Uso de la Invertebrada Galleria mellonella como Modelo de Infección para Estudiar el Complejo Mycobacterium tuberculosis

La tuberculosis (TB) es una amenaza importante para la salud pública mundial, con 9 millones de nuevos casos al año y 1,5 millones de muertes¹. Además, se estima que una cuarta parte de la población mundial está infectada con el agente causante de la enfermedad, Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Entre la población infectada, entre el 5 y el 10 % desarrollará la enfermedad de tuberculosis activa a lo largo de su vida. Además, la aparición y propagación de Mtb resistente a múltiples fármacos (MDR) y ampliamente farmacológicos (XDR)representa una grave amenaza para el control de enfermedades, y 123 países informan al menos de un caso XDR 1. El tratamiento de la tuberculosis requiere un cóctel de al menos cuatro medicamentos antimicobacterianos, de los cuales se prescriben isoniazida y rifampicina por una duración mínima de seis meses; a menudo se asocia con efectos secundarios complejos y toxicidades. La protección contra la única vacuna autorizada contra la tuberculosis, Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG), es la variable 2. Una comprensión incompleta de la patogénesis de la tuberculosis dificulta significativamente el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas y de vacunación.

Durante décadas, los modelos de infección animal han sido vitales para que la investigación de la tuberculosis comprenda la patogénesis básica y la respuesta del huésped a la infección, y para evaluar nuevos agentes antimicobacterianos, inmunoterapéuticos y nuevos candidatos a vacunas^{3, 4}. Sin embargo, la investigación utilizando modelos de infección animal de tuberculosis es notoriamente difícil ya que la patogénesis y la progresión de la infección por tuberculosis son complejas, y no hay un solo modelo animal que imite todo el espectro y las características importantes de la enfermedad^{5 ,6}. Además, los experimentos con animales son costosos, consumen mucho tiempo para llevar a cabo y requieren una justificación ética completa. No obstante, se han descrito modelos de infección animal de tuberculosis en primates no humanos (por ejemplo, macacos), conejillos de indias, conejos, bovinos, cerdos, ratones y peces cebra, y cada uno tiene sus limitaciones^3,4. El modelo murino es el modelo más utilizado debido al costo, disponibilidad de líneas endogámicas, reproducibilidad de la infección y abundancia de reactivos inmunológicos. Sin embargo, por lo general no forman granulomas asociados con áreas de hipoxia que son características de la infección por tuberculosis latente (LTBI)⁶. Los cerdos de Guinea son altamente susceptibles a la infección por Mtb, con patología y formación temprana de granuloma similares a los de los seres humanos, y se utilizan ampliamente en las pruebas de vacunas; sin embargo, la falta de reactivos inmunológicos dificulta su uso como infección modelo⁷. Los peces cebra son adecuados para el cribado a gran escala en estudios preclínicos en etapas tempranas debido a su pequeño tamaño, reproducción rápida y herramientas genéticas avanzadas, pero son anatómica y fisiológicamente diferentes a los seres humanos y sólo son susceptibles a Infección por Mycobacterium marinum ³. Los modelos animales que se asemejan más a la infección humana por Mtb son primates no humanos (por ejemplo, el macaco), pero son caros y tienen consideraciones éticas y prácticas significativas que limitan considerablemente su uso⁸.

La larva de insectos de la polilla de cera mayor o polilla de panal,Galleria mellonella, se han vuelto cada vez más populares como modelo de infección para una variedad de patógenos bacterianos y fúngicos^9,y como una pantalla para nuevos candidatos a fármacos antimicrobianos ¹⁰. G. mellonella es un modelo invertebrado exitoso debido a su sofisticado sistema inmunológico innato (compuesto por defensas celulares y humorales) que comparte un alto grado de similitud estructural y funcional con el de los vertebrados¹¹ . Esto incluye mecanismos inmunes como la fagocitosis de patógenos por hemocitos (funcionalmente similar a los macrófagos y neutrófilos de mamíferos)^12,13, la producción y circulación de péptidos antimicrobianos (AMP) y proteínas similares a complementos dentro de la hemolinfa (análogos a la sangre de mamíferos) de G. mellonella¹¹. Otras ventajas^9,14,15 de G. mellonella larvas como modelo incluyen 1) su gran tamaño (20-30 mm) que permite una fácil manipulación e infección, así como la recolección de tejido y hemolinfa para análisis, 2) fácil mantenimiento a 37 oC, compatible para el estudio de patógenos humanos, 3) infección precisa por inyección sin necesidad de anestesia, 4) la eficacia de los agentes antimicrobianos puede evaluarse utilizando menos fármacos para evaluación, 5) falta de las limitaciones éticas en comparación con el uso de mamíferos, 6) tamaños de grupo grande se pueden utilizar en comparación con los modelos animales que permiten una mayor reproducibilidad, y 7) tiempos más cortos para experimentos de infección se requieren.

En un estudio reciente, demostramos que G. mellonella puede ser utilizado como un modelo de infección novedoso para estudiar la patogénesis de la infección por Bioluminiscente M. bovis BCG lux, una versión modificada genéticamente de la cepa vacunal y miembro del complejo Mtb (MTBC)¹⁶. Mientras que G. mellonella se ha utilizado previamente como un modelo de infección para micobacterias no tuberculosas (NTM), principalmente M. marinum y Mycobacterium absceso^17,18, los estudios con MTBC se limitan a ¹⁶. Las cepas micobacterianas bioluminiscentes no patógenas, que se pueden utilizar a nivel de contención (CL) 2 como sustituto de Mtb, ofrecen las ventajas de seguridad y practicidad sobre las micobacterias patógenas. Después de la infección por BCG lux, las larvas comienzan a desarrollar estructuras tempranas similares al granuloma, lo que podría proporcionar información valiosa sobre el papel de la inmunidad innata en el establecimiento de la infección por tuberculosis^16. Además, este sencillo modelo de infección por invertebrados tiene el potencial de proporcionar una evaluación rápida, de bajo costo y confiable de la patogénesis de la tuberculosis que incorpora desafío controlado y múltiples réplicas de reproducibilidad. Además, el modelo tiene el potencial de ser utilizado para examinar nuevos candidatos a fármacos antituberculosos y vacunas en desarrollo temprano, reduciendo el número total de animales en experimentación. La capacidad de medir los cambios en la estructura del huésped y del patógeno, el transcriptoma y el proteoma para determinar las dianas farmacológicas y evaluar los mecanismos de acción de nuevos fármacos y vacunas terapéuticas también son ventajosas.

Aquí describimos los protocolos experimentales para la preparación de un bioluminiscente M. bovis BCG lux inoculum y larvas de G. mellonella para la infección micobacteriana, así como la determinación de larvas y micobacterias supervivencia en respuesta a la infección.