Использование беспозвоночных Galleria mellonella в качестве модели инфекции для изучения комплекса туберкулеза микобактерий

Туберкулез (ТБ) представляет собой серьезную угрозу для глобального общественного здравоохранения: 9 миллионов новых случаев заболевания в год и 1,5 миллиона случаев смерти^1. Кроме того, по оценкам, четверть населения мира инфицирована возбудительным агентом болезни, Микобактерия туберкулеза (Mtb). Среди инфицированного населения в течение жизни у 5–10% будет развиваться активное заболевание туберкулезом. Кроме того, появление и распространение множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) и широко лекарственной (ШлУ) резистентной МТБ представляет собой серьезную угрозу для борьбы с болезнями, при этом 123 страны сообщают по крайней мере об одном случае ШЛУ^1. Для лечения туберкулеза требуется коктейль из не менее четырех антимикобактериальных препаратов, из которых изониазид и рифампицин назначаются на минимальный срок в шесть месяцев; лечение часто связано со сложными побочными эффектами и токсичности. Защита от единственной лицензированной вакцины против туберкулеза, Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Gu’rin (BCG), является переменной². Неполное понимание патогенеза туберкулеза существенно затрудняет разработку новых терапевтических стратегий и стратегий вакцинации.

На протяжении десятилетий модели инфекции животных имеют жизненно важное значение для исследования туберкулеза, чтобы понять основной патогенез и принимающей ответ на инфекцию, а также оценить новые анти-микобактериальные агенты, иммуно-терапевтические и новые кандидаты вакцины^{3, 4.}Однако исследования с использованием моделей инфекции животных тб, как известно, трудно, как патогенез и прогрессирование туберкулезной инфекции являются сложными, и нет единой модели животных, которая имитирует весь спектр и важные особенности болезни^{5 ,6}. Кроме того, эксперименты на животных являются дорогостоящими, отнимают много времени и требуют полного этического обоснования. Тем не менее, модели инфекции животных туберкулеза были описаны у нечеловеческих приматов (например, макаки), морских свинок, кроликов, крупного рогатого скота, свиней, мышей и зебры, причем каждый из них имеет свои ограничения^3,4. Модель мурина является наиболее часто используемой моделью из-за стоимости, наличия инбредных линий, воспроизводимости инфекции и обилия иммунологических реагентов. Однако, они обычно не образуют гранулемы, связанные с областями гипоксии, которые характерны для скрытой туберкулезной инфекции (LTBI)⁶. Гвинейские свиньи очень восприимчивы к инфекции Mtb, с патологией и ранним образованием гранулемы, аналогичным и тем, которые существуют у людей, и широко используются в тестировании вакцин; однако отсутствие иммунологических реагентов затрудняет ихиспользование в качестве инфекционной модели 7. Зебрафиш подходит для крупномасштабного скрининга на ранних стадиях доклинических исследований из-за их небольшого размера, быстрого размножения и передовых генетических инструментов, но анатомически и физиологически отличаются от человека и только восприимчивы к Микобактерия маринум инфекции³. Модели животных, наиболее похожие на человеческую инфекцию Mtb являются нечеловеческими приматами (например, макаки), но они дороги ею и имеют значительные этические и практические соображения, которые значительно ограничивают их использование⁸.

Личинки насекомых больше йош ной или сот моли, Galleria mellonella, становятся все более популярными в качестве модели инфекции для различных бактериальных и грибковых патогенов⁹, и в качестве экрана для новых кандидатов противомикробных препаратов наркотиков ¹⁰. G. mellonella является успешной моделью беспозвоночных из-за своей сложной врожденной иммунной системы (состоящей из клеточной и гуморальной защиты), которая разделяет высокую степень структурного и функционального сходства с позвоночными¹¹ . Это включает в себя иммунные механизмы, такие как фагоцитоз патогенных микроорганизмов гемоцитами (функционально похожие на млекопитающих макрофага и нейтрофилов)^12,13, производство и циркуляция антимикробных пептидов (АМП) и дополняют белки в гемолимфе (аналог крови млекопитающих) G. mellonella¹¹. Другие преимущества^9,14,15 личинок G. mellonella в качестве модели включают 1) их большой размер (20-30 мм), который позволяет легко манипуляции и инфекции, а также сбор тканей и гемолимфа для анализа, 2) легкое обслуживание при 37 градусах Цельсия, совместимое для изучения патогенных микроорганизмов человека, 3) точная инфекция путем инъекций без необходимости анестезии, 4) эффективность противомикробных препаратов может быть оценена с использованием меньше госпрепарата для оценки, 5) отсутствие этические ограничения по сравнению с использованием млекопитающих, 6) большие размеры группы могут быть использованы по сравнению с животными моделями, позволяющими большую воспроизводимость, и 7) более короткое время для экспериментов инфекции не требуется.

В недавнем исследовании, мы показали, что G. mellonella может быть использован в качестве новой модели инфекции для изучения патогенеза инфекции биолюминесцентных M. bovis BCG люкс, генетически модифицированная версия штамма вакцины и член комплекса Mtb (MTBC)¹⁶. В то время как G. mellonella ранее использовалась в качестве модели инфекции для нетуберкулезных микобактерий (NTM), в основном M. marinum и Mycobacterium abscessus^17,18, исследования с использованием MTBC ограничены что Ли и др.¹⁶. Биолюминесцентные непатогенные микобактериальные штаммы, которые могут быть использованы на уровне сдерживания (CL) 2 в качестве суррогата Для Mtb, предлагают преимущества безопасности и практичности по сравнению с патогенными микобактериями. После заражения BCG lux, личинки начинают развивать ранние гранулемы-подобные структуры, которые могли бы дать ценную информацию о роли врожденного иммунитета в создании туберкулезной инфекции^16. Кроме того, эта простая модель инфекции беспозвоночных может обеспечить быструю, недорогостоящую и надежную оценку патогенеза туберкулеза, включающую контролируемые вызовы и множественные репликации для воспроизводимости. Кроме того, эта модель может быть использована для скрининга новых противотуберкулезных препаратов и вакцин кандидатов в раннем развитии, что сокращает общее число животных в экспериментах. Способность измерять изменения в структуре хозяина и патогена, транскриптоме и протеоме для определения целей лекарств и оценки механизмов действия новых препаратов и терапевтических вакцин также выгодна.

Здесь мы описываем экспериментальные протоколы для подготовки биолюминесцентных M. bovis BCG lux inoculum и G. mellonella личинок для микобактериальной инфекции, а также определение как личинки, так и микобактерии выживаемости в ответ на инфекцию.