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Cancer Research

Nachweis und Überwachung von tumorassoziierter zirkulierender DNA in Biofluiden von Patienten

Published: June 08, 2019
doi:
10.3791/59721
, , , , , ,
1Center for Genetic Medicine,Children’s National Health System, 2Institute for Biomedical Sciences,The George Washington University School of Medicine and Health Sciences, 3Dana-Farber Cancer Institute, 4Department of Neurology,University of California San Francisco, 5DIPG Centre of Expertise Zurich,Universitats-Kinderspital Zurich

Summary

Hier stellen wir ein Protokoll zum Nachweis von tumorsomatischen Mutationen in zirkulierender DNA in biologischen Flüssigkeiten (Biofluide) vor. Unsere Droplet-Methode zur digitalen Polymerase-Kettenreaktion (dPCR) ermöglicht die Quantifizierung der Tumormutations-Allelfrequenz (MAF) und ermöglicht eine minimalinvasive Ergänzung zur Diagnose und zeitlichen Überwachung der Tumorreaktion.

Abstract

Komplikationen im Zusammenhang mit vorder- und wiederholter chirurgischer Gewebeentnahme stellen die Notwendigkeit minimalinvasiver Plattformen dar, die in der Lage sind, molekulare Subklassifizierung und zeitliche Überwachung der Tumorreaktion auf die Therapie durchzuführen. Hier beschreiben wir unsere dPCR-basierte Methode zum Nachweis tumorsomatischer Mutationen in zellfreier DNA (cfDNA), die in Patientenbiofluiden leicht verfügbar ist. Obwohl die Anzahl der Mutationen, die in jedem Test getestet werden können, begrenzt ist, bietet diese Methode ein hohes Maß an Empfindlichkeit und Spezifität. Die Überwachung des Mutationsreichtums, wie von MAF berechnet, ermöglicht die Bewertung der Tumorreaktion auf die Therapie und stellt damit eine dringend benötigte Ergänzung zur Röntgenbildgebung bereit.

Introduction

Aufgrund der eingeschränkten Verfügbarkeit von Tumorgewebe für molekulare Analysen ist die Entwicklung hochsensibler Methoden erforderlich, die tumorsomatische Mutationen in Biofluiden des Patienten, einschließlich Plasma, Serum und Zerebrospinalflüssigkeit (CSF), erkennen können. . Beispielsweise stellen pädiatrische diffuse Mittelliniengliome (DMGs) aufgrund ihrer neuroanatomischen Lage eine Herausforderung dar. In den letzten zehn Jahren hat die molekulare Profilierung von DMG-Gewebeproben Treibermutationen in diesem Tumortyp1 aufgedeckt und räumliche und zeitliche Heterogenität von Mutationen aufgedeckt, was eine Biopsie für die Charakterisierung eines Patienten innerhalb einer Krankheit notwendig macht. Untergruppe und Förderung molekulargezielter Therapien2. Als solche, klinische Studien befürworten die Integration von chirurgischen Biopsien für Tumor molekulare Profilierung bei der Vorabdiagnose3,4,5,6. Während der Behandlung beschränkt sich die Überwachung der therapeutischen Reaktion in DMGs auf MRT, die keine Empfindlichkeit hat, um kleine Veränderungen oder Tumorgenomentwicklung zu erkennen. MRT ist auch anfällig für Pseudoprogression zu erkennen, vorübergehende Entzündung an der Stelle des Tumors, die wahre Progression auf Bildgebung imitiert und kann die Interpretation der Tumorreaktion falsch informieren7. So stellen DMGs einen Tumortyp dar, der einen hohen Bedarf an einem alternativen, minimalinvasiven Mittel zur Erkennung von Tumormutationen und zur Überwachung des klinischen Ansprechens hat. Um diesen Bedürfnissen gerecht zu werden, haben wir ein Protokoll zur Erkennung und Quantifizierung der allelischen Häufigkeit von Tumormutationen in cfDNA aus Plasma, Serum und CSF von Kindern mit Mittelliniengliomen entwickelt und optimiert8. Angesichts der Tatsache, dass DMGs im Kindesalter oft (>80%) eine somatische Lysin-Methionin-Mutation an Position 27 der Histonvariante H3.1 (H3.1K27M, 20% der Fälle) oder H3.3 (H3.3K27M, 60% der Fälle) 1 , diese und andere Mutationen, die für DMGs charakteristisch sind (d. h. ACVR1, PIK3R1) Mutant-Allel-Quantifizierung mit cfDNA8. Dieser Test kann angepasst werden, um Hotspot-Mutationen in anderen Tumortypen mit sequenzspezifischen Primern und Sonden zu erkennen. Die Vielseitigkeit dieses Ansatzes macht ihn für eine Vielzahl von Krebsarten anwendbar, die von der Integration von cfDNA-basierten diagnostischen Instrumenten und der therapeutischen Überwachung profitieren würden.

Um niedriggeschlechtliche Frequenzmutationen in cfDNA sensibel zu erkennen, verwenden wir einen Droplet Digital PCR (dPCR)-basierten Ansatz. Bei dieser Methode wird das PCR-Reaktionsgemisch mit Hilfe der dPCR-Plattform (z.B. RainDance) in ein theoretisches Maximum von 10 Millionen Tröpfchen unterteilt, wobei 7-9 Millionen Tröpfchen pro PCR in der Regel experimentell gesehen werden. Aufgrund des hohen Grades an Probenteilung können höchstens ein bis zwei DNA-Moleküle in jedem Tröpfchen vorhanden sein. PCR-Verstärkung und sequenzspezifische Fluoreszenz-Sondenhybridisierung kann in jedem Tröpfchen auftreten, so dass Millionen von Reaktionen stattfinden. Dies maximiert die Empfindlichkeit und ermöglicht den Nachweis seltener mutierter Allele, die sonst vor dem Hintergrund der Wildtyp-DNA unentdeckt bleiben könnten. Die Verwendung von lKLEINsäure(LNA)-Sonden verbessert die Spezifität des Tests, indem die Mischübereinstimmungshybridisierung eingeschränkt undeinegenaue Mutationserkennung 9,10,11unterstützt wird. Hier beschreiben wir unsere Methoden der Probenverarbeitung, cfDNA-Extraktion, Vorverstärkung von Zielallele, dPCR und Datenanalyse.

Protocol

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Review Board der University of California San Francisco (San Francisco, CA; IRB #14-13895) und das Children es National Health System (Washington, D.C.; IRB #1339). Die Proben wurden nach Einholung der informierten Zustimmung des Patienten oder des Vormunds des Patienten gesammelt und untersucht. 1. Einwilligung von Patienten im Rahmen des IRB-Protokolls für die Sammlung und Lagerung biologischer Proben Sammeln Sie Patientenproben, nachdem die schriftliche Einwilligung in Kenntnis der Sachlage von jedem Patienten oder dem Vormund des Patienten für die Teilnahme an einer klinischen Studie oder für das Biorepository eingeholt wurde, wie vom jeweiligen Institutional Review Board genehmigt. Bei den in diese Studie einbezogenen Patienten wurde radiografisch ein Hirntumor diagnostiziert. Es wurden keine Ausschlusskriterien verwendet. Die Proben wurden nach Einholung der informierten Zustimmung des Patienten oder des Vormunds des Patienten gesammelt und untersucht. 2. Blutentnahme und -trennung von Plasma oder Serum Sammeln Sie die Blutprobe mit einem 10,0 ml Zug in Blutentnahmeröhrchen. Wenn Sie Blut für Plasma sammeln, verwenden Sie K2- oder K3-EDTA-Röhrchen, Heparin oder cfDNA-Blutentnahmeröhrchen. Wenn Sie Blut für Serum sammeln, verwenden Sie Gel-Barriere-Röhrchen, die den Gerinnselaktivator und Dasgel enthalten, um Serum zu trennen.HINWEIS: Während 10 ml empfohlen wird, um Replikationsexperimente zu ermöglichen, reicht ein Minimum von 3 ml aus. Um die Blutprobe mit den Reagenzien des Entnahmeröhrchens zu mischen, das Entnahmeröhrchen sorgfältig umkehren. Lassen Sie die Blutproben, aus denen das Serum bei Raumtemperatur für 30 min gesammelt wird, damit Blut gerinnen kann. Wenn Sie Blut verarbeiten, um Plasma zu erhalten, fahren Sie sofort mit Schritt 2.4 fort.HINWEIS: Proben, die für Plasma verarbeitet werden, dürfen vor der Zentrifugation maximal 2 h auf Eis gehalten werden. Ein schneller Übergang von der Blutentnahme zur Verarbeitung minimiert jedoch den cfDNA-Abbau. Zentrifugen-Blutentnahmeröhrchen bei 2.000 x g für 15 min in einer Auf 4 °C eingestellten Zentrifuge, um Plasma oder Serum von weißen und roten Blutkörperchen zu trennen. Achten Sie darauf, die weiße Blutkörperchenschicht (die eine dünne Linie zwischen dem oberen Plasma/Serum-Schicht und der unteren Schicht der verpackten roten Blutkörperchen bildet) nicht zu stören, Pipette die obere Schicht von Plasma/Serum (die klar, gelb oder rosa in der Farbe sein kann) gleichermaßen in 1 ml Aliquots in sterile Polypropylen-Schraubkappenkryovials. Notieren Sie die Objekt-Identifikationsnummer, den Probentyp (Plasma oder Serum) und das Abholdatum auf dem Etikett der Kryovials. Kryovials im Gefrierschrank von -80 °C bis zum Gebrauch aufbewahren. Wenn kein Gefrierschrank von -80 °C verfügbar ist, lagern Sie die Proben bis zu einer Woche bei -20 °C. 3. CSF-Sammlung und -Verarbeitung Sammeln Sie CSF aus einem Shunt, Lendenpunktion oder einer Operation.HINWEIS: Solche Verfahren sollten nur durchgeführt werden, wenn dies von Ärzten für notwendig erachtet wird. Zusätzliche Proben, die über das hinausgehen, was für die klinische Verwendung erforderlich ist, können für Forschungszwecke verwendet werden. Messen Sie das Volumen des gesammelten CSF und notieren Sie sich seine Farbe (blutig, gelb, klar). Zentrifugieren Sie das Sammelrohr bei 10.000 x g für 10 min bei 4 °C, um den Zellabfall zu pellet. Übertragen Sie den CSF-Überstand gleichmäßig in 500 L Aliquots in Polypropylen-Schraubverschluss-Kryovials. Notieren Sie die Identifikationsnummer, den Probentyp und das Datum der Probenentnahme auf dem Etikett der Kryovials. Bei -80 °C bis zur Verwendung lagern. 4. Extraktion von cfDNA aus flüssigen Proben Führen Sie das cfDNA-Extraktionsprotokoll gemäß den Anweisungen im cfDNA-Extraktionskithandbuch12durch. Reinigen Sie den Platz und die Ausrüstung der Bank mit 10% Bleichmittel und 70% Ethanol.HINWEIS: Die Verwendung einer PCR-Haube, regelmäßiges Handschuhwechsel und häufige Dekontamination des Bankraums und der Geräte mit 10 % Bleichmittel und 70 % Ethanol während aller Schritte des Protokolls ist wichtig, um eine Probenkontamination zu vermeiden. Bereiten Sie Aliquots von Reagenzien, z. B. Waschpuffer, aus dem Extraktionskit vor, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden. Patientenproben auf Eis auftauen, bevor sie mit der Extraktion beginnen. Für Plasma/Serum 1 ml Aliquot der Probe auftauen. Für CSF, tauen 500 L Aliquot der Probe.HINWEIS: Lysisschritte (4.5-4.8) des Extraktionsprotokolls unterscheiden sich zwischen Plasma/Serum und CSF, aber ab Schritt 4.9 ist das Protokoll für beide Arten von Biofluiden identisch. Stellen Sie einen Heizblock auf 60 °C für den Lyseschritt (4.6) ein. Bereiten Sie das Lysepuffer- und Träger-RNA-Gemisch in einem 15 ml-Rohr vor, indem Sie 5,6 l Träger-RNA und 0,9 ml Lysepuffer pro Probe12hinzufügen. Für Plasma/Serum 100 l Proteinase K, 1 ml Probe und 0,8 ml Lysepuffer/Träger-RNA-Gemisch, das in Schritt 4.4 hergestellt wird, zu einem beschrifteten 2,0 ml-Rohr hinzufügen. Mix durch Pulswirbelung für 30 s bei hoher Geschwindigkeit12. Geben Sie für CSF 125 L-Proteinase K, 500 l der Probe, 1 ml Lysepuffer/Träger-RNA-Gemisch und 250 L-Gewebelysepuffer zu einem 2,0 ml-Rohr hinzu. Bringen Sie das volle Volumen auf 2 ml, indem Sie 125 l 1x Phosphat-gepufferte Saline (PBS) hinzufügen. Mix durch Pulswirbelung für 30 s bei hoher Geschwindigkeit12. Inkubieren Sie Proben für 30 min bei 60 °C im Heizblock12. Entfernen Sie Proben aus dem Heizblock und senken Sie die Temperatur auf 56 °C. Geben Sie Proben auf die Bank zurück und übertragen Sie das Lysat in neue beschriftete 15 ml-Rohre. Für Plasma/Serum 1,8 ml Nukleinsäurebindungspuffer hinzufügen und 30 s durch Pulswirbelung12mischen. Für CSF 3,6 ml Nukleinsäurebindungspuffer hinzufügen und 30 s durch Pulswirbelung12mischen. Inkubieren Sie Proben für 5 min auf Eis12. Setzen Sie die Säule in den Vakuumstecker ein. Öffnen Sie die Spalte, und legen Sie einen 20 ml Rohrverlängerer in die Spalte12ein. Pipette den Inhalt des 15 ml Rohrdirekt in den Boden des Rohrverlängerers, um zu vermeiden, tröpfte Tröpfchen an den Wänden des Rohrverlängerers. Wenn der Schalter des Vakuumsteckers geschlossen ist, schalten Sie die Vakuumpumpe ein. Sobald der Druck auf 900 mbar aufgebaut ist, öffnen Sie das Ventil des Vakuumsteckers. Das Beispiel fließt nun durch die Spalte. Sobald das gesamte Lysat aus der Säule abgelassen wurde, schalten Sie die Pumpe aus und öffnen Sie die Falltür zum Vakuumstecker, wodurch der Druckgradient entleert wird. Sobald der Druck 0 mbar erreicht ist, schließen Sie das Ventil des Vakuumsteckers und der Falltür. Entfernen Sie den 20 ml Rohrverlängerer, wobei Sie darauf achten, den Extender einer Säule nicht über eine benachbarte Säule zu übergeben, da dies Proben kreuzverunreinigen kann. Entsorgen Sie den Rohrverlängerer. Fügen Sie der Spalte12600 L des ersten Waschpuffers hinzu. Deckel der Rohre offen lassen und die Vakuumpumpe einschalten. Lassen Sie das Manometer 900 mbar erreichen, und drehen Sie dann den Schalter am Vakuumstecker in die offene Position, um den Waschpuffer durch die Säule zu ziehen. Schalten Sie die Vakuumpumpe aus, öffnen Sie die Falltür, um den Druck zu lösen, und entlasten Sie den Druck auf 0 mbar. Drehen Sie das Ventil des Vakuumsteckers in die geschlossene Position. Fügen Sie der Säule 750 L des zweiten Waschpuffers hinzu und wiederholen Sie die Schritte 4.16-4.1712. Fügen Sie der Säule 750 L Ethanol mit MB-Qualität hinzu und wiederholen Sie die Schritte 4.16-4.1712. Schließen Sie den Deckel der Säule, und platzieren Sie die Säule in einem neuen 2,0 ml-Sammelrohr. Entsorgen Sie den Vakuumstecker12. Zentrifugieren Sie das Rohr mit der Säule bei 20.000 x g für 3 min bei Raumtemperatur12. Legen Sie die Säule in ein neues Sammelrohr und öffnen Sie den Deckel des Rohres. Legen Sie ein Laborgewebe über die Oberseite und inkubieren bei 56 °C für 10 min12. Legen Sie die Säule in ein sauberes 1,5 ml PCR-reinigungsrohr und pipette 100 l Elutionspuffer (oder molekularbiologische Klasse H2O (MB H2O)) direkt in die Mitte der Säule. Berühren Sie die Säule nicht mit einer Pipettenspitze. Schließen Sie den Deckel und lassen Sie bei Raumtemperatur für 3 min. Zentrifuge bei 20.000 x g bei Raumtemperatur für 1 min bis elute cfDNA12. Pipette die Eluation zurück in die Säule und inkubieren bei Raumtemperatur für 3 min. Wiederholen Sie die Zentrifugation mit voller Geschwindigkeit für 1 min, um cfDNA ein zweites Mal zu elute, um die Ausbeute zu erhöhen (nach Empfehlung des Herstellers). CfDNA in beschrifteten DNase/RNase-freien PCR-reinigungsrohren bei 4 °C aufbewahren oder direkt mit Schritt 5 fortfahren. 5. Vakuumkonzentration von cfDNA Die Rohre, die eluierte cfDNA enthalten, in Halter am Vakuumkonzentrator einlegen und ausgleichen. Öffnen Sie die Deckel der Rohre. Stellen Sie die Temperatur des Vakuumkonzentrators auf 23 °C ein. Schalten Sie den Vakuumkonzentrator ein, und schalten Sie dann die Dampffalle ein. Zentrifugenproben für 40 min oder bis ein Endvolumen von 10,5-11 l erreicht ist. Wenn das Volumen unter 10,5 l liegt, fügen Sie DNA-Suspensionspuffer oder MB H2O hinzu, um ein Endvolumen von 10,5 l zu erreichen. Pipette das volle Volumen entlang der Wände des Rohres, um Rest-DNA-Fragmente zu entfernen. Kurz zentrifugieren Sie die Proben auf einer Tischzentrifuge, um Tröpfchen an den Wänden der Rohre zu sammeln. Fahren Sie direkt mit dem Vorverstärkungsschritt (Schritt 8) fort oder lagern Sie Proben bei 4 °C. Deckel von Rohren in einer Laborfolie wickeln, um Verunreinigungen zu vermeiden, wenn sie für die spätere Verwendung gelagert werden. 6. Design und Vorbereitung von Primern und Sonden Entwerfen Sie Vorwärts- und Rückwärtsprimer sowie Wildtype- und mutierte LNA-Sonden für die Ziel-/S-/ Kommerziell bestellen lyophilisierte Primer und Sonden (siehe Tabelle der Materialien).HINWEIS: Sequenzen für Primer und Sonden, die auf H3F3A p.K27M und andere Zielmutationen für pädiatrische Mittelliniengliome abzielen, finden Sie in Der Ergänzenden Tabelle 3 von Panditharatna et al., 20188. Vor dem Öffnen der lyophilisierten Primer und Sonden zentrieren Sie die Rohre kurz. Fügen Sie das entsprechende Volumen desDNA-Suspensionspuffers oder MB H2 O, wie auf dem Produktspezifikationsblatt angegeben, hinzu, um die lyophilisierten Primer und Sonden auf eine Konzentration von 100 m wieder auszusetzen. Sanft Wirbel, Pipette auf und ab mehrmals zu mischen und kurz Zentrifugen grundiert und Sonden mit einer Tischzentrifuge. Bereiten Sie 10 -M-Aliquots von Primern und Sonden vor, indem Sie 10 L mit 100 -M-Bestand zu 90 L DNA-Suspensionspuffer oder MB H2O hinzufügen. Bereiten Sie 1 -M-Aliquots von Vorwärts- und Rückwärtsgrundierungen (zur Vorverstärkung) vor, indem Sie 10 L des 10-M-Primers zu 90 L DNA-Suspensionspuffer oder MB H2O hinzufügen. Grundierungen und Sonden bei 4 °C in luftdichten dunklen Behältern aufbewahren. Wickeln Sie Laborfolien um Deckel, um Verunreinigungen zu vermeiden, und decken Sie Sonden in Aluminiumfolie ab, um Lichteinwirkung zu vermeiden. Speichern Sie Sonden bei -20°C für die Langzeitlagerung, wenn sie nicht regelmäßig verwendet werden. 7. Auswahl der Positivkontrollen Wählen Sie Tumorgewebe genomische DNA (gDNA) Proben mit bekannter DNA-Konzentration, die die Mutation von Interesse in einer bekannten allel Häufigkeit als positive Kontrolle verwendet werden. Verwenden Sie 0,025 ng positivkontroll-Tumorgewebe-DNA im Präamplifikationsschritt (Schritt 8).HINWEIS: Dieser DNA-Eingang liefert ein robustes positives Signal auf dPCR (wie durch serielle Verdünnungen von Tumorgewebe gDNA mit H3F3A p.K27M Mutation8) bei gleichzeitiger Minimierung der Menge der erforderlichen Probe bestimmt. 8. Vorverstärkung von Zielallelen HINWEIS: Preampliflifikationsprotokoll ist wie nach Jackson et al., 201613. Reinigen Sie den Platz und die Ausrüstung der Bank mit 10% Bleichmittel und 70% Ethanol. Erhalten Sie 1 M Vorwärts- und Rückwärtsprimer, cfDNA-Proben, gDNA-Positivkontrollen und DNA-Polymerase-Master-Mix und legen Sie sie auf Eis. Berechnen Sie das Volumen der Reagenzien, die erforderlich sind, um die gewünschte Anzahl von cfDNA-Proben und positiv zu kontrollieren, für die Singleplex- oder Multiplex-Vorverstärkung wie folgt: Für die Singleplex-Vorverstärkung (zur Präamplizierung von Wildtyp- und Mutantenallelen für eine einzelne Mutation von Interesse) bereiten Sie eine PCR-Reaktionsmischung vor, indem Sie 17,5 l DNA-Polymerase-Master-Mix und 3,5 l Vorwärts- und Rückwärtsgrundierungen (100 nM) pro Probe13hinzufügen. Für die Multiplex-Vorverstärkung (zur Vorverstärkung von zwei Sätzen von Wildtyp- und Mutanten-Allelen für zwei Mutationen von Interesse) bereiten Sie das PCR-Reaktionsgemisch vor, indem Sie 17,5 l DNA-Polymerase-Master-Mix und 1,75 l jedes Satzes Vorwärts- und Rückwärtsprimer (50 nM) pro Probe hinzufügen. 13.HINWEIS: Bereiten Sie genügend PCR-Reaktionsmischung für die Anzahl der Proben plus 10% extra vor, um einen Pipettierfehler zu berücksichtigen. Geben Sie 24,5 l PCR-Reaktionsgemisch in jeden Brunnen eines 8-Well-PCR-Streifenrohrs13. Geben Sie 10,5 l DNA-Probe in den entsprechenden Brunnen, um das Gesamtreaktionsvolumen auf 35 l13zu erhöhen. Die volle Lautstärke 10 Mal nach oben und unten zu pipetten, um sie zu mischen. PCR-Verstärkung bei 98 °C für 3 min durchführen; 9 Zyklen von 98 °C für 10 s, Glühtemperatur für 3 min, 72 °C für 30 s; und eine Verlängerung bei 72 °C für 2 min13. Übertragen Sie das gesamte Volumen des vorverstärkten Produkts auf beschriftete DNase/RNase freie PCR-saubere Rohre und verdünnen Sie sie in einem 140-L-TE-DNA-Suspensionspuffer (pH 8.0)13. Wickeln Sie die Deckel der Rohre in Laborfolie. Lagern Sie das vorverstärkte Produkt bei 4 °C. Zur Langzeitkonservierung bei -20 °C lagern. 9. Detektion und Quantifizierung von Ziel-DNA mit dPCR Reinigen Sie den Platz und die Ausrüstung der Bank mit 10% Bleichmittel und 70% Ethanol. Legen Sie 10 M Primer und Sonden, Genotypisierungs-Master-Mix und DNA-Proben auf Eis. Das Tröpfchen stabilisierendes Öl bei Raumtemperatur aufbewahren. Sanft wirbeln und kurz zentrieren alle Reagenzien außer Tröpfchenstabilisierungsöl. Stellen Sie sicher, dass die komprimierte Stickstoffgasflasche, die am Tröpfchenerzeugungsgerät und dem Quantifizierungsinstrument (Materialtabelle) befestigt ist, auf 90 psi eingestellt ist. Schalten Sie das Drop-Generierendes Instrument und den Computer mit der Instrumentensoftware ein. Starten Sie die Software, und klicken Sie auf Initialisieren starten. Führen Sie eine Hochdruckspülung auf dem Tropfen erzeugenden Instrument aus, wenn es in einer Woche oder mehr nicht verwendet wurde. Bereiten Sie das dPCR-Reaktionsgemisch für 8 Bohrungen des PCR-Streifenrohrs plus 10 % extra vor, indem Sie 220 l Genotypisierungs-Master-Mix, 8,8 l je 10 -M-Wildtyp- und Mutantensonden, 39,6 L mit jeweils 10 -M Vorwärts- und Rückwärtsprimern und 17,6 l Tröpfchenstabilisierungsöl14 ,/c0 >. Mischen Sie das dPCR-Reaktionsgemisch vorsichtig, indem Sie das volle Volumen 10-20 Mal nach oben und unten pipetieren. Wirbel oder Zentrifuge nicht nach Tropfenstabilisierendes Öl in das Reaktionsgemisch aufgenommen wurde. Besorgen Sie sich ein PCR 8-Well-Bandrohr und geben Sie 38 l dPCR-Reaktionsgemisch direkt in den Boden jedes Brunnens14. Entfernen Sie alle Blasen mit einer sauberen Pipettenspitze.HINWEIS: PCR-Streifenrohre, die eng miteinander verriegelt oder dicht zusammengepackt sind, können zu statischen elektrischen Ladungen führen, was bei der Analyse von dPCR-Daten zu Koaleszenz und lautem Signal führt. Um dies zu vermeiden, aliquot Streifen rohre in separate Biohazard-Beutel, vermeiden Sie über-Verpackung der Säcke, und halten Sie die Rohre von reiben zusammen. Fügen Sie 12 l vorverstärkte DNA-Probe in die entsprechenden Brunnen des PCR-Streifenrohrs. Für die Negativkontrolle 12 L MB H2O hinzufügen.HINWEIS: Analysieren Sie cfDNA-Proben in Replizienbohrungen. Analysieren Sie für CSF mindestens doppelt, und analysieren Sie für Plasma/Serum jede Probe in dreifacher Ausfertigung. Das volle Volumen 10 Mal vorsichtig nach oben und unten pipette, um das Reaktionsgemisch mit der DNA-Probe zu mischen. Erhalten Sie einen neuen tröpfchengenerierenden Instrumentenchip und Pipette die volle Lautstärke von den Brunnen 1-8 des PCR-Streifenrohrs in die entsprechenden Kanäle A-H im Chip. Vermeiden Sie es, den Boden der Kanäle mit einer Pipettenspitze zu berühren. Besorgen Sie sich ein neues sauberes PCR-Streifenrohr und legen Sie es in das Tröpfchen-Erzeugungsgerät ein. Scannen oder geben Sie die letletgenerierende Instrumentenchip-ID manuell in die Software auf dem Instrumentencomputer ein. Geben Sie die Namen für jeden der 8 Kanäle ein. Klicken Sie auf Ausführen starten, um mit dem Dropletisieren von Beispielen zu beginnen. Wenn die Tröpfung abgeschlossen ist, entfernen Sie das PCR-Streifenrohr und tragen Sie Streifenrohrkappen auf. Übertragen Sie das Bandrohr auf einen thermischen Cycler und balancieren Sie mit einem anderen Streifenrohr, das 80 l Wasser pro Brunnen enthält. Programmieren Sie die thermischen Radfahrbedingungen14 wie: 95 °C für 10 min; 45 Zyklen mit zwei Temperaturen: 95 °C für 30 s und Glühtemperatur für 2 min; 98 °C für 10 min; und halten Sie bei 10 °C. Stellen Sie die Rampenrate auf 0,5 °C/s ein, und legen Sie das Probenvolumen auf 80 l14fest. Wenn das thermische Radfahren abgeschlossen ist, entfernen Sie das Streifenrohr und übertragen Sie es auf das Quantifizierungsinstrument. Entfernen Sie PCR-Streifenkappen und ersetzen Sie sie durch Hochgeschwindigkeitskappen. Schalten Sie das Quantifizierungsinstrument und den angeschlossenen Computer mit Instrumentensoftware ein. Starten Sie die Instrumentensoftware, und klicken Sie auf Ausführen einrichten. Legen Sie das Streifenrohr in das Quantifizierungsinstrument. Erhalten Sie einen neuen Quantifizierungsinstrumentenchip und scannen Sie oder geben Sie die Chip-ID manuell in das Gerät ein. Stecken Sie den Chip in die Maschine. Legen Sie das Metallschild auf den Chip und schließen Sie den Deckel des Instruments. Geben Sie in der Computersoftware einen Namen für den dPCR-Lauf und für jeden der 8 Kanäle (A-H) ein. Wählen Sie Fast Mode (der mit Highspeed-Caps verwendet werden muss) und klicken Sie auf Start, um mit der Quantifizierung zu beginnen. Wenn die Quantifizierung abgeschlossen ist, entfernen Sie die Metallabschirmung (zu speichern und wiederverwendet werden) und entsorgen Sie das PCR-Streifenrohr und den Chip. Auf dem Instrumentencomputer enthält das Run Log Ergebnisdateien für jeden Durchlauf. Verwenden Sie die .fcs-Dateien für jedes Beispiel, um sie mit der Analystensoftware zu analysieren. 10. Datenanalyse Starten Sie die Analystensoftware und öffnen Sie die .fcs-Dateien, um rohe Spektraldaten zu analysieren. Wählen Sie unter Analyseansicht Die Option Intaktaus. Klicken Sie unter Beispielansicht auf die Kästchen neben jedem der 8 Beispiele, damit in jedem Kontrollkästchen ein Häkchen steht. Die Software wird Signale für die Mutanten (FAM) und Wildtype (HEX) Allele entlang der x- bzw. y-Achsen darstellen. Verwenden Sie die berechnete Matrixfunktion, um die spektrale Kompensation auf intakten Tröpfchen anzuwenden, wie es der Hersteller vorgibt15. Passen Sie die Achseneinstellungen unter Achsenoptionen an. Legen Sie die x-Achse auf mindestens 0 und maximal 30.000 und die y-Achse auf ein Minimum von -5.000 und maximal 10.000 fest. Wenn Tröpfchencluster identifiziert wurden, passen Sie die Achsen an, um den leeren Platz im Diagramm zu reduzieren.HINWEIS: Die Position von mutierten und Wildtyp-Clustern hängt von den verwendeten Sonden, dem Fluorophor und ihrer Konzentration ab. Wählen Sie die Probe aus, die dem Positivkontrolltumorgewebe gDNA entspricht, um die negativen (Cluster am nächsten zum Ursprung), Mutanten (Cluster am nächsten an der x-Achse) und Wildtype (Cluster am nächsten an der y-Achse) Zusetzen zu setzen. Stellen Sie sicher, dass die Cluster in einem erfolgreichen Test eindeutig und leicht identifiziert werden können. Wenden Sie die Gate-Einstellungen für die Positivsteuerung auf alle Samples an, indem Sie mit der rechten Maustaste auf das Positivsteuerelementbeispiel klicken und auf die Option Anwenden aller Einstellungen auf ausgewählte Samplesklicken. Klicken Sie in der grafischen Ansicht auf die Registerkarte Mehrere Samples, um Diagramme für alle ausgewählten Beispiele anzuzeigen. Exportieren Sie das Bild als . TIF-Datei. Wählen Sie auf der Registerkarte Arbeitsbereich oben links auf dem Bildschirm die Option Analyse exportieren (csv) aus, und speichern Sie die analysierte Datendatei als CSV-Datei. Öffnen Sie die CSV-Datei in der Tabellenkalkulationssoftware, um negative, wilde und mutierte Tröpfchenzählungen für jedes Beispiel anzuzeigen. Berechnen Sie die MAF, indem Sie die Poisson-korrigierte mutierte Tröpfchenzahl durch die Summe der Poisson-korrigierten Mutanten- plus Wildtyp-Tröpfchenanzahl für jede Probe dividieren.HINWEIS: Verwenden Sie die poisson korrigierte Zählung, da Poisson-Statistiken die Tatsache ausmachen, dass positive Tröpfchen mehr als eine einzige Kopie der Ziel-DNA enthalten können, und daher die Sumsierung der positiven Tröpfchen möglicherweise keine genaue Anzahl16ergibt.

Representative Results

Abbildung 1 zeigt repräsentative Ergebnisse für den erfolgreichen Nachweis der H3F3A p.K27M-Mutation im vorverstärkten Plasma (oben links) und CSF (obere rechte Gruppe) cfDNA von zwei Kindern mit DMG. cfDNA-Proben wurden in der Replikation analysiert, aber für jeden Stichprobentyp wird nur ein repräsentatives Diagramm angezeigt. Die dPCR-Plots zeigen eine erfolgreiche Tröpfchenerzeugung mit 7-9 Millionen Tröpfchen pro PCR-Brunnen (die meisten davon sind negative Tröpfchen, die keine Ziel-DNA enthalten). Mindestens 7 Millionen Tröpfchen pro PCR-Brunnen deuten auf eine erfolgreiche Tröpfchen-Tröpfung hin, während weniger als 7 Millionen auf einen Fehler des Testes hinweisen, in diesem Fall sollte der Benutzer keine Datenanalyse durchführen. Abbildung 1 zeigt eine klare Trennung zwischen mutierten und Wildtyp-Clustern entlang der x- bzw. y-Achsen. Robuste Wildtypcluster weisen darauf hin, dass die cfDNA-Extraktion erfolgreich war, da Vorlagen-DNA vorhanden ist. Mutante Cluster zeigen einen MAF von 1,60% bzw. 39,92% für die Plasma- und CSF-Proben, was einen positiven Nachweis der Mutation zeigt. Für diese Patienten entsprechen die dPCR-Ergebnisse dem Tumormutationsstatus, wie durch genomische Analyse des Biopsietumorgewebesbestätigt wird 8. Die Negativkontrolle (untere linke Seite) zeigt 0 mutierte und 0 Wildtyptröpfchen, was darauf hinweist, dass es keine Kontamination des PCR-Reaktionsgemisches gab. Das positive Kontrolltumorgewebe gDNA (unteres rechtes Panel) zeigt die Mutation, die bei der erwarteten Allelic-Frequenz für die ausgewählte Tumorprobe nachgewiesen wird. In Abbildung 2werden repräsentative Ergebnisse für den erfolglosen Nachweis der Mutation des Interesses, H3F3A p.K27M, in Plasma-cfDNA von einem Kind mit DMG gezeigt. Der Mutationsstatus wurde durch die genomische Analyse von Tumorgewebebestätigt 8. Repräsentative Ergebnisse aus zwei replizierten PCR-Bohrungen werden angezeigt (obere Panels). Die Gesamtzahl der Tröpfchen, einschließlich negativer Tröpfchen, liegt zwischen 7-9 Millionen pro PCR-Gut, was auf eine erfolgreiche Tröpfchen-Tätung hindeutet. Die Wildtyp-Cluster, die entlang der y-Achse geplottet werden, zeigen etwa 7-8.000 Wildtyptröpfchen pro PCR-Gut für das Plasma cfDNA, was auf eine erfolgreiche cfDNA-Extraktion hindeutet (da es Ziel-Wildtyp-DNA in der Probe gibt). In der Plasmaprobe werden jedoch 0 mutierte Tröpfchen nachgewiesen. Das untere linke Bedienfeld zeigt negative Kontrolle (MB H2O) ohne Wildtyp oder mutierte Tröpfchen; und das untere rechte Panel zeigt die positive Kontrolle vorverstärkter Tumorgewebe gDNA (0,025 ng) mit positiver Mutationsdetektion. Wie in dieser Abbildung dargestellt, kann das Fehlen von Mutationsnachweis im Plasma nicht notwendigerweise bedeuten, dass der Patient Wildtyp für die Mutation des Interesses ist, da falsche Negative auftreten8. In einigen Fällen, wenn die Mutation im Plasma fehlt, das bei der Vorabbiopsie gesammelt wurde, wird sie im Plasma nachgewiesen, das von demselben Patienten zu einem späteren Zeitpunkt8erhalten wurde. Abbildung 1 : Erfolgreiche Erkennung von H3F3A p.K27M-Mutation in vorverstärktem Plasma und CSF cfDNA bei Kindern mit Mittelliniengliomen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 2 : Falsche negative Ergebnisse aus der Analyse einer vorverstärkten Plasma-cfDNA-Probe eines Patienten, von dem bekannt ist, dass er die Mutation des Interesses birgt, H3F3A p.K27M, im Tumor. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

Hier haben wir unsere Methode zur Detektion und Quantifizierung der Allelhäufigkeit von Tumormutationen in cfDNA aus der flüssigen Biopsie des Patienten vorgestellt. Wir betonen wichtige Schritte für den Erfolg dieser Methode, einschließlich voranalytischer Probenverarbeitung, cfDNA-Extraktion, PCR-Assay-Design und Datenanalyse. Zur Begrenzung des verwendeten Probenvolumens wird cfDNA aus 1 ml Plasma, aber nur 500 l CSF extrahiert. Bei der Extraktion aus CSF wird gemäß der Empfehlung des Herstellers das Protokoll zur Extraktion aus 1 ml Urin (nach dem cfDNA-ExtraktionskitHandbuch 12) verwendet. Der Unterschied im Probenvolumen zwischen Plasma und CSF ist auf niedrigere Mengen an tumorspezifischer cfDNA im Plasma im Vergleich zu CSF von Patienten mit Hirntumoren zurückzuführen, was größere Probenvolumina für die Mutationsdetektion erforderlich macht8. Wenn die Probe verfügbar ist, können mehr als 1 ml Plasma extrahiert werden, um eine höhere DNA-Ausbeute zu erzielen. Bei pädiatrischen Patienten ist es jedoch wichtig, die Menge des verwendeten Blutes zu minimieren, wann immer dies möglich ist, da selbst ein einfaches Verfahren wie die Blutentnahme für pädiatrische Patienten mit Krebs, die sich einer Strahlentherapie unterziehen, ermüdet. Die Extraktion aus 1 ml Aliquots Plasma ermöglicht auch Replizierungen, so dass der Assay wiederholt werden kann (z. B. bei Versagen bei der DNA-Extraktion oder Probenkontamination).

Um die nicht unbedingt erforderliche Verwendung von Proben zu reduzieren, wird cfDNA in der Regel nicht quantifiziert. Wir haben jedoch einen Bereich von cfDNA-Konzentrationen zwischen 0,2-2 ng/l bzw. 0,6-13 ng/l im Plasma bzw. CSF gefunden. Angesichts der geringen Menge an cfDNA und der Tatsache, dass tumorspezifische mutierte Allele in geringer Häufigkeit vorhanden sind, ist ein Vorverstärkungsschritt mit den gleichen Primern, die für dPCR verwendet werden, erforderlich, um die Menge der Ziel-DNA in der Probe signifikant zu erhöhen, Mutationserkennung8. Die Verdünnung des vorverstärkten Produkts im DNA-Suspensionspuffer bietet ausreichend Volumen für technische Replikationen, was bei der Unterscheidung wahrer Positivwerte hilft. Da die Anzahl der mutierten Tröpfchen gering sein kann (z. B. zwischen 0-2 mutierten Tröpfchen in einer Plasmaprobe), ist die Einbeziehung technischer Replikationen der Schlüssel zur Lösung des Mutationsstatus. Während eine PCR-Bohrung 0 mutierte Tröpfchen ergeben kann, können die anderen beiden 1-2 für eine einzelne Plasmaprobe ergeben, die in Dreifacher Richtung analysiert wird; Daher ermöglicht die Einbeziehung von Replikationen eine höhere Genauigkeit bei der Bestimmung des Mutationsstatus. Der MAF wird dann als Durchschnitt der Replikationswerte berechnet.

Multiplexierte Vorverstärkung (vorverstärkender Wildtyp und mutierte Allelen zweier Mutationen von Interesse) erhöht den Nutzen einer einzelnen Probe, da das gleiche Ausgangsmaterial verwendet werden kann, um auf zwei Mutationen zu testen. Wichtig ist, dass ein Multiplex-Vorverstärkerprodukt während dPCR in Singleplex analysiert werden kann, um die Einfachheit zu erhöhen, wie hier beschrieben. Sowohl Die Vorverstärkungs-PCR als auch dPCR können jedoch multiplexiert sein. Beim Multiplexieren müssen die Bedingungen sowohl für Primer- als auch für Sonden optimiert werden: Die Glühtemperaturen müssen ähnlich sein, um in der PCR-Verstärkung zusammen zu laufen, und Sonden sollten so konzipiert sein, dass sie unterschiedliche Cluster erzeugen (basierend auf Fluoreszenzsignal und Intensität). Führen Sie bei der Validierung eines neuen Satzes von Primern und Sonden einen Glühtemperaturgradienten aus, um die optimale Glühtemperatur basierend auf dem vom Hersteller vorgeschlagenen Bereich zu bestimmen. Vor der Prüfung von Sonden an patienten cfDNA-Proben validieren Sie sie mit synthetischen DNA-Konstrukten und/oder Tumorgewebe-gDNA verschiedener Eingänge (d. h. bis zu 10 ng).

Für den Nachweis von mutierten Allelen mit größerer Spezifität und reduzierter Diskrepanz bei der Hybridisierung der Sonde zur Ziel-DNA werden gesperrte Nukleinsäures (LNA)-Sonden verwendet. LNA ist ein Nukleinsäure-Analog mit einer Methylenbrücke, die den 2′-Sauerstoff und 4′-Kohlenstoff des Riboserings9verbindet. Die Methylenbrücke sperrt die Nukleinsäure in eine starre bizyklische Konformation, die die Flexibilität einschränkt, die thermische Duplexstabilität erhöht und die Spezifität der Sondenhybridisierung auf die Ziel-DNA10,18 , verbessert. 19. Wenn eine einzige Basisübereinstimmung zwischen LNA-Sonde und Vorlagen-DNA besteht, destabilisiert sich die Duplexbildung zwischen Sonde und Ziel. Als solche verbessern LNA-Sonden die Spezifität der Sondenbindung und führen zu einem höheren Signal-Rausch-Verhältnis11. Die Analyse von Plasma und CSF von nicht-CNS-kranken pädiatrischen Patienten hat die Spezifität unseres Tests mit LNA-Sonden auf H3F3A p.K27M festgestellt, um festzustellen, dass eine allelische Häufigkeit von etwa 0,001% als falsch positiv angesehen wird. 8. Weitere Überlegungen zur Optimierung des Designs von Sonden und Primern, einschließlich GC-Gehalt, Amplicongröße, Sondenreporterfarbstoffen und Quenchern, finden Sie in den dPCR-Herstellerrichtlinien14,17. Obwohl unsere Methode für die Verwendung mit dem RainDance-System optimiert ist, kann das Protokoll für die Verwendung mit anderen dPCR-Plattformen angepasst werden.

Die hier vorgestellte Methode schöpft Kraft aus der hohen Empfindlichkeit und Zielanreicherung durch dPCR, die nach wie vor die Plattform der Wahl für den Nachweis seltener Tumormutationen in cfDNA ist. Obwohl leistungsstark, ist dPCR in der Anzahl der Mutationen begrenzt, auf die in einem einzigen Test getestet werden kann. Eine Alternative zu dPCR ist die Sequenzierung der nächsten Generation (NGS), die mehrere Mutationen über viele Gene erkennen kann, was den Nutzen einer einzelnen Probe erhöht. NGS kann Mutationen in CSF und Plasma von Patienten mit Hirnstammgliomen20erkennen, ist jedoch derzeit weniger empfindlich als dPCR bei der Erkennung von Tumormutationen in cfDNA, mit Nachweisgrenzen von 0,1-10% MAF im Vergleich zu 0,001% bei PCR-basierten Ansätzen21 . dPCR erreicht außerdem eine schnellere Durchlaufzeit als NGS, was eine schnelle Erkennung von Interessensmutationen ermöglicht. Der PCR-Ansatz ist bei Krebsarten anwendbar und kann erweitert werden, um Hotspot-Mutationen und methylierte cfDNA22zu erkennen.

Die flüssige Biopsie steckt in der Tat noch in den Kinderschuhen und wird eine Weiterentwicklung für die Anpassung an bestimmte Krankheiten erfordern. Die Tumorüberwachung im Kontext der Tumorentwicklung wird die nächste Herausforderung sein, bei der eine Plattform erforderlich wäre, die in der Lage ist, neu auftretende Mutationen mit hoher Empfindlichkeit zu erkennen. Darüber hinaus werden Plattformen, die in der Lage sind, eine Vielzahl von Biomolekülen (Peptide, Zytokine, RNA) zu detektieren, bei der Beurteilung der Tumorreaktion auf die Behandlung sowie bei der Weiterentwicklung personalisierter klinischer Interventionen von großem Nutzen sein.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren möchten die Großzügigkeit aller Patienten und ihrer Familien würdigen. Diese Arbeit wurde durch Fördermittel der Smashing Walnuts Foundation (Middleburg, VA), der V Foundation (Atlanta, GA), des Gabriella Miller Kids First Data Resource Center, des Clinical and Translational Science Institute at Children es National ( 5UL1TR001876-03), Musella Foundation (Hewlett, NY), Matthew Larson Foundation (Franklin Lake, NJ), The Lilabean Foundation for Pediatric Brain Cancer Research (Silver Spring, MD), the Childhood Brain Tumor Foundation (Germantown, MD), the Children es Brain Tumor Tissue Consortium (Philadelphia, PA) und Rally Foundation for Childhood Cancer Research (Atlanta, GA).

Materials

10mM Tris-HCl, 0.1mM EDTA DNA Suspension Buffer (pH 8.0) Teknova T0227
BD Vacutainer K2-EDTA 7.2mg Blood Collection Tubes (10mL) Becton Dickinson Diagnostics 367525 For plasma collection
BD Vacutainer Plastic Serum tube with Red BD Hemogard Closure (10mL) Becton Dickinson Diagnostics 367895 For serum collection
Bleach General Lab Supplier
Buffer ATL Qiagen 19076
Cell-Free DNA Blood Collection Tubes Streck 218961 cfDNA blood collection tubes (optional)
CentriVap Concentrator Labconco 7810010
Forward Primer Integrated DNA Technologies, Inc. Custom design
MiniAmp Thermal Cycler Thermofisher Scientific A37834
Molecular Biology Grade Absolute Ethanol (200 proof) General Lab Supplier
Mutant Probe Integrated DNA Technologies, Inc. Custom design
PAXgene Blood ccfDNA tubes PreAnalytiX 768115 cfDNA blood collection tubes (optional)
PCR 8 well strip tube caps VWR 10011-786
PCR 8 well strip tubes Axygen PCR-0208-C
Pipette (p20, p200, p1000) General Lab Supplier
Pipette filter tips (p20, p200, p1000) General Lab Supplier
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix New England Biolabs Inc M0494S
QIAamp Circulating Nucleic Acid HandBook  Qiagen cfDNA extraction kit handbook (2013 edition)
QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit Qiagen 55114 cfDNA extraction kit (Protocol Step 4) 
QIAamp MinElute Virus Spin Kit Qiagen 57704 Optional kit for DNA extraction from small (< or =200µL) sample volumes
Qiavac 24 Plus Qiagen 19413 For use with QIAamp Circulating Nucleic Acids kit
Raindance Consumable Kit Bio-Rad 20-04411 Contains droplet-generating instrument chips, quantification instrument chips, PCR strip caps including high-speed caps, and droplet stabilizing oil
Raindance Sense Instrument Bio-Rad Quantification instrument (used in Protocol Step 9)
Raindance Source Instrument Bio-Rad Droplet-generating instrument (used in Protocol Step 9)
RainDrop Analyst II Software RainDance Technologies Analyst software used for Data Analysis (Protocol Step 10)
Refrigerated Vapor Trap Savant RVT5105-115
Reverse Primer Integrated DNA Technologies, Inc. Custom design
Smartblock 2mL Eppendorf 05 412 506
TaqMan Genotyping Master Mix Thermofisher Scientific 4371353
Thermomixer C Eppendorf 14 285 562PM
WT Probe Integrated DNA Technologies, Inc. Custom design
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References

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TumorCirculating DNADigital PCRDroplet Digital PCRMolecular DiagnosisTumor GenotypingTumor Mutation LoadLongitudinal MonitoringGene Expression

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Bonner, E. R., Saoud, K., Lee, S., Panditharatna, E., Kambhampati, M., Mueller, S., Nazarian, J. Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids. J. Vis. Exp. (148), e59721, doi:10.3791/59721 (2019).
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