Uso della mellonella Invertebrate Galleria come modello di infezione per studiare il complesso di tubercolosi Mycobacterium

La tubercolosi (TB) è una grave minaccia per la salute pubblica globale, con 9 milioni di nuovi casi all’anno e 1,5 milioni di decessi¹. Inoltre, si stima che un quarto della popolazione mondiale sia infettato dall’agente causale della malattia, Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Tra la popolazione infetta, il 5-10% svilupperà una malattia da TB attiva nel corso della loro vita. Inoltre, l’emergere e la diffusione di Mtb multifarmacoresistenti (MDR) e ampiamente resistenti ai farmaci (XDR) rappresenta una grave minaccia per il controllo delle malattie, con 123 paesi che riportano almeno un caso XDR¹. Il trattamento della tBC richiede un cocktail di almeno quattro farmaci anti-micobatterici, di cui isoniazid e rifampicina sono prescritti per una durata minima di sei mesi; trattamento è spesso associato a effetti collaterali complessi e tossicità. La protezione dall’unico vaccino autorizzato contro la TUBErcolosi, Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG), è variabile². Una comprensione incompleta della patogenesi della TB ostacola significativamente lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche e di vaccinazione.

Per decenni i modelli di infezione animale sono stati fondamentali per la ricerca sulla TB per comprendere la patogenesi di base e la risposta dell’ospite all’infezione e per valutare nuovi agenti anti-micobatterici, immuno-terapie e nuovi candidati al vaccino^{3, 4.}Tuttavia, la ricerca che utilizza modelli di infezione animale di TB è notoriamente difficile in quanto la patogenesi e la progressione dell’infezione da TB sono complesse, e non esiste un singolo modello animale che imita l’intero spettro e le caratteristiche importanti della malattia^{5 ,6}. Inoltre, gli esperimenti sugli animali sono costosi, richiedono molto tempo per intraprendere e richiedono una giustificazione etica completa. Tuttavia, i modelli di infezione animale di TB sono stati descritti in primati non umani (ad esempio, macachi), porcellini d’India, conigli, bovini, maiali, topi e pesci zebra, ciascuno con i loro limiti^3,4. Il modello murino è il modello più comunemente usato a causa del costo, della disponibilità di linee inbred, della riproducibilità dell’infezione e dell’abbondanza di reagenti immunologici. Tuttavia, in genere non formano granulomi associati a aree di ipossia che sono caratteristiche dell’infezione da tubercolosi latente (LTBI)⁶. I maiali della Guinea sono altamente sensibili all’infezione da Mtb, con patologia e formazione precoce di granuloma simili a quelli nell’uomo, e sono ampiamente utilizzati nei test sui vaccini; tuttavia la mancanza di reagenti immunologici ne ostacola l’uso come modello di infezione⁷. I pesci zebra sono adatti per lo screening su larga scala in studi preclinici in fase iniziale a causa delle loro piccole dimensioni, della rapida riproduzione e degli strumenti genetici avanzati, ma sono anatomicamente e fisiologicamente diversi dall’uomo e sono suscettibili solo Mycobacterium marinum infezione³. I modelli animali più simili all’infezione umana da Mtb sono primati non umani (ad esempio, il macaco), ma sono costosi e hanno considerazioni etiche e pratiche significative che limitano notevolmente il loro uso⁸.

La larva di insetti della falena di cera maggiore o facaccia,Galleria mellonella, sono diventati sempre più popolari come modello di infezione per una varietà di patogeni batterici e fungini⁹, e come schermo per nuovi candidati farmaco antimicrobico ¹⁰. G. mellonella è un modello di invertebrato di successo grazie al suo sofisticato sistema immunitario innato (composto da difese cellulari e umorali) che condivide un alto grado di somiglianza strutturale e funzionale con quello dei vertebrati¹¹ . Ciò include meccanismi immunitari come la fagocitosi degli agenti patogeni da parte degli emociti (funzionalmente simili al macrofago mammifero e ai neutrofili)^12,13, la produzione e la circolazione di peptidi antimicrobici (AMP) e proteine complementari all’interno dell’emolina (analoga al sangue dei mammiferi) di G. mellonella¹¹. Altri vantaggi^9,14,15 di G. mellonella larve come modello includono 1) le loro grandi dimensioni (20-30 mm) che consente una facile manipolazione e infezione, così come la raccolta di tessuto e eterogenea per le analisi, 2) facile manutenzione a 37 gradi centigradi, compatibile per lo studio di agenti patogeni umani, 3) infezione precisa per iniezione senza la necessità di anestesia, 4) l’efficacia degli agenti antimicrobici può essere valutata utilizzando meno farmaco per la valutazione, 5) mancanza di mancanza di sono necessari vincoli etici rispetto all’uso di mammiferi, 6) di grandi dimensioni di gruppo rispetto ai modelli animali che consentono una maggiore riproducibilità e sono necessari 7) tempi più brevi per gli esperimenti di infezione.

In uno studio recente, abbiamo dimostrato che G. mellonella può essere utilizzato come un nuovo modello di infezione per studiare la patogenesi dell’infezione da bioluminescente M. bovis BCG lux, una versione geneticamente modificata del ceppo vaccino e membro del complesso Mtb (MTBC)¹⁶. Mentre G. mellonella è stato precedentemente utilizzato come modello di infezione per micobatteri non tubercolari (NTM), principalmente M. marinum e Mycobacterium abscessus^17,18, gli studi utilizzando MTBC sono limitati a quella di Li et al.¹⁶. I ceppi miobatterici bioluminescenti non patogeni, che possono essere utilizzati a livello di contenimento (CL) 2 come surrogato per Mtb, offrono i vantaggi di sicurezza e praticità rispetto ai micobatteri patogeni. Dopo l’infezione da BCG lux, le larve iniziano a sviluppare strutture antiche simili a granuloma, che potrebbero fornire preziose informazioni sul ruolo dell’immunità innata nella creazione di infezione da TB¹⁶. Inoltre, questo semplice modello di infezione da invertebrati ha il potenziale per fornire una valutazione rapida, a basso costo e affidabile della patogenesi della TB che incorpora sfide controllate e repliche multiple per la riproducibilità. Inoltre, il modello ha il potenziale per essere utilizzato per vagliare nuovi farmaci anti-TB e vaccini candidati nello sviluppo precoce, riducendo il numero complessivo di animali in sperimentazione. Anche la capacità di misurare i cambiamenti nella struttura dell’ospite e dell’agente patogeno, il trascrittoma e il proteoma per determinare gli obiettivi dei farmaci e valutare i meccanismi di azione di nuovi farmaci e vaccini terapeutici, sono vantaggiosi.

Qui descriviamo i protocolli sperimentali per la preparazione di una bioluminescente M. bovis BCG lux inoculum e G. mellonella larva per l’infezione micobatterica, così come la determinazione sia della larva che del micobatterico sopravvivenza in risposta all’infezione.