Uso do invertebrado Galleria mellonella como modelo de infecção para estudo do complexo Mycobacterium tuberculosis

A tuberculose (TB) é uma grande ameaça à saúde pública global com 9 milhões casos novos por ano e 1,5 milhões mortes¹. Além disso, estima-se que um quarto da população mundial está infectado com o agente causador da doença, Mycobacterium tuberculosis (MTB). Entre a população infectada, 5 − 10% desenvolverão doença ativa da TB ao longo de sua vida. Além disso, a emergência e a propagação do MTB resistente do multi-droga (MDR) e do extensivamente-droga (XDR) representa uma ameaça séria ao controle da doença, com os 123 países que reportam pelo menos um caso XDR¹. O tratamento da TB requer um coquetel de pelo menos quatro medicamentos antimicobacterianos, dos quais isoniazida e rifampicina são prescritos por uma duração mínima de seis meses; o tratamento é associado frequentemente com os efeitos secundários e as toxicidades complexos. A proteção da única vacina licenciada contra a TB, Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG), é variável². Uma compreensão incompleta da patogênese da TB dificulta significativamente o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas e de vacinação.

Durante décadas, os modelos de infecção animal têm sido vitais para a pesquisa de TB para compreender a patogênese básica e a resposta do hospedeiro à infecção, e para avaliar novos agentes antimicobacterianos, imuno-terapêutica e novas candidatas à vacina^{3, 4}. no entanto, a pesquisa utilizando modelos de infecção animal da TB é notoriamente difícil, pois a patogênese e a progressão da infecção por TB são complexas, e não há um modelo animal único que imita o espectro completo e as características importantes da doença^{5 ,6}. Além disso, experimentos com animais são caros, demorados a empreender e necessitam de plena justificação ética. No entanto, modelos de infecção animal de TB têm sido descritos em primatas não humanos (por exemplo, macaques), cobaias, coelhos, bovinos, suínos, camundongos e zebrafish, cada um com suas limitações^3,4. O modelo murino é o modelo mais comumente utilizado devido ao custo, disponibilidade de linhagens, reprodutibilidade da infecção e abundância de reagentes imunológicos. Entretanto, não formam tipicamente granulomas associados a áreas de hipóxia que são características de infecção latente por tuberculose (LTBI)⁶. As cobaias são altamente suscetíveis à infecção de MTB , com patologia e formação adiantada do granuloma similar àquelas nos seres humanos, e são amplamente utilizadas no teste da vacina; ainda a falta de reagentes imunológicos dificulta seu uso como modelo de infecção⁷. Os zebrafish são apropriados para a seleção em grande escala em estudos pré-clínicos do cedo-estágio devido a seu tamanho pequeno, a reprodução rápida e as ferramentas genéticas avançadas, mas são anatomicamente e fisiologicamente diferentes aos seres humanos e são somente suscetíveis a Infecção do marinum do Mycobacterium ³. Os modelos animais mais parecido com a infecção humana MTB são primatas não-humanos (por exemplo, o macaco), mas eles são caros e têm considerações éticas e práticas significativas que limita consideravelmente o seu uso⁸.

A larva do inseto da traça maior da cera ou da traça do favo de mel, Galleria mellonella, tornou-se cada vez mais popular como um modelo da infecção para uma variedade de micróbios patogénicos bacterianos e fungosos⁹, e como uma tela para candidatos antimicrobial novos da droga ¹⁰. G. mellonella é um modelo de invertebrados de sucesso devido ao seu sofisticado sistema imunológico inato (composto por defesas celulares e humorais) que compartilha um alto grau de semelhança estrutural e funcional com o dos vertebrados¹¹ . Isso inclui mecanismos imunes como a fagocitose de patógenos por hemócitos (funcionalmente semelhantes aos macrófagos de mamíferos e neutrófilos)^12,13, a produção e circulação de peptídeos antimicrobianos (AMPS) e proteínas complemento-like dentro da hemolinfa (análoga ao sangue de mamíferos) de G. mellonella¹¹. Outras vantagens^9,14,15 de larvas de G. mellonella como um modelo incluem 1) seu tamanho grande (20 − 30 milímetros) que permite a manipulação e a infecção fáceis, assim como a coleção do tecido e hemolinfa para análises, 2) fácil manutenção a 37 ° c, compatível para estudo de patógenos humanos, 3) infecção precisa por injeção sem necessidade de anestesia, 4) a eficácia dos agentes antimicrobianos pode ser avaliada utilizando menos medicamentos para avaliação, 5) falta de restrições éticas em relação ao uso de mamíferos, 6) grandes tamanhos de grupo podem ser usados em comparação com modelos animais permitindo maior reprodutibilidade, e 7) tempos mais curtos para experimentos de infecção são necessários.

Em um estudo recente, Nós demonstramos que G. mellonella pode ser usada como um modelo novo da infecção para estudar a patogénese da infecção pelo Luxbioluminescente de M. bovis BCG, uma versão genetically modificada da tensão da vacina e do membro do complexo MTB (mtbc)¹⁶. Enquanto G. mellonella tem sido usada anteriormente como um modelo de infecção para micobactérias não tuberculosas (NTM), principalmente M. marinum e Mycobacterium abscessus^17,18, estudos usando mtbc são limitados a de Li et al.¹⁶. Cepas micobacterianas não patogênicas bioluminescentes, que podem ser usadas no nível de contenção (CL) 2 como um substituto para MTB, oferecem as vantagens de segurança e praticidade sobre micobactérias patogênicas. Após a infecção pelo BCG Lux, as larvas começam a desenvolver estruturas semelhantes ao Granuloma precoce, o que poderia fornecer uma visão valiosa sobre o papel da imunidade inata no estabelecimento da infecção por TB¹⁶. Além disso, este modelo simples de infecção por invertebrados tem o potencial de fornecer uma avaliação rápida, de baixo custo e confiável da patogênese da TB incorporando desafio controlado e múltiplas repetições para reprodutibilidade. Além disso, o modelo tem o potencial para ser usado para a tela de novos candidatos a drogas e vacinas anti-TB no desenvolvimento precoce, reduzindo o número total de animais em experimentação. A capacidade de medir mudanças na estrutura hospedeira e patógeno, transcriptoma e proteoma para determinar alvos de drogas e avaliar mecanismos de ação de novas drogas e vacinas terapêuticas, também são vantajosas.

Aqui nós descrevemos os protocolos experimentais para a preparação de um inocular bioluminescente de M. bovis BCG Lux e de larvas de G. mellonella para a infecção Mycobacterial, assim como a determinação de larval e de Mycobacterial sobrevivência em resposta à infecção.