الكشف عن ورصد الورم المرتبطة تعميم الحمض النووي في Biofluids المريض
Summary
هنا، نقدم بروتوكول للكشف عن الطفرات الجسدية الورم في تعميم الحمض النووي الموجود في السوائل البيولوجية المريض (السوائل الحيوية). لدينا قطرات الرقمية البوليميراز سلسلة رد الفعل (dPCR) طريقة تستند إلى تمكين القياس الكمي لطفرة الورم تردد الاليليك (MAF)، مما يسهل تكملة طفيفة التوغل لتشخيص والرصد الزمني للاستجابة الورم.
Abstract
المضاعفات المرتبطة مسبقا وتكرار أخذ العينات الأنسجة الجراحية تقديم الحاجة إلى منصات طفيفة التوغل قادرة على التصنيف الفرعي الجزيئي والرصد الزمني لاستجابة الورم للعلاج. هنا، نحن نصف طريقة لدينا المستندة إلى dPCR للكشف عن الطفرات الجسدية الورم في الحمض النووي الخلية الحرة (cfDNA)، متاحة بسهولة في biofluids المريض. على الرغم من أن هذه الطريقة محدودة في عدد الطفرات التي يمكن اختبارها في كل اختبار، إلا أنها توفر مستوى عالًا من الحساسية والخصوصية. رصد وفرة الطفرة، كما تحسب هاف، يسمح لتقييم استجابة الورم للعلاج، وبالتالي توفير تكملة تشتد الحاجة إليها للتصوير الإشعاعي.
Introduction
بسبب القيود المفروضة على توافر أنسجة الورم للتحليلات الجزيئية، هناك حاجة لتطوير أساليب حساسة للغاية قادرة على الكشف عن الطفرات الجسدية الورم في السوائل الحيوية المريض، بما في ذلك البلازما والمصل والسائل الدماغي الشوكي (CSF) . على سبيل المثال، تشكل الأورام الدبقية للخط الأوسط المنتشرة لدى الأطفال (DMGs) تحدياً بسبب موقعها العصبي الذرّي. على مدى العقد الماضي، كشف التنميط الجزيئي لعينات الأنسجة DMG طفرات السائق في هذا النوع من الورم1 وكشف عن عدم تجانس الطفرات المكانية والزمنية، مما يجعل خزعة اللازمة لتوصيف المريض داخل مرض المجموعة الفرعية وتعزيز العلاجات المستهدفة جزيئيا2. على هذا النحو، التجارب السريرية الدعوة إلى دمج الخزعات الجراحية للتنميط الجزيئي الورم في التشخيص مقدما3،4،5،6. أثناء العلاج، يقتصر رصد الاستجابة العلاجية في DMGs على التصوير بالرنين المغناطيسي، الذي يفتقر إلى الحساسية للكشف عن التغيرات الصغيرة أو تطور الجينوم الورم. التصوير بالرنين المغناطيسي هو أيضا عرضة للكشف عن التضواء الزائفة، التهاب عابر في موقع الورم الذي يحاكي التقدم الحقيقي على التصوير، وقد تضليل تفسير استجابة الورم7. وهكذا، تمثل DMGs نوع الورم مع حاجة عالية لبديل، وسيلة طفيفة التوغل للكشف عن طفرات الورم ورصد الاستجابة السريرية. من أجل تلبية هذه الاحتياجات، قمنا بتطوير وتحسين بروتوكول للكشف عن، وقياس التردد الالي، وطفرات الورم في cfDNA من البلازما والمصل وCSF للأطفال الذين يعانون من الأورام الدبقية المتوسطة8. وبالنظر إلى أن الـ DMGs الطفولة في كثير من الأحيان (>80٪) تأوي طفرة الليسين إلى الميثيونين الجسدية في الموقع 27 من متغير الهيستون H3.1 (H3.1K27M، 20٪ من الحالات) أو H3.3 (H3.3K27M، 60٪ من الحالات)1، هذه وغيرها من الطفرات المميزة من DMGs (أي ACVR1، PIK3R1) استهدفت ل متحولة allele القياس الكمي باستخدام cfDNA8. يمكن تصميم هذا الفحص للكشف عن الطفرات الساخنة في أنواع الأورام الأخرى باستخدام التمهيديات وتحقيقات تسلسل محددة. وبراعة هذا النهج تجعل منه قابلا للتطبيق على مجموعة متنوعة من أنواع السرطان التي من شأنها أن تستفيد من إدماج أدوات التشخيص القائمة على cfDNA والرصد العلاجي.
للكشف بحساسية عن طفرات التردد المنخفضة في cfDNA، نستخدم نهجًا قائمًا على PCR رقميًا (dPCR). في هذه الطريقة، يتم تقسيم خليط تفاعل PCR إلى حد أقصى نظري قدره 10 مليون قطرة باستخدام منصة dPCR (على سبيل المثال، RainDance)، مع 7-9 مليون قطرة لكل PCR ينظر إليها بشكل جيد بشكل جيد تجريبياً. بسبب درجة عالية من تقسيم العينة، على الأكثر واحد فقط إلى اثنين من جزيئات الحمض النووي يمكن أن تكون موجودة في كل قطرة. يمكن أن يحدث تضخيم PCR وتسلسل محددة الهجين التحقيق الفلورسنت في كل قطرة، بحيث الملايين من ردود الفعل تحدث. وهذا يزيد من الحساسية ويتيح الكشف عن الأليلات المتحولة النادرة، والتي قد تذهب خلاف ذلك دون الكشف عنها على خلفية من الحمض النووي البري. استخدام حمض نووي مؤمن (LNA) تحقيقات يعزز خصوصية الاختبار عن طريق تقييد عدم تطابق التهجين ودعم الكشف الدقيق عن الطفرة9و10و11. هنا، ونحن نصف أساليبنا لمعالجة العينات، استخراج cfDNA، preamplification من الأليلات الهدف، dPCR وتحليل البيانات.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا قدمنا طريقتنا للكشف عن وتحديد التردد الالي لطفرات الورم في cfDNA من خزعة السائل المريض. ونشدد على الخطوات الحاسمة لنجاح هذه الطريقة، بما في ذلك معالجة العينات قبل التحليلية، واستخراج الـ cfDNA، وتصميم فحص PCR، وتحليل البيانات. للحد من حجم العينة المستخدمة، يتم استخراج cfDNA من 1 مل من البلازما ولكن فقط 500 درجة مئوية من CSF. عند استخراج من CSF، يتم استخدام بروتوكول لاستخراج من 1 مل من البول (بعد كتيب مجموعة استخراج cfDNA12)،وفقا لتوصية الشركة المصنعة. الفرق في حجم العينة المطلوبة بين البلازما وCSF يرجع إلى انخفاض مستويات cfDNA خاصة بالورم في البلازما مقارنة مع CSF من المرضى الذين يعانون من أورام الدماغ، مما يستلزم كميات أكبر من العينة للكشف عن الطفرة8. إذا كانت العينة متوفرة، يمكن استخراج أكثر من 1 مل من البلازما لإنتاج عائد أعلى من الحمض النووي. ومع ذلك، في حالة مرضى الأطفال، من المهم تقليل كمية الدم المستخدمة كلما كان ذلك ممكنا، كما حتى إجراء بسيط مثل سحب الدم هو fatiguing لمرضى الأطفال الذين يعانون من السرطان الذين يخضعون للعلاجات الإشعاعية. استخراج من aliquots 1 مل من البلازما أيضا تمكن تكرار عمليات الاستخراج، بحيث يمكن تكرار الفحص (على سبيل المثال، في حالات الفشل في استخراج الحمض النووي أو تلوث العينة).
في محاولة للحد من أي استخدام العينة التي ليست ضرورية تماما، لا يتم تحديد cfDNA عادة. ومع ذلك، وجدنا مجموعة من تركيزات cfDNA بين 0.2-2 نانوغرام/ميكرولتر و 0.6-13 نانوغرام/ميكرولتر في البلازما وCSF، على التوالي. وبالنظر إلى انخفاض كمية cfDNA، وحقيقة أن الأليلات متحولة محددة الورم موجودة على وتيرة منخفضة، خطوة ما قبل التضخيم باستخدام نفس المجموعة من التمهيديات المستخدمة لdPCR ضروري لزيادة كبيرة في كمية الحمض النووي المستهدف في العينة، والمساعدة في الكشف عن الطفرة8. تخفيف المنتج قبل تضخيمها في المخزن المؤقت تعليق الحمض النووي يوفر حجم كاف لتكرار التقنية، مما يساعد في التمييز بين الإيجابيات الحقيقية. لأن عدد قطرات متحولة يمكن أن تكون منخفضة (على سبيل المثال، بين 0-2 قطرات متحولة في عينة البلازما)، وإدراج تكرار التقنية هو المفتاح لحل حالة الطفرة. في حين أن بئر PCR واحد قد تسفر عن 0 قطرات متحولة, اثنين آخرين قد تسفر 1-2 لعينة بلازما واحدة تحليلها في ثلاثة أضعاف; وبالتالي، فإن إدراج تكرار يسمح لمزيد من الدقة عند تحديد حالة الطفرة. ثم يتم حساب MAF كمتوسط قيم النسخ المتماثل.
يزيد التضخيم المتعدد (النوع البري المتضخم المسبق والأليلات المتحولة من اثنين من الطفرات ذات الاهتمام) فائدة عينة واحدة، حيث يمكن استخدام نفس مادة البداية لاختبار اثنين من الطفرات. الأهم من ذلك، يمكن تحليل منتج preamplification متعددة في singleplex أثناء dPCR لمزيد من البساطة، كما هو موضح هنا. ومع ذلك، قد يتم مضاعفة كل من PCR preamplification و dPCR. عند تعدد الإرسال، يجب تحسين الظروف لكل من مجموعات من التمهيديات وتحقيقات: يجب أن تكون درجات حرارة الصلب التمهيدي مماثلة لتشغيل معا في تضخيم PCR، وينبغي أن تصمم تحقيقات لتوليد مجموعات متميزة (على أساس إشارة الفلورسنت و كثافة). عند التحقق من صحة مجموعة جديدة من التمهيديات وتحقيقات، تشغيل تدرج درجة حرارة الصلب لتحديد درجة الحرارة الصلب الأمثل على أساس النطاق الذي اقترحته الشركة المصنعة. قبل اختبار تحقيقات على عينات cfDNA المريض، والتحقق من صحة لهم باستخدام بنيات الحمض النووي الاصطناعية و / أو أنسجة الورم gDNA من مدخلات مختلفة (أي، ما يصل إلى 10 نانوغرام).
للكشف عن الأليلات متحولة مع مزيد من الخصوصية وتقليل عدم التطابق في تهجين التحقيق إلى الحمض النووي المستهدف، وتستخدم تحقيقات حمض نووي مؤمن (LNA). LNA هو التناظرية حمض نووي مع جسر الميثيلين ربط 2 ‘-الأكسجين و 4 ‘-الكربون من حلقة الريبوز9. جسر الميثيلين يقفل حمض النوى في مطابقة صلبة للبيجيك الذي يقيد المرونة، ويزيد من الاستقرار الحراري المزدوج، ويحسن خصوصية التهجين التحقيق لاستهداف الحمض النووي10،18، 19.إذا كان هناك عدم تطابق قاعدة واحدة بين التحقيق LNA والحمض النووي قالب، وتشكيل دوبلكس بين التحقيق والهدف سوف يزعزع الاستقرار. على هذا النحو، تحقيقات LNA تحسين خصوصية الربط التحقيق وتسفر عن نسبة أعلى إشارة إلى الضوضاء11. وقد أثبت تحليل البلازما وCSF من مرضى الأطفال غير المصابين بالجهاز العصبي المركزي خصوصية اختبارنا مع تحقيقات LNA التي تستهدف H3F3A p.K27M، لتحديد أن التردد الالي يساوي أو أقل من 0.001٪ يعتبر إيجابي كاذبة 8.لاعتبارات إضافية لتحسين تصميم تحقيقات والتمهيديات، بما في ذلك محتوى GC، حجم amplicon، الأصباغ مراسل التحقيق، وquenchers، والرجوع إلى المبادئ التوجيهية للشركة المصنعة dPCR14،17. على الرغم من أن أسلوبنا هو الأمثل للاستخدام مع نظام RainDance، قد يتم تكييف البروتوكول للاستخدام مع منصات dPCR الأخرى.
الطريقة المعروضة هنا تستمد قوتها من الحساسية العالية وإثراء الهدف الذي حققته dPCR، والتي لا تزال منصة الاختيار للكشف عن طفرات الورم النادرة في cfDNA. على الرغم من قوة، dPCR محدودة في عدد الطفرات التي يمكن اختبارها في اختبار واحد. بديل لdPCR هو تسلسل الجيل القادم (NGS)، والتي قد تكشف عن طفرات متعددة عبر العديد من الجينات، مما يزيد من فائدة عينة واحدة. NGS يمكن الكشف عن الطفرات في CSF والبلازما من المرضى الذين يعانون من الأورام الدبقية جذع الدماغ20، ومع ذلك ، هو حاليا أقل حساسية من dPCR في الكشف عن طفرات الورم في cfDNA ، مع حدود الكشف من 0.1-10٪ MAF مقارنة مع 0.001٪ في النهج المستندة إلى PCR21 . كما يحقق dPCR وقت تحول أسرع من NGS، مما يتيح الكشف السريع عن الطفرات ذات الاهتمام. نهج PCR ينطبق على أنواع السرطان ويمكن توسيعه للكشف عن الطفرات الساخنة وميثيلات cfDNA22.
الخزعة السائلة هي في الواقع في مهدها، وسوف تتطلب المزيد من التطوير لتكييفها مع أمراض محددة. وسيكون رصد الورم في سياق تطور الورم هو التحدي التالي، حيث يلزم وجود منصة قادرة على الكشف عن الطفرات الناشئة ذات الحساسية العالية. بالإضافة إلى ذلك، فإن منصات قادرة على الكشف عن مجموعة متنوعة من الجزيئات الحيوية (الببتيدات، السيتوكينات، RNA) ستكون مفيدة للغاية في تقييم استجابة الورم للعلاج، فضلا عن النهوض بالتدخلات السريرية الشخصية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود أصحاب البلاغ أن يعترفوا بسخاء جميع المرضى وأسرهم. وقد تم دعم هذا العمل بتمويل من مؤسسة الجوز المحطمة (ميدلبورغ، فيرجينيا)، ومؤسسة V (أتلانتا، جورجيا)، ومركز غابرييلا ميلر للأطفال أول موارد البيانات، ومعهد العلوم السريرية والترجمة في الوطنية للأطفال ( 5UL1TR001876-03)، مؤسسة موسيلا (هيوليت، نيويورك)، مؤسسة ماثيو لارسون (فرانكلين ليك، نيو جيرسي)، مؤسسة ليلابين لبحوث سرطان الدماغ لدى الأطفال (سيلفر سبرينغ، MD)، مؤسسة أورام الدماغ في مرحلة الطفولة (جيرمانتاون، MD)، ودماغ الأطفال اتحاد أنسجة الأورام (فيلادلفيا، بنسلفانيا)، ومؤسسة التجمع لبحوث سرطان الطفولة (أتلانتا، جورجيا).
Materials
| 10mM Tris-HCl, 0.1mM EDTA DNA Suspension Buffer (pH 8.0) | Teknova | T0227 | |
| BD Vacutainer K2-EDTA 7.2mg Blood Collection Tubes (10mL) | Becton Dickinson Diagnostics | 367525 | For plasma collection |
| BD Vacutainer Plastic Serum tube with Red BD Hemogard Closure (10mL) | Becton Dickinson Diagnostics | 367895 | For serum collection |
| Bleach | General Lab Supplier | ||
| Buffer ATL | Qiagen | 19076 | |
| Cell-Free DNA Blood Collection Tubes | Streck | 218961 | cfDNA blood collection tubes (optional) |
| CentriVap Concentrator | Labconco | 7810010 | |
| Forward Primer | Integrated DNA Technologies, Inc. | Custom design | |
| MiniAmp Thermal Cycler | Thermofisher Scientific | A37834 | |
| Molecular Biology Grade Absolute Ethanol (200 proof) | General Lab Supplier | ||
| Mutant Probe | Integrated DNA Technologies, Inc. | Custom design | |
| PAXgene Blood ccfDNA tubes | PreAnalytiX | 768115 | cfDNA blood collection tubes (optional) |
| PCR 8 well strip tube caps | VWR | 10011-786 | |
| PCR 8 well strip tubes | Axygen | PCR-0208-C | |
| Pipette (p20, p200, p1000) | General Lab Supplier | ||
| Pipette filter tips (p20, p200, p1000) | General Lab Supplier | ||
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs Inc | M0494S | |
| QIAamp Circulating Nucleic Acid HandBook | Qiagen | cfDNA extraction kit handbook (2013 edition) | |
| QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit | Qiagen | 55114 | cfDNA extraction kit (Protocol Step 4) |
| QIAamp MinElute Virus Spin Kit | Qiagen | 57704 | Optional kit for DNA extraction from small (< or =200µL) sample volumes |
| Qiavac 24 Plus | Qiagen | 19413 | For use with QIAamp Circulating Nucleic Acids kit |
| Raindance Consumable Kit | Bio-Rad | 20-04411 | Contains droplet-generating instrument chips, quantification instrument chips, PCR strip caps including high-speed caps, and droplet stabilizing oil |
| Raindance Sense Instrument | Bio-Rad | Quantification instrument (used in Protocol Step 9) | |
| Raindance Source Instrument | Bio-Rad | Droplet-generating instrument (used in Protocol Step 9) | |
| RainDrop Analyst II Software | RainDance Technologies | Analyst software used for Data Analysis (Protocol Step 10) | |
| Refrigerated Vapor Trap | Savant | RVT5105-115 | |
| Reverse Primer | Integrated DNA Technologies, Inc. | Custom design | |
| Smartblock 2mL | Eppendorf | 05 412 506 | |
| TaqMan Genotyping Master Mix | Thermofisher Scientific | 4371353 | |
| Thermomixer C | Eppendorf | 14 285 562PM | |
| WT Probe | Integrated DNA Technologies, Inc. | Custom design |
References
- Mackay, A., et al. Integrated molecular meta-analysis of 1,000 pediatric high-grade and diffuse intrinsic pontine glioma. Cancer Cell. 32, 520-537 (2017).
- Hoffman, L. M., et al. Spatial genomic heterogeneity in diffuse intrinsic pontine and midline high-grade glioma: implications for diagnostic biopsy and targeted therapeutics. Acta Neuropathologica Communications. 4 (1), (2016).
- Puget, S., et al. Biopsy in a series of 130 pediatric diffuse intrinsic pontine gliomas. Child’s Nervous System. 31 (10), 1773-1780 (2015).
- Leary, S., et al. Year one in the molecular era of pediatric brain tumor diagnosis: application of universal clinical targeted sequencing in an unselected cohort of children. Neuro-Oncology. 19 (4), iv21 (2017).
- Mueller, S., et al. DIPG-40. PNOC003: Precision medicine trial for children with diffuse intrinsic pontine glioma. Neuro-Oncology. 19 (4), iv14 (2017).
- Kilburn, L., et al. DIPG-76. PNOC-003: Precision medicine trial for children with diffuse intrinsic pontine glioma: preliminary experience with multi-agent personalized therapy recommendations. Neuro-Oncology. 20 (2), i64 (2018).
- Aquino, D., Gioppo, A., Finocchiaro, G., Bruzzone, M. G., Cuccarini, V. MRI in glioma immunotherapy: evidence, pitfalls, and perspectives. Journal of Immunology Research. 2017, 5813951 (2017).
- Panditharatna, E., et al. Clinically relevant and minimally invasive tumor surveillance of pediatric diffuse midline gliomas using patient-derived liquid biopsy. Clinical Cancer Research. , (2018).
- Singh, S. K., Koshkin, A. A., Wengel, J., Nielsen, P. LNA (locked nucleic acids): synthesis and high-affinity nucleic acid recognition. Chemical Communications. 29 (4), 455-456 (1998).
- Owczarzy, R., You, Y., Groth, C. L., Tataurov, A. V. Stability and mismatch discrimination of locked nucleic acid-DNA duplexes. Biochemistry. 50 (43), 9352-9367 (2011).
- Priya, N. G., Pandey, N., Rajagopal, R. LNA probes substantially improve the detection of bacterial endosymbionts in whole mount of insects by fluorescent in-situ hybridization. BMC Microbiology. 12, 81 (2012).
- Qiagen. . QIAamp Circulating Nucleic Acid Handbook. , 1090257 (2013).
- Jackson, J. B., et al. Multiplex preamplification of serum DNA to facilitate reliable detection of extremely rare cancer mutations in circulating DNA by digital PCR. The Journal of Molecular Diagnostics. 18 (2), 235-243 (2016).
- Rain Dance Technologies. . RainDrop Assay Guidelines. , (2016).
- Rain Dance Technologies. . RainDrop Analyst II Operator’s Manual. , (2015).
- Majumdar, N., Banerjee, S., Pallas, M., Wessel, T., Hegerich, P. Poisson Plus quantification for digital PCR system. Scientific Reports. 7, 9617 (2017).
- Biorad. . Droplet Digital PCR Applications Guide. , (2018).
- Mouritzen, P., Nielsen, A. T., Pfundheller, H. M., Choleva, Y., Kongsbak, L., Moller, S. Single nucleotide polymorphism genotyping using locked nucleic acid (LNA). Expert Review of Molecular Diagnostics. 3 (1), 27-38 (2013).
- Ugozzoli, L. A., Latorra, D., Puckett, R., Arar, K., Hamby, K. Real-time genotyping with oligonucleotide probes containing locked nucleic acids. Analytical Biochemistry. 324 (1), 143-152 (2004).
- Pan, C., et al. Molecular profiling of tumors of the brainstem by sequencing of CSF-derived circulating tumor DNA. Acta Neuropathologica. , (2018).
- Stewart, C. M., Tsui, D. W. Y. Circulating cell-free DNA for non-invasive cancer management. Cancer Genetics. , (2018).
- Barault, L., et al. Discovery of methylated circulating DNA biomarkers for comprehensive non-invasive monitoring of treatment response in metastatic colorectal cancer. Gut. 67 (11), 1995-2005 (2018).
