Стандартизированные и масштабируемые анализ для изучения Перфированный 3D ангиогенной прорастания iPSC полученных эндотелиальных клеток в Vitro
Summary
Этот метод описывает культуру эндотелиальных клеток, полученных iPSC, как 40 проникнутых 3D микрососудов в стандартизированной микрофлюидной платформе. Эта платформа позволяет изучать градиентно-управляемый ангиогенный прорастания в 3D, в том числе анастомоз и стабилизации ангиогенных ростков в масштабируемой и высокой пропускной форме.
Abstract
Доклинические лекарственные исследования сосудистых заболеваний требуют в пробирке моделей сосудов, которые поддаются коррективу для скрининга с высокой пропускной способностью. Тем не менее, текущие модели скрининга in vitro, которые имеют достаточную пропускную способность, имеют лишь ограниченную физиологическую значимость, что препятствует переводу результатов из in vitro в in vivo. С другой стороны, микрофлюидные платформы культуры клеток показали беспрецедентную физиологическую релевантность in vitro, но часто не имеют необходимой пропускной способности, масштабируемости и стандартизации. Мы демонстрируем надежную платформу для изучения ангиогенеза эндотелиальных клеток, полученных из индуцированных человека плюрипотентных стволовых клеток (iPSC-ECs) в физиологической соответствующей клеточной микросреде, включая перфузию и градиенты. iPSC-ECs культивируются как 40 проникнуты 3D микрососудов против узорчатых коллагена-1 эшафот. При применении градиента ангиогенных факторов можно изучить важные признаки ангиогенеза, в том числе дифференциацию на оконечности и стебельную клетку и образование просвета. Перфузия флуоресцентными красителями позволяет изучать проницаемость во время и после анастомоза ангиогенных ростков. В заключение, этот метод показывает осуществимость iPSC полученных ECs в стандартизированных и масштабируемых 3D ангиогенных ассеи, который сочетает в себе физиологические соответствующие условия культуры в платформе, которая имеет необходимую надежность и масштабируемость, чтобы быть интегрированы в инфраструктуры скрининга наркотиков.
Introduction
Модели In vitro играют основополагающую роль в открытии и проверке новых лекарственных целей сосудистых заболеваний. Тем не менее, текущие модели скрининга in vitro, которые имеют достаточную пропускную способность, имеют только ограниченную физиологическую актуальность1,что препятствует переводу результатов из in vitro в in vivo. Таким образом, для продвижения доклинических исследований сосудистого препарата необходимы усовершенствованные модели свиной свиной свиной свиной свиной свиной микро-средой.
В течение последнего десятилетия был достигнут значительный прогресс в повышении физиологической значимости моделей сусультуры in vitro. Вместо культивирования эндотелиальных клеток на плоских поверхностях, таких как ткани культуры пластмасс, эндотелиальные клетки могут быть встроены в 3D леса, такие как фибрин и коллаген гели2. В этих матрицах эндотелиальные клетки показывают более физиологически значимый фенотип, связанный с деградацией матрицы и образованием просвета. Тем не менее, эти модели демонстрируют только подмножество многих процессов, которые происходят во время ангиогенного прорастания, как важные сигналы из клеточной микросреды по-прежнему отсутствуют.
Платформы микрофлюидной культуры клеток однозначно подходят для дальнейшего повышения физиологической значимости моделей сусультуры in vitro. Например, эндотелиальные клетки могут подвергаться стрессу сдвига, который является важным биомеханическим стимулом для сосуды. Также возможность пространственно контролировать жидкости в микрофлюитике позволяет формировать биомолекулярные градиенты3,4,5,6. Такие градиенты играют важную роль в vivo во время формирования и узора во время ангиогенеза. Однако, в то время как микрофлюидные платформы культуры клеток показали беспрецедентную физиологическую релевантность по сравнению с традиционными методами 2D и 3D-культуры клеток, они часто не имеют необходимой пропускной способности, масштабируемости и стандартизации, которая необходима для скрининга наркотиков 7. Кроме того, многие из этих платформ не являются коммерчески доступными и требуют от конечных пользователей микрофабриката своих устройств до использования8. Это не только требует производственного аппарата и технических знаний, но и ограничивает уровень контроля качества и негативно влияет на воспроизводимость9.
На сегодняшний день первичные эндотелиальные клетки человека остаются наиболее широко используемым источником клеток для моделирования ангиогенеза in vitro10. Тем не менее, первичные человеческие клетки имеют ряд ограничений, которые препятствуют их обычному применению в подходах скрининга. Во-первых, существует ограниченная возможность расширения и расширения первичных культур, полученных из клеток. Таким образом, для крупномасштабного эксперимента необходимо использовать партии от разных доноров, что приводит к геномным различиям и вариациям партии в партию. Во-вторых, после нескольких проходов, первичные эндотелиальные клетки обычно теряют соответствующие свойства, когда культивируется в пробирке11,12.
Эндотелиальные клетки, полученные из индуцированных стволовыми клетками человека (iPSC), являются перспективной альтернативой: они напоминают первичные клетки, но с более стабильным генотипом, который также поддается точному редактированию генома. Кроме того, iPSCs способны к самообновлению и, таким образом, могут быть расширены в почти неограниченных количествах, что делает клетки, полученные из iPSC, привлекательной альтернативой первичным клеткам для использования в рамках моделей скрининга in vitro13.
Здесь мы описываем метод культуры эндотелиальных клеток как перфусируемые 3D микрососуды в стандартизированной, высокой пропускной микрофлюидной платформе культуры клеток. Перфузия применяется путем размещения устройства на рокер платформы, которая обеспечивает надежную работу и увеличивает масштабируемость асссе. Поскольку микрососуды постоянно пронизаны и подвергаются градиенту ангиогенных факторов, ангиогенное прорастание изучается в более физиологической клеточной микросреде. В то время как протокол совместим со многими различными источниками (первичных) эндотелиальных клеток14,15, мы сосредоточились на использовании человека iPSC полученных ECs для того, чтобы увеличить стандартизацию этого комитета и облегчить его интеграцию в сосудистых исследованиях наркотиков.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот метод описывает культуру 40 перфузируемых эндотелиальных микрососудов в надежной и масштабируемой платформе микрофлюидной культуры клеток. По сравнению с традиционными методами 2D и 3D-культуры клеток, этот метод показывает, как физиологическая релевантная клеточная микросреда, включающая градиенты и непрерывную перфузию, может быть объединена с 3D-клеточной культурой с адекватной пропускной мощностью для скрининга Целей.
Одним из основных преимуществ по сравнению с сопоставимыми микрофлюидных анализов является то, что этот метод не опирается на насосы для перфузии, но использует платформу рокер, чтобы вызвать непрерывную перфузию во всех микрофлюидных единиц одновременно. Это гарантирует, что ассеий является надежным и масштабируемым: пластины могут быть уложены на рокер платформы. Важно отметить, что все микрофлюидные блоки остаются индивидуально адресными, что позволяет внедрить этот метод в рамках скрининга на наркотики, включая генерацию кривой дозы-реакции. Кроме того, без насоса, визуализации и средней замены гораздо проще с меньшим риском (кросс)-загрязнения.
Еще одним преимуществом этого метода является использование стандартизированной, предварительно изготовленной платформы, в то время как сопоставимые платформы микрофлюидной культуры клеток должны быть изготовлены конечными пользователями. Такая доступность облегчает принятие этого исследования среди других академических и фармацевтических исследовательских групп, что приводит к стандартизации. Кроме того, в отличие от микрофлюидных прототипов, интерфейс 384-хорошо пластины обеспечивает совместимость с текущим лабораторным оборудованием (например, аспираторы, пластины обработчики и многоканальные пипетки), облегчая интеграцию в рамках текущей инфраструктуры скрининга .
Есть несколько важных шагов в выполнении этого ассепа. Гель коллагена-1 должен полностью заполнить гелевый канал. Во время погрузки геля, эта начинка может наблюдаться путем проверки микрофлюидных каналов либо через окно наблюдения(рисунок 2a) или переворачивая пластину вверх дном (как показано на рисунке 1a). При заполнении коллагеновый гель должен оставаться в центральном канале, не вливаясь в соседние перфузийные каналы. Мы заметили, что качество коллагена-1 гель имеет решающее значение для надлежащей производительности ассеа. Партии коллагена-1 с слишком высокой вязкостью приведут к неполной заполнению гелевого канала. После 10 мин полимеризации при 37 градусах Цельсия гель должен быть однородным и прозрачным. Если коллаген-1 не хранится должным образом (например, из-за колебаний температуры в холодильнике), коллаген будет полимеризироваться в каналах с четко видимым образованием волокна. Это может привести к вторжению ЭК в гель без добавления ангиогенных факторов, но без надлежащего развития просвета.
Когда клетки посеяны, фибронектин покрытие раствор удаляется из колодцев, оставляя только микрофлюидные каналы заполнены покрытием раствора. Стремление раствора покрытия из микрофлюидных каналов может привести к нарушению геля или аспирации геля. Суспензия клетки должна заменить/вытеснить это покрытие раствора. Это работает лучше всего, когда подвеска ячейки посеяна с помощью пассивного метода накачки, так как непосредственно пипетка яточной подвески в каналы показывают менее воспроизводимую плотность посева.
По мере того как микрососуды формируют стабилизированный монослой против геля, эти малые разницы только приводят в по-разному временах необходимых для достижения confluency. Таким образом, отправная точка ассеа определяется не культурным временем, а времям. При необходимости время культивирования может быть продлено до тех пор, пока против геля не образуется четкий монослой.
Внутри скважин воздушные пузырьки могут быть захвачены неправильным заполнением скважин (см. рисунок 2b). Эти пузырьки воздуха будут ограничивать поток среды, даже когда устройство находится на платформе рокера, и привести к коллапсу микросудна и неправильному образованию градиента. Принажатие наконечника пипетки на боковую стенку колодцев увеличит успех полного заполнения скважины. Если пузырь воздуха находится в ловушке в колодцах, он может быть удален, аккуратно вставив стерильный кончик пипетки в стеклянное дно. Воздушные пузыри могут также возникать в микрофлюидных каналах. Когда среда удалена из скважин, испарение среды заметно из микрофлюидных каналов после 30 мин (из-за микролитра объемов в каналах). Таким образом, средние изменения предпочтительно выполняются как можно быстрее. Когда среда добавляется в канал с испаряемым средством, пузырьки воздуха будут находиться в ловушке в микрофлюидных каналах. Эти пузырьки воздуха в микрофлюидных каналах могут быть удалены вручную, поместив пипетку P20 непосредственно на входе или розетке и заставляя среду через микрофлюиды из противоположного колодца. Успешное удаление пузырьков воздуха приводит к небольшому, но заметному снижению объема в другой скважине. В таблице 1 перечислены распространенные ошибки и способы их устранения.
Отсутствие насоса является ограничением, когда требуется непрерывное изображение, так как платформа рокера ограничивает пользователя изображением на последовательных временных интервалах. Кроме того, перфузия среды на этой платформе состоит из двунаправленного потока с низким уровнем напряжения сдвига, в то время как сосудininin in vivo подвергается однонаправленному потоку с более высоким уровнем напряжения сдвига. Хотя мы не наблюдаем негативных последствий двунаправленного потока в отношении ангиогенного прорастания, поток является важным биомеханическим стимулом и предпочтительно контролируется. Однако, в то время как Есть коммерчески доступных насосных установки, взаимодействие с 384-ну хорошо пластины остается сложной задачей и насос установки серьезно препятствуют масштабируемости этого асссе.
Возможность использования iPSC-ECs для изучения ангиогенного прорастания открывает новые возможности в моделировании заболеваний и исследованиях лекарственных средств. В отличие от первичных ECs, эти клетки могут быть созданы в почти безграничных количествах со стабильным генотипом и с помощью методов редактирования генома, клетки могут быть созданы, что в том числе геннокаутов и стук-ин. Однако, поскольку протоколы, отличающие ECs от iPSC, являются относительно новыми, до сих пор неясно, что приводит к iPSC-ECs, которые наилучшим образом отражают первичные ECs и какие подтипы EC являются или могут быть созданы. Кроме того, по-прежнему остаются вопросы, касающиеся их релевантности. Например, по-прежнему ли iPSC-ECs демонстрируют пластичность, характерную для эндотелиальных клеток? И в какой степени клетки, полученные из iPSC, реагируют и взаимодействуют со своей клеточной микросредой? Стандартизированная платформа, представленная здесь, может быть использована для ответа на некоторые из этих вопросов для дальнейшей проверки использования eCs in vitro, полученных из iPSC.
Наиболее прямое направление будущего для этого ассебудет будет интеграция других типов клеток, которые играют важную роль во время ангиогенеза, таких как перициты и макрофаги. Это облегчит возможность изучения роли макрофагов во время анастомоза между ростками или присоединения перицитов после образования капилляров. Кроме того, можно культивировать различные другие типы клеток внутри или против внеклеточной матрицы (например, мы показали культуру нейронов и различных эпителиальных структур, таких как проксимальные трубки и тонкий кишечник), которые могут быть объединены с сосудистыми кровати, генерируемые с помощью этого метода. Наконец, будет интересно изучить ангиогенное прорастания в синтетических гидрогелях, так как их определенный состав еще больше увеличивает стандартизацию асссея и позволяет настройку жесткости и связывающих мотивов, влияющих на взаимодействие клеток и матриц.
В заключение, этот метод показывает осуществимость iPSC полученных ECs в стандартизированных и масштабируемых 3D ангиогенных ассеи, который сочетает в себе физиологические соответствующие условия культуры в платформе, которая имеет необходимую надежность и масштабируемость, чтобы быть интегрированы в инфраструктуры скрининга наркотиков.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа частично поддерживается исследовательским грантом от программы «Meer Kennis met Minder Dieren» (проект No 114022501) Нидерландской организации по исследованиям и развитию здравоохранения (ЗонМ) и грантом голландского фонда сердца CVON Подключите.
Materials
| 0.2-10 μL Electronic repeater pipette | Sigma | Z654566-1EA | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-056 | |
| 3-lane OrganoPlate | Mimetas | 4003-400B | |
| 4% PFA in PBS | Alfa Aesar | J61899 | |
| Basal culture medium | NCardia | ||
| Collagen-1 | Cultrex | 3447-020-01 | |
| Combitips Advanced Biopur 2.5 mL | VWR | 613-2071 | |
| dPBS | Gibco | 14190-094 | |
| Eppendorf Repeater M4 pieptte | VWR | 613-2890 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F4759-1MG | 1 mg/mL in milliQ water |
| HBSS | Gibco | 14025-050 | |
| Hoechst | Molecular Probes | H3569 | 10 mg/mL solution in water |
| iPSC-derived endothelial cells | NCardia | ||
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | 37 g/L in milliQ water |
| OrganoPlate Perfusion Rocker Mini | Mimetas | Rocker platform used to provide flow | |
| Pen/Strep | Sigma | P4333 | |
| Phalloidin | Sigma | P1951 | 1 mg/mL in DMSO |
| PMA | Focus-Biomolecules | 10-2165 | 2 μg/mL in PBS containing 0.1% DMSO |
| S1P | Ecehelon Biosciences | S-2000 | 1 mM in methanol containing 1% acetic acid |
| TRITC-albumin | Invitrogen | A34786 | |
| VEGF | Peprotech | 450-32-10 | 50 μg/mL in water containing 0.1% BSA |
References
- Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).
- Davis, G. E., et al. Control of vascular tube morphogenesis and maturation in 3D extracellular matrices by endothelial cells and pericytes. Methods in Molecular Biology. , 17-28 (2013).
- Kim, S., Chung, M., Jeon, N. L. Three-dimensional biomimetic model to reconstitute sprouting lymphangiogenesis in vitro. Biomaterials. 78, 115-128 (2016).
- Kim, C., Kasuya, J., Jeon, J., Chung, S., Kamm, R. D. A quantitative microfluidic angiogenesis screen for studying anti-angiogenic therapeutic drugs. Lab Chip. 15 (1), 301-310 (2015).
- Kim, J., et al. Engineering of a Biomimetic Pericyte-Covered 3D Microvascular Network. PLoS One. 10 (7), e0133880 (2015).
- Tourovskaia, A., Fauver, M., Kramer, G., Simonson, S., Neumann, T. Tissue-engineered microenvironment systems for modeling human vasculature. Experimental biology and medicine. 239 (9), 1264-1271 (2014).
- Junaid, A., Mashaghi, A., Hankemeier, T., Vulto, P. An end-user perspective on Organ-on-a-Chip: Assays and usability aspects. Current Opinion in Biomedical Engineering. 1, 15-22 (2017).
- Pagano, G., et al. Optimizing design and fabrication of microfluidic devices for cell cultures: An effective approach to control cell microenvironment in three dimensions. Biomicrofluidics. 8 (4), 046503 (2014).
- Berthier, E., Young, E. W., Beebe, D. Engineers are from PDMS-land, Biologists are from Polystyrenia. Lab Chip. 12 (7), 1224-1237 (2012).
- Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425 (2018).
- Dejana, E., Hirschi, K. K., Simons, M. The molecular basis of endothelial cell plasticity. Nature Communications. 8, 14361 (2017).
- Geraghty, R. J., et al. Guidelines for the use of cell lines in biomedical research. British Journal of Cancer. 111 (6), 1021-1046 (2014).
- Passier, R., Orlova, V., Mummery, C. Complex Tissue and Disease Modeling using hiPSCs. Cell Stem Cell. 18 (3), 309-321 (2016).
- van Duinen, V., et al. Perfused 3D angiogenic sprouting in a high-throughput in vitro platform. Angiogenesis. 22 (1), 157-165 (2019).
- Wevers, N. R., et al. A perfused human blood-brain barrier on-a-chip for high-throughput assessment of barrier function and antibody transport. Fluids Barriers CNS. 15 (1), 23 (2018).
