여기서 동맥 입력 기능(AIF)을 측정하는 쥐의 PET/CT 이미징 동안 연속 혈액 샘플링을 위한 프로토콜이 기재되어 있다. 카테터화, 시스템의 교정 및 설정 및 혈액 방사능의 데이터 분석이 입증됩니다. 생성된 데이터는 후속 생체 역학 모델링을 위한 입력 파라미터를 제공합니다.
양전자 방출 단층 촬영 /컴퓨터 단층 촬영 (PET / CT) 데이터의 정량적 분석 및 생체 역학 모델링의 경우, 동맥 입력 함수 (AIF)로 알려진 측두혈 시간 활성 농도의 결정은 특히 핵심 포인트입니다. 동물 질병 모델의 특성화 및 새로 개발 된 방사성 추적기의 도입. 혈액에 있는 방사선 추적자 가용성의 지식은 조직 활동의 PET/CT 파생된 데이터를 해석하는 것을 돕습니다. 이를 위해 PET/CT 이미징 동안 온라인 혈액 샘플링은 AIF를 측정하는 것이 좋습니다. 수동 혈액 샘플링 및 이미지 파생 접근법과는 달리, 연속 적인 온라인 혈액 샘플링에는 몇 가지 장점이 있습니다. 최소화 된 혈액 손실 외에도 혈액 활동 측정을위한 향상된 해상도와 우수한 정확도가 있습니다. 그러나, 온라인 혈액 샘플링의 주요 단점은 동물의 대퇴 혈관을 카테터화하는 데 비용이 많이 들고 시간이 많이 소요되는 준비입니다. 여기서는 작은 동물 PET/CT 이미징 중에 카테터 화 및 지속적인 혈액 샘플링을 위한 쉽고 완전한 워크플로우를 설명하고 이를 수동 혈액 샘플링 및 이미지 파생 접근법과 비교했습니다. 이 고도로 표준화된 워크플로우를 사용하여 플루오로데옥시글루코스([18 F]FDG) AIF의 측정이 입증되었습니다. 또한, 이 절차는 트레이서 운동 및 모델 특성에 대한 기본 지식을 생성하기 위해 다른 동물 모델과 함께 모든 방사선 추적기에 적용 될 수있다. 이를 통해 종양학, 신경 퇴행성 및 심근 질환의 전임상 연구에서 진단 및 치료 접근법모두에 대한 의약품의 행동을 보다 정밀하게 평가할 수 있습니다.
양전자 방출 단층 촬영 / 컴퓨터 단층 촬영 (PET / CT)은 추적이라고도 방사성 라벨 리간드의 주입 다음 신체의 대사 과정의 시각화를 가능하게하는 핵 이미징 기술입니다. 리간드는 대사 경로에 관여하거나 세포 표면 단백질을 표적으로 하는 분자인 반면, 방사성 라벨은 양전자 방출 방사성 핵종이다. 감마선은 양전자 붕괴에 의해 간접적으로 방출되고 체외 PET 검출기로 유기체에서 분포를 감지 할 수 있습니다. 이런 식으로, 다른 세포 분자는 표적으로 할 수 있습니다: 신경 전달 물질 수용체 및 수송기, translocator 단백질 18 kDa (TSPO)와 같은 glycolysis 또는 미토콘드리아 단백질 같이 신진 대사 프로세스는 활성화된 glia 세포를 검출하기 위하여.
전임상 연구에서 PET/CT는 생체 내에서 비침습적 방식으로 생화학 적 과정을 연구하는 매력적인 방법이므로 세로 연구를 허용합니다. PET/CT 데이터는 질병 메커니즘의 분석, 신약의 특성 및 약물 동태학 평가 및 번역 연구를 위한 현재 및 신규 방사성 추적기의 유효성 검사를 지원합니다.
PET/CT 분석 동안 3개의 트레이서 상태를 정의할 수 있다(2-조직 구획 모델의 예): 첫째, 트레이서는 적용 후 혈액 내에서 흐른다(상태 1; conc.[혈액]). 둘째, 모세관 침대를 통해 조직에 진입하고 세포외 공간 내에서 자유롭게 이동하거나 다양한 세포 또는 세포 외 구조에 비특이적으로 결합될 수 있다(상태 2; conc.[unspec]). 셋째, 트레이서가 표적 분자(상태 3, conc.[spec])에특이적으로 결합될 수 있다(대사 트래핑 유무에 관계없이). 구획 사이의 이러한 모든 동적 프로세스는 어느 정도 양방향이며 확산 프로세스는 속도 상수 (K1, k2, k3 및 k4)에 의해 설명됩니다. 혈액 내의 트레이서의 농도(즉, 상태 1)는 “입력”이라고 불리지만, 비특이적이고 구체적으로 결합된 트레이서(즉, 상태 2 및 상태 3)의 농도는 “출력”이라고 하며 PET 이미지로부터 직접 파생될 수 있다. 이러한 생리적 관계는 2-조직 구획 모델(도 1)에 표시될 수 있다.
그림 1 : 2개의 티슈 구획 모델. 세 가지 다른 추적 자 상태의 생리 적 조건과 그들 사이의 동적 프로세스가 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
이상적인 경우에, conc.[사양]은 표적 분자의 농도에 비례한다. 그러나 PET/CT 측정의 출력은 conc.[사양] 및 conc.[unspec]의합계입니다. 관심 영역의 conc.[spec]을 결정하기 위해, 동시에 표적 단백질/경로가 없는 기준 영역의[unspec]이 결정된다. 적절한 수학 방정식을 사용하여 이제 conc.[사양]을 계산할 수 있으며, 구획 모델(생체 운동 모델링 접근 방식)을 가장 일반적으로 사용합니다. 그러나, 많은 경우에, 표적 단백질이 없는 이러한 기준영역은 1,2를사용할 수 없다. 이러한 경우, conc.[혈액]은 conc.[사양]을결정하는 데 사용할 수 있습니다. [혈액]은 상이한 간 및 신장 클리어런스, 배설, 혈류, 상이한 뇌-혈액 장벽 침투 및 질병 관련 인자3으로인해 다양하기 때문에, 현재 금본위제는 conc를 측정하는 것이다. [ 혈액] 연속 혈액 샘플링에 의해 PET / CT 스캔에 병렬로. 이것은 동맥 입력 기능을 제공합니다 (AIF), 이는 conc로 정의됩니다.[혈액] 시간이 지남에 따라4. 참고로, 연속 혈액 샘플링을 수행하는 것은 특히 쥐 또는 마우스5와같은 작은 동물에서 기술적으로 매우 도전적인 것으로 간주됩니다.
여기에서, 우리는 대퇴 정맥과 동맥 사이 동맥 (a-v) 션트를 통해 쥐에게서 혈액을 지속적으로 샘플링하는 쉽고 실용적인 프로토콜을 제공합니다. 시판되는 검출기 펌프 시스템에 결합하여, 우리는 동적[18F]플루오로데옥시글루코스([[18F]F]FDG)-PET/CT 스캔 동안 실시간, 연속 AIF를 생성할 수 있으며, 이를 다른 접근법과 비교할 수 있다. PET/CT 이미징은 다중 모달성 PET/CT 스캐너를 사용하여 평균 체중 462 g±33 g(평균 ± 표준 편차)의 나이로 4개월의 나이에 수컷 스프라그 dawley 래트에서 수행되었다.
일련의 측정(용량 교정기, 온라인 혈액 샘플러, PET/CT 및 웰 카운터)에서 다양한 장치가 사용되기 때문에 모든 시스템의 정량적 정확도를 확인하고 이를 위해 교차 교정이라고 하는 품질 관리 절차가 필요합니다. 차이를 보상합니다. 온라인 혈액 샘플링의 맥락에서 교차 캘리브레이션은 교정된 PET 이미지에서 측정된 주어진 활성 농도에 대한 카운트 레이트가 동일한 농도에 대해 트윌라이트 시스템으로 측정된 농도로 변환될 수 있음을 의미한다. 따라서 PET/CT, 혈액 샘플링 시스템 및 웰 카운터 간의 교차 교정 절차가 수립되었습니다.
이 고도로 표준화된 방법론은 전임상 소규모 동물 연구에서 대사 및 세포 과정을 정량화하는 강력한 접근법을 제공하며 AIF의 신뢰성과 재현성을 향상시키는 우아한 방법입니다. AIF는 바이오 운동 모델링을 사용하여 전임상 PET/CT 데이터에서 조직에서 구체적으로 결합된 트레이서를 정량화하는 데 사용될 수 있습니다.
제시된 결과는 야생형 쥐에 비해 헌팅턴병의 형질전환 동물 모델에서 뉴런 활성에 대한 대규모 프로젝트에서 추출된다. 전부 30개의 형질전환 및 야생형 래트카테터화하고[18F]FDG-PET/CT와 병행하여 수동 및 온라인 혈액 샘플링을 수행하였다. 야생형 쥐의 3개의 AIFs는 프로토콜의 가능한 결과의 범위를 설명하기 위하여 여기에서 도시됩니다. 헌팅턴병의 동물 모델에서 뉴런 활동의 변화에 대한 전체 프로젝트의 결과는 다른 곳에서 발표될 예정이다.
여기에 설명된 방법은 큰 코호트에서 빠르고 정확한 연속 혈액 샘플링을 가능하게 하며 작은 동물의 동적 PET/CT 데이터의 역학 모델링을 위한 틈새 없는 AIF를 제공합니다. 외부 혈액 순환은 동물의 혈액에서 실제 시간 활동을 감지하기 위해 생성됩니다. 따라서 혈액의 손실을 피할 수 있습니다. 외과 적 절차는 Jespersen 등8을 기반으로하며 PET / CT 측정 중에 동맥 혈액 샘플링에 대한 요구를 충족시키기 위해 수정되었습니다. 션트 시스템은 웨버 외 9에의해 검증되었다 . 여기에서 사용되는 설정으로 약 1.1 mL의 외부 혈액 볼륨이 검출기 펌프 시스템을 통해 실행됩니다. 4개월 된 쥐는 총 혈액량이 약 30 mL입니다. 대퇴 정맥 및 동맥의 직경은 약 0.45-0.6 mm10이며 사용되는 카테터를 삽입하기 위해 약간 전분화될 필요가 있습니다.
AIF는 또한 산발적인 수동 혈액 수집을 통해 측정되거나 PET 이미지 자체의 초기 시점으로부터 재구성될 수 있다(이미지 유래). 두 접근법 모두 제시된 데이터와 함께 수행되었고 연속혈액 샘플링과 비교되었다.
수동 혈액 샘플링과 비교하여 온라인 혈액 샘플링으로 눈에 띄는 더 높은 시간 해상도 (여기 : 30 분당 1800 데이터 포인트)가 가능해집니다. 수동 혈액 무승부 (여기 : 30 분 당 5 데이터 포인트)는 이 견본이 동물의 순환으로 다시 펌핑되지 않기 때문에, 작은 동물에 존재하는 혈액 양으로 제한됩니다. 또한 최대 10-15초 간격은 기술적으로 구현 가능하며 운동 모델링을 위한 중요한 정보가 누락됩니다. 이는 또한 제시된 데이터에서 볼 수 있으며, 연속 및 수동 혈액 샘플링의 검출된 최대치의 차이는 명백하다(도3A, C,E). 온라인 혈액 샘플링을 통해 검출된 피크는 오름차순 대류11의 이미지 유래 입력 기능(도3B, D,F)보다높았다. 이미지 파생 입력 기능은 PET 스캐너의 공간 해상도로 제한되어 부분 볼륨 효과12를 발생시키고 재구성된 시간 프레임의 영향을 받습니다.
이 연속 혈액 샘플링 절차의 일반적인 장점은 트레이서가 카테터를 통해 적용 될 수 있다는 것입니다, 이는 측면 꼬리 정맥을 통해 주입보다 교란하는 경향이있다. 추적자가 튜브 시스템의 시작 부분에 남아 있는 것을 방지하기 위해 트레이서를 적당한 부피에 적용해야 합니다. T-피스의 죽은 부피에 활성이 남아 있지 않도록 하기 위해 나중에 헤파린화된 식염수 로 플러시됩니다. 더욱이, 주입 펌프의 사용은 트레이서 주입의 속도의 조정을 가능하게하고 수동 혈액 샘플링(13)을통해 최대 방사능 피크의 보다 조정 된 획득에 기여할 수 있기 때문에 권장된다.
프로토콜 처리 중에 발생할 수 있는 몇 가지 문제가 있으며 다음 문제 해결을 통해 처리할 수 있습니다. 카테터의 최적이 아닌 위치는 프로토콜의 불완전한 실행으로 이어질 수 있으므로 근위 봉합사로 정확하게 고정되고 카테터가 2-3cm 근위혈관으로 밀려나게 됩니다. 또한, 피브린 접착제를 사용할 수 있습니다. 또한 혈전형성은 카테터를 막을 수 있습니다. 이것은 카테터 또는 튜브 시스템의 헤파린 농도 및 후속 플러싱을 증가시킴으로써 처리 될 수있다. 카테터의 막힘에 의한 이러한 최적 이하의 결과는 결과에 도시되어, 최대 피크가 누락된다(도3E). 동물 보호 및 웰빙에 관한 또 다른 중요한 점은 체외 혈류의 길이입니다. 따라서 튜브 시스템의 길이를 최소한으로 줄이는 것이 좋습니다.
혈액 샘플링이 수행될 때, 결과 AIF의 3가지 수정을 고려해야 합니다. 첫째, 플라즈마 보정. 트레이서는 혈장과 혈액 세포, 주로 적혈구 사이의 균형을. 이러한 확산 공정의 속도에 따라 사용 가능한 추적자는 주로 플라즈마에 존재합니다. 일부 추적자에 대 한, 전혈에 플라즈마의 비율을 고려 될 필요가, 더 많은 친유성 것 들 등. 이러한 경우, 플라즈마 활성을 결정해야 한다. [18F]FDG가 사용되는 경우, 혈장 활성을 결정하기 위해 혈액을 원심분리할 필요가 없으며, 혈장과 적혈구 사이의 매우 빠른 평형및[18F]FDG의 가용성은 혈장 전체에서와 유사하다. 둘째, 대사 산물 보정. 많은 추적자는 전혈에서 대사되고 이 대사 산물의 일부는 아직도 방사성으로표지된14입니다. 이 분획은 AIF에서 존재하지만 조직 섭취에 사용할 수 없습니다. 몇몇 추적자를 위해 전혈 또는 혈장에서 결정될 필요가 있고 AIF는 정정될 필요가 있습니다. 셋째, 분산 보정. 분산은 (a) 트레이서 수송으로서 주변 샘플링 부위(지연 보정) 및 (b) 및 AIF 형상의 번짐에 상대적인 조직 내의 트레이서 도착 시간 사이의 체계적인 시간 차이를 포함하여 여러 가지 요인에 의해 발생합니다. 튜브 시스템 내에서 는 1 차 지연(PT 1) 역학에 의해 영향을받습니다. deconvolution에 근거한 몇몇 수정은 주로 Iida 등15에의하여 모형에 근거를 둔 제안되었습니다, 그러나 그들 대부분은 소음에 영향을 받기 쉽습니다. 16. Munk 등에서 소음에 대한 경향이 적고 따라서 소음을 덜 발생시키는보정 방법이 제안되었습니다. 교정 파라미터를 추정하는 데 필요한 측정은 사용되는 튜빙과 트레이서의 모든 조합에 대해 수행되어야 합니다. 분산 보정은 시간 지연 보정17전에 수행해야합니다. 그러나, 주로 빠른 조직 관류 과정은 분산에 의해 영향을 받고 또한,[18F]FDG의 모델링을 위해 분산 보정이절대적으로 필요하지 않다는 것을 18로 나타났다. 따라서 제시된 예에서 AIF의 분산 보정은 적용되지 않았다.
현장 용량 교정기와 정기적인 품질 관리의 적절한 교정은 여기에 제시된 교차 교정 절차유형에 대한 전제 조건입니다. 그러나 동물에게 투여된 활성이 동일한 용량 교정기로 측정되는 경우, 편차가 일정하고 완전한 교차 교정 절차가 수행된 경우 정확도의 편차가 취소됩니다. 핵종 별 교정(예: 다양한 반감기 또는 다른 분기 비율). 인간의 건강 관리 및 연구에 사용되는 PET / CT 시스템을 조화시키기위한 이러한 교정 절차를 사용하여 적어도 5-10 %의 정확도를 달성 할 수19,20.
이 프로토콜의 성공적인 구현에 의해 생성된 교정 및 수정된 AIF를 통해 동물 질병 모델의 특성화, 새로운 치료 옵션 테스트, 새로운 추적기 의 확립 및 전송을 위한 PET/CT 데이터의 정량화 다른 종으로 기존 추적기. 겉보기에, 쥐에서[18]FDG-PET/CT에서 연속 혈액 샘플링은 생체 운동 모델링에서 입력의 계산을 위한 가장 신뢰할 수 있는 정보를 제공한다. 개별 신진 대사, 특히 간 정리를 고려하면 관련 병리학 적 또는 치료 적 효과에 대한 보다 정확한 평가가 가능합니다. 이 실용적인 프로토콜을 통해 전임상 PET/CT 데이터 분석의 높은 효율을 쉽게 구현할 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
저자는 온라인 혈액 샘플링 시스템의 설립 기간 동안 지원을 위해 동물 주택 및 관리와 마티아스 Wyss에 대한 수잔 레만, 일로아나 클램푸스와 페트라 울프를 감사하게 인정합니다. 작은 동물 PET /CT는 도이치 포르충스게마인샤프트 (INST 2268/6-1 FUGG)에 의해 지원되었다.
Sugery for arteriovenous shunt | |||
anesthesia station | Groppler | ||
aneurysm clips | Aesculap | FT190T | 5 mm, closing force 70 g |
bulldog clamp | Aesculap | 35 mm | |
dissectiong scissors BC165 | Aesculap | 490-866 | dull, for skin preparation |
heating mat | |||
insulin syringe | Braun | 30G | |
needle holder | medicon | 11.62.18 | micro surgical |
pliers for aneurysm clips | Aesculap | FT 470T | Yasargil |
portex fine bore polythene tubing | Smith Medical | 800/100/200 | ID 0.58 mm, OD 0.96 mm; PE50 equivalent tubing |
surgical microscope with camera | Leica | M50 + MC120 HD | |
suture filaments 6.0 | 6.0, polypropylene | ||
suture filaments 3.0 | 3.0, absorbable, braided | ||
two anatomical forceps | Hammacher Soling | HSC601-11 | micro surgery, 45° |
vascular or corneal scissors | Geuder | G19605 | micro surgery scissors |
PET/CT imaging | |||
dose calibrator ISOMED 2010 | nivia instruments GmbH | for tracer portioning | |
Inveon PET/CT | Siemens | ||
tracer (e.g. 18F-FDG) | |||
manuel bloodsampling | |||
capillary blood collection EDTA tube | KABE Labortechnik GmbH | GK 150 EDTA 200 µl | |
test tubes | SARSTEDT | 5 ml, 75 x 12 mm, PS | |
well counter CAPTUS 700t | Capintec | manuel measurement of blood activity | |
automatic blood sampling | |||
BD Venflon TM pro safety shielded IV catheter; 18 G (1.3 mm x 32 mm) | BD | 3932269 | luer connections (to fit in t-connections) |
bloodsampler twilite two | swisstrace GmbH | ||
combi stopper | Braun | 4495101 | |
heparin | 50U/ml for tube flushing before the experiment and aspiration during catheter surgery | ||
hypodermic needle | G23 x 1 1/4" / 0.6 x 30 mm | ||
microprocessor controlled tubing pump | Ismatec/Cole-Parmer | ISM596 | 12 rollers, 2 channels |
PSAMPLE modul of PMOD | PMOD | ||
reduction connectors | Ismatec/Cole-Parmer | ISM569A | from ID 2.5 mm to ID 1.5 mm |
silicone pump tubes | Ismatec/Cole-Parmer | 070535-17-ND /SC0065N | for roller pump (yellow/blue/yellow ID 1.52 mm, WT 0.84 mm, OD 3.2 mm) |
silicone pump tubes – adapter tubing | Ismatec/Cole-Parmer | SC 0107 | black/black/black ID 0.76 mm, WT 0.86 mm, OD: 2.48 mm |
t-piece or t-connections | Ismatec/Cole-Parmer | ISM 693A | ID 2.5 mm |