההפעלה כדי להתחיל בדגימות מדרוטיזציה. כאשר הושלמה השלמת הדרופלטיזציה, הסירו את הצינורית מרצועת ה-PCR והחילו מכסי שפופרת. העבר את שפופרת הרצועה לציקלייר תרמי ואיזון עם שפופרת רצועה אחרת המכילה 80 μL של מים לכל טוב. לתכנת את תנאי הרכיבה התרמיים14 כ: 95 ° צ’ למשך 10 דקות; 45 מחזורים של שתי טמפרטורות: 95 ° צ’ עבור 30 s וטמפרטורה ריפוי עבור 2 דקות; 98 ° צ’ במשך 10 דקות; ולהמתין 10 ° c. קבע את קצב השיפוע ל-0.5 ° צ’/ים והגדר את אמצעי האחסון לדוגמה ל-80 μL14. כאשר הרכיבה התרמית תושלם, הסר את צינור החשפנות והעבר לכלי הכמת. הסר מכסי הרצועה PCR והחלף באותיות מהירות גבוהה. הפעל את מכשיר הכמת ואת המחשב המחובר עם תוכנת מכשיר. הפעל את תוכנת המכשיר ולחץ על הגדרת הפעלה. הניחו את צינור החשפנות לתוך מכשיר הכמת. השג שבב מכשיר חדש ולסרוק או להזין באופן ידני את מזהה שבב לתוך הכלי. . הכנס את השבב לתוך המכונה הנח את מגן המתכת על גבי השבב וסגור את המכסה של המכשיר. בתוכנת המחשב, הזן שם עבור הפעלת dPCR ועבור כל אחד מבין 8 הערוצים (A-H). בחרו ‘ מצב מהיר ‘ (שיש להשתמש בו עם כמוסות במהירות גבוהה) ולחצו על ‘ התחל ‘ כדי להתחיל בכמת. כאשר הכמת הושלמה, להסיר את מגן מתכת (כדי להינצל ולעשות שימוש חוזר) ולהיפטר שפופרת הסטריפ ושבב ה-PCR. במחשב המכשיר, יומן ההפעלה יכיל קבצי תוצאה עבור כל הפעלה. השתמש בקבצי. fcs עבור כל דוגמה כדי לנתח עם תוכנת האנליסט. 10. ניתוח נתונים הפעל את תוכנת האנליסט ופתח את קבצי ה-. fcs כדי לנתח נתונים ספקטרלי גולמיים. תחת תצוגת ניתוח, בחר בללא שינוי. תחת תצוגת דוגמה, לחץ על התיבות שליד כל אחת מ-8 הדגימות כך שיהיה סימן ביקורת בכל תיבה. התוכנה יהיה להתוות אותות עבור המוטציות (משפחה) ו-wildtype (HEX) לאורך x ו-y צירים, בהתאמה. השתמש בפונקציית המטריצה המחושבת כדי להחיל על הפיצוי הספקטרלי על טיפות שלמות, לפי הוראות היצרן15. כוונן את הגדרות הציר תחת אפשרויות ציר. הגדר את ציר ה-x למינימום של 0 ומקסימום של 30,000, ואת ציר ה-y למינימום של 5,000 ומקסימום של 10,000. כשאותרו אשכולות droplet, התאימו את הצירים כדי להקטין את השטח הריק בגרף.הערה: המיקום של אשכולות המוטציות ומסוג מוטציה יהיה תלוי בבדיקות בשימוש, fluorophore ואת הריכוז שלהם. בחר את המדגם המתאים רקמת הגידול בשליטה חיובית gDNA להגדיר את שלילי (האשכול הקרוב ביותר למקור), המוטציות (האשכול הקרוב ביותר לציר x), ו-wildtype (אשכול הקרוב ביותר לציר y) שערים. ודא שהאשכולות נבדלים ומזוהים בקלות בתוך שיטת מוצלחת. החל את הגדרות השער עבור הפקד החיובי על כל הדגימות על-ידי לחיצה ימנית על דגימת הבקרה החיובית ולחיצה על האפשרות כדי להחיל את כל ההגדרות על דגימות נבחרות. תחת התצוגה הגרפית, לחץ על כרטיסיית דוגמאות מרובות כדי להציג מגרשים עבור כל הדגימות שנבחרו. יצא את התמונה כ-. טיף קובץ. תחת הכרטיסיה סביבת עבודה בקצה השמאלי העליון של המסך, בחר באפשרות ‘ ניתוח ייצוא ‘ (csv) ושמור את קובץ הנתונים שנותח כקובץ csv. פתח את קובץ ה-. csv בתוכנת גיליון אלקטרוני כדי להציג שלילי, מסוג wildtype וספירות מוטציה של מוטציות עבור כל דוגמה. חישוב ה-MAF על-ידי חלוקת מונה ה-droplet של מוטציה מתוקנת של פואסון על-ידי סכום הספירות של מוטציה מתוקנת בתוספת מסוג droplet עבור כל דוגמה.הערה: השתמש בספירה המתוקנת של הפואסון מכיוון שחשבון הסטטיסטיקה של פואסון עשוי להכיל יותר מעותק אחד של ה-DNA המשמש כיעד, ולכן סיכום הטיפות החיוביות עשוי שלא להניב ספירה מדויקת של16.