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Bioengineering

Analisi standardizzata e scalabile per studiare la germogliazione angiogenica 3D perfusa di cellule endoteliali derivate da iPSC in Vitro

Published: November 06, 2019
doi:
10.3791/59678
, , , , , , ,
1Department of Internal Medicine (Nephrology) and the Einthoven Laboratory for Vascular and Regenerative Medicine,Leiden University Medical Center, 2Division of Systems Biomedicine and Pharmacology, Department of Analytical BioSciences and Metabolomics,Leiden University, 3Ncardia, 4Department of Anatomy and Embryology,Leiden University Medical Center, 5Mimetas

Summary

Questo metodo descrive la coltura delle cellule endoteliali derivate da iPSC come 40 micronavi 3D perfuse in una piattaforma microfluidica standardizzata. Questa piattaforma consente lo studio della germogliazione angiogenica basata su gradienti in 3D, tra cui l’anastomosis e la stabilizzazione dei germogli angiogenici in modo scalabile e ad alta produttività.

Abstract

La ricerca pre-clinica sui farmaci delle malattie vascolari richiede modelli in vitro di vascolatura che siano modificabili per lo screening ad alto consumo. Tuttavia, gli attuali modelli di screening in vitro che hanno una produttività sufficiente hanno solo una rilevanza fisiologica limitata, il che ostacola la traduzione dei risultati dall’invitro all’in vivo. D’altra parte, le piattaforme di coltura cellulare microfluidica hanno dimostrato una rilevanza fisiologica senza precedenti in vitro, ma spesso mancano della produttività, della scalabilità e della standardizzazione richieste. Dimostriamo una solida piattaforma per studiare l’angiogenesi delle cellule endoteliali derivate da cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC-EC) in un microambiente cellulare fisiologico rilevante, tra cui perfusione e gradienti. Gli iPSC-EC sono coltivati come 40 microvessels 3D perfusi contro uno scaffold di collagene-1 modellato. Dopo l’applicazione di un gradiente di fattori angiogenici, è possibile studiare importanti segni di angiogenesi, tra cui la differenziazione in cellule di punta e gambo e la formazione di lume perfutilizzabile. La perfusione con coloranti traccianti fluorescenti consente lo studio della permeabilità durante e dopo l’anastomosi dei germogli angiogenici. In conclusione, questo metodo mostra la fattibilità delle EC derivate da iPSC in un saggio angiogenico 3D standardizzato e scalabile che combina condizioni di coltura fisiologiche rilevanti in una piattaforma che ha la robustezza e la scalabilità necessarie da integrare all’interno l’infrastruttura di screening dei farmaci.

Introduction

I modelli in vitro svolgono un ruolo fondamentale nella scoperta e nella convalida di nuovi bersagli farmacologici di malattie vascolari. Tuttavia, gli attuali modelli di screening in vitro che hanno una produttività sufficiente hanno solo una rilevanza fisiologica limitata1, il che ostacola la traduzione dei risultati dall’invitro all’in vivo. Così, per far progredire la ricerca pre-clinica sui farmaci vascolari, sono necessari modelli di vascolarizzazione migliorati che combinano lo screening ad alta produttività con un micro-ambiente cellulare 3D fisiologicamente rilevante.

Nell’ultimo decennio sono stati compiuti progressi significativi per aumentare la rilevanza fisiologica dei modelli in vitro di vascolatura. Invece di coltivare cellule endoteliali su superfici piatte come la plastica a coltura dei tessuti, le cellule endoteliali possono essere incorporate in scaffold 3D, come fibrina e gel di collagene2. All’interno di queste matrici, le cellule endoteliali mostrano un fenotipo più fisiologicamente rilevante associato alla degradazione della matrice e alla formazione del lume. Tuttavia, questi modelli dimostrano solo un sottoinsieme dei molti processi che si verificano durante la germogliazione angiogenica, poiché mancano ancora segnali importanti del microambiente cellulare.

Le piattaforme di coltura cellulare microfluidica sono particolarmente adatte ad aumentare ulteriormente la rilevanza fisiologica dei modelli in vitro di vascolatura. Ad esempio, le cellule endoteliali possono essere esposte allo stress da taglio, che è un importante stimolo biomeccanico per la vascolatura. Inoltre, la possibilità di controllare spazialmente i fluidi all’interno della microfluidica permette la formazione di gradienti biomolecolari3,4,5,6. Tali gradienti svolgono un ruolo importante in vivo durante la formazione e il patterning durante l’angiogenesi. Tuttavia, mentre le piattaforme di coltura cellulare microfluidica hanno dimostrato una rilevanza fisiologica senza precedenti rispetto ai tradizionali metodi di coltura delle cellule 2D e 3D, spesso mancano della produttività, della scalabilità e della standardizzazione necessarie per lo screening farmacologico 7. Inoltre, molte di queste piattaforme non sono disponibili in commercio e richiedono agli utenti finali di microfabbricare i loro dispositivi prima dell’uso8. Ciò richiede non solo l’apparato di produzione e le conoscenze tecniche, ma limita anche il livello di controllo della qualità e influisce negativamente sulla riproducibilità9.

Ad oggi, le cellule endoteliali primarie rimangono la fonte cellulare più utilizzata per modellare l’angiogenesi in vitro10. Tuttavia, le cellule umane primarie hanno una serie di limitazioni che ostacolano la loro applicazione di routine negli approcci di screening. In primo luogo, esiste una possibilità limitata di aumentare ed espandere le colture derivate da cellule primarie. Pertanto, per l’esperimento su larga scala, devono essere utilizzati lotti di diversi donatori, il che si traducono in differenze genomiche e variazioni batch-to-batch. In secondo luogo, dopo alcuni passaggi, le cellule endoteliali primarie generalmente perdono proprietà rilevanti quando coltivate in vitro11,12.

Le cellule endoteliali derivate da cellule staminali pluripotenti indotte dall’uomo (iPSC) sono un’alternativa promettente: assomigliano alle cellule primarie, ma con un genotipo più stabile che è anche suscettibile all’editing preciso del genoma. Inoltre, gli iPSC sono in grado di rinnovarsi e quindi possono essere ampliati in quantità quasi illimitate, che rendono le cellule derivate da iPSC un’alternativa interessante alle cellule primarie per l’utilizzo all’interno di modelli di screening in vitro13.

Qui, descriviamo un metodo per colture di cellule endoteliali come microvessels 3D perfutilizzabili in una piattaforma standardizzata di coltura microfluidica ad alto contenuto di velocità. La perfusione viene applicata posizionando il dispositivo su una piattaforma rocker, che garantisce un funzionamento robusto e aumenta la scalabilità del saggio. Poiché i micronavi sono continuamente perfusi ed esposti a un gradiente di fattori angiogenici, la germogliazione angiogenica viene studiata in un microambiente cellulare più fisiologico rilevante. Mentre il protocollo è compatibile con molte fonti diverse di cellule endoteliali (primarie)14,15, ci siamo concentrati sull’utilizzo di EC derivati da iPSC umani al fine di aumentare la standardizzazione di questo saggio e per facilitare la sua integrazione nell’ambito della ricerca sui farmaci vascolari.

Protocol

1. Preparazione del dispositivo Trasferire la piastra microfluidica 384-well in un cappuccio sterile a flusso laminare. Togliere il coperchio e aggiungere 50 l of water o phosphate-buffered salina (PBS) a ciascuno dei 40 pozzi di osservazione(Figura 1b, po ‘B2) utilizzando una pipetta multicanale o ripetuta. NOT:</ Il protocollo può essere messo in pausa qui. Lasciare la piastra con il coperchio nell’armadietto della coltura sterile a temperatura ambiente (RT). 2. Preparare Gel e Rivestimento Preparare una soluzione di rivestimento per fibronectina (FN) da 2,5 mL di 10 g/mL. Diluire 25 – L di 1 mg/mL di cartoncino in 2,5 mL di PBS di Dulbecco (dPBS, calcio e magnesio libero). Collocare la soluzione nel bagno d’acqua a 37 gradi centigradi fino all’uso. Preparare 100 l di collagene-1 soluzione. Aggiungete 10 di HEPES (1 M) a 10 di NaHCO3 (37 g/L) e mescolate con il pipettaggio. Mettere il tubo sul ghiaccio e aggiungere 80 l of collagene-1 (5 mg/mL) per produrre una concentrazione di collagene-1 neutralizzato di 4 mg/mL. Utilizzare una pipetta per mescolare con attenzione ed evitare la formazione di bolle. Aggiungete 1,5 l di collagene-1 (4 mg/mL) all’insediazione gel di ogni unità microfluidica(Figura 1b, po’ B1). Assicurarsi che la goccia di gel sia posta al centro di ogni pozzo in modo che il gel entri nel canale (vedere Figura 2a). NOT:</ Le guide di fase impediscono il riempimento dei canali adiacenti e consentono la codifica in gel. Il corretto carico del gel può essere confermato al microscopio di un campo luminoso osservando la formazione del menisco attraverso la “finestra di osservazione” (beh B2) o capovolgendo la piastra a testa in giù. Se il gel non ha riempito completamente il canale, è possibile aggiungere una goccia aggiuntiva di 1 oL. Collocare la piastra microfluidica in un’incubatrice (37 gradi centigradi, 5% CO2)per 10 min per polimerizzare il collagene-1. NOT:</ La tempistica della polimerizzazione è cruciale; a causa dei bassi volumi utilizzati in microfluidica, l’evaporazione può già essere osservata dopo 15 min di incubazione, che si traduce in collasso o restringimento del gel. Estrarre la piastra dall’incubatrice e trasferirla in un cappuccio sterile a flusso laminare. Aggiungete 50 l l di 10 g/mL al pozzo di uscita del canale di perfusione superiore di ogni unità microfluidica (Figura 1b, beh A3). Premere la punta della pipetta contro il lato del pozzo per il corretto riempimento del pozzo senza intrappolare le bolle d’aria (vedere La figura 2b). Il canale dovrebbe riempirsi e il liquido dovrebbe bloccare sulla presa (ben C1) senza riempire bene l’uscita. Collocare la piastra nell’incubatrice (37 gradi centigradi, 5% CO2) per almeno 2 giorni. NOT:</ Il protocollo può essere messo in pausa qui, come il gel di collagene-1 insieme con la miscela di rivestimento è stabile per almeno 5 giorni in incubatrice. Se la miscela di rivestimento viene aggiornata, potrebbero essere possibili periodi più lunghi, ma questo non è stato testato. Fondamentale è il livello di rivestimento FN, in quanto impedisce la disidratazione del gel collagene-1. 3. Semina cellulare / Microvessel Culture Aggiungere 5 mL di siero di vitello fetale e 2,5 mL di penna/streptop a 500 mL di mezzo di coltura delle cellule endoteliali basali e filtrare sterilizzare utilizzando un filtro superiore di bottiglia con dimensione dei pori di 0,22 m. Questo mezzo è ora indicato come mezzo basale. Preparare il mezzo di crescita vascolare: Aggiungere 3 l-l di 50 g/mL del fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) e di 2 -g/ml di fattori di crescita del fibroblasto di base (bFGF) a 5 mL di mezzo basale. Scongelare rapidamente gli iPSC-EC congelati (<1 min) in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi e trasferirli in un tubo da 15 mL e diluire in 10 mL di mezzo basale. Conta le celle. NOT:</ Una singola fiala contiene 1 milione di cellule in 0,5 mL con >90% di vitalità. Centrifugare il tubo a 100 x g per 5 min. Aspirate supernatant senza disturbare il pellet cellulare e respendere in mezzo basale per produrre una concentrazione di 2 x 107 cellule / mL. Trasferire la piastra microfluidica 384 po’ dall’incubatrice a una sterile cappa a flusso laminare. Aspirare FN-coating soluzione dall’inserito perfusione (ben A1). Aggiungete 25 l di mezzo basale nei pozze di montaggio (bene A1). Aggiungete una goccia di sospensione cellulare di 1 ll a ogni insedio superiore perfusione(Figura 1b, ben A1). La goccia dovrebbe appiattirsi in pochi secondi (vedere la figura 3a,b per un’illustrazione di questo metodo di pompaggio passivo).NOTA: Controllare al microscopio se la semina è omogenea. In caso contrario, aggiungere un altro 1 – L nella presa e attendere che la goccia si appiattisca. Incubare il pozzo microfluidico per 1 h a 37 , 5% CO2. Dopo questo, le cellule avrebbero dovuto aderire. In caso contrario, attendere altri 30 min. Rimuovere il supporto basale dai pozzi di uscita perfusione superiore (Figura 1b, ben A3). Aggiungere il mezzo caldo di coltura del vaso nell’imletenza e nell’uscita di perfusione superiore (Figura 1b, pozzi A1 e A3). Posizionare la piastra sulla piattaforma del rocker (impostata su un angolo di 7 gradi, intervallo a dondolo di 8 min) nell’incubatrice (37 gradi centigradi, 5% CO2). Immagine della piastra utilizzando un microscopio a campo luminoso con fase automatizzata al giorno 1 e 2 post-seeding per confermare la vitalità cellulare. Dopo 2 giorni, un mostrato confluente dovrebbe essersi formato contro l’impalcatura di collagene-1. NOT:</ Se i canali non sembrano essere ugualmente confluenti, i micronavi possono essere coltivati per ulteriori 24 ore. 4. Studio Germoglio angiogenico compresa la formazione delle cellule di punta e di stalk Preparare 4,5 mL di mezzo di germogliazione angiogenica completando il mezzo basale con 4,5 litri di VEGF (50 g/mL di stock), 4,5 l di phorbol 12-myristate-13-aceto (PMA) (2 g/mL di stock) e 2,25 – L di sphingosina-1-fosfato (S1P) (1 m). Preparare 8,5 mL di mezzo di crescita della nave (mezzo basale integrato con 30 ng/mL VEGF e 20 ng/mL bFGF). Mezzo aspirato dai pozzi e aggiungere 50 l di mezzo di coltura di vasi freschi nella parte superiore di perfusione inserimento e pozzi di uscita e gel inserito e outlet pozzetto(Figura 1b, pozzi A1, A3, B1 e B3). Aggiungete 50 l di miscela di germogli angiogenici a ciascuno dei pozzetti e pozzi di uscita del canale perfusione inferiore (Figura 1b, pozzi C1 e C3). Collocare il dispositivo nell’incubatrice (37 gradi centigradi, 5% CO2)sulla piattaforma rocker per formare un gradiente di fattori di crescita angiogenici. Immagine 1 giorno e 2 giorni dopo l’aggiunta dei fattori di crescita angiogenici utilizzando un microscopio a campo luminoso con stadio automatizzato. NOT:</ Continuare a coltivare i micronavi per studiare l’anastomosi (andare alla sezione 5) o fissare e macchiare i microvasi per quantificare la lunghezza e la morfologia del giorno 2 e del giorno 6 (andare alla sezione 6). 5. Studio Anastomosis e Stabilizzazione germoglio Immagine con un microscopio a campo luminoso con fase automatizzata. Aggiungete 1 -L di albumina fluorescente (0,5 mg/mL) all’inserito di perfusione superiore(Figura 1b, beh A1) e mescolate utilizzando una pipetta da 50 luna. Trasferire la piastra in un microscopio fluorescente con stacco automatizzato e incubatrice posta a 37 gradi centigradi. Impostare il microscopio a impostazioni di esposizione obiettive e corrette 10x (ad esempio, tetramethylrhodamine [TRITC]-canale, 20 ms di esposizione). Acquisire immagini time-lapse ogni minuto per 10 min. Rimuovere la piastra dal microscopio e trasferire la piastra in un cappuccio sterile a flusso laminare. Rimuovere tutto il mezzo dai pozzetto e sostituire sia il mezzo di coltura del vaso che il mezzo di germoglio angiogenico nei pozzi corrispondenti (vedere i passaggi 4.3 e 4.4). Rimettere il dispositivo nell’incubatrice (37 gradi centigradi, 5% CO2)per continuare la germogliazione angiogenica. Ripetete i passaggi da 5,1 a 5,6 per studiare la permeabilità al giorno 6. 6. Fissaggio, colorazione e imaging Aspira tutti i media culturali da tutti i pozzi. NOT:</ Il mezzo residuo o i liquidi nei canali microfluidici non influenzano la fissazione a causa del suo basso volume di 1/2 L. Aggiungere 25 – L del 4% di paraformaldeide (PFA) in PBS a tutta l’imbottitura di perfusione (Figura 1b, A1 e C1) e pozzi di uscita (Figura 1b, A3 e C3). Incubare per 10 min a RT. Posizionare il dispositivo sotto un leggero angolo (5 ) per indurre il flusso (ad esempio, posizionando un lato della piastra su un coperchio). Aspirare PFA dai pozzi. Lavare due volte tutte le prese e le prese di perfusione con 50-L della soluzione di sale bilanciato di Hank (HBSS). Aspirare HBSS da pozzi. Permeabilizzare a RT per 10 min aggiungendo 50 luna di 0,2% di surfactant nonionico a tutte le prese e le prese di perfusione. Aspirare il surfactant nonionico da pozzi. Lavare i canali di perfusione due volte aggiungendo 50 L di HBSS a tutte le luci di perfusione e ai pozzi di uscita. Aspirare HBSS da pozzi. Macchiare i nuclei utilizzando Hoechst (1:2,000) e F-actin utilizzando phalloidin (1:200) in HBSS. Preparare 2,2 mL per 40 unità, e aggiungere 25 L ad ogni inserimento e presa bene. Posizionare la piastra sotto una leggera angolazione e incubare rt per almeno 30 min. Lavare due volte con 50 – L di HBSS in tutte le prese di perfusione e prese. Immagine diretta utilizzando un microscopio fluorescente con stadio automatizzato o conservare la piastra protetta dalla luce a 4 gradi centigradi per un uso successivo.

Representative Results

La piattaforma di coltura cellulare 3D microfluidica è costituita da 40 unità microfluidiche perfuse (Figura 1a,b), che viene utilizzata per studiare la germogliazione angiogenica di microvessels perfusi contro un gel di collagene-1 modellato (Figura 1c). Queste micronavi sono continuamente perfuse ed esposte a un gradiente di fattori di crescita angiogenici (Figura 3a-d). I germogli angiogenici possono essere studiati 2 giorni dopo l’esposizione al gradiente o coltivati per più di 5 giorni dopo l’esposizione al gradiente per studiare anastomosi e stabilizzazione del germoglio (vedere timeline, Figura 1d). La seeding degli iPSC-EC utilizzando il metodo di pompaggio passivo dovrebbe comportare densità di semità omogenee (Figura 4a,b). La coltura in continua perfusione ha portato a microvessels confluenti in 2 giorni, con le cellule che rivestono completamente la circonferenza del canale microfluidico e la formazione di un monostrato confluente contro il gel di collagene-1 modellato. L’esposizione a un gradiente di fattori angiogenici ha portato alla germogliazione angiogenica direzionale dei microvasi all’interno del gel di collagene-1 modellato(Figura 5a-g). La formazione e l’invasione delle cellule di punta chiara nel gel di collagene-1 erano visibili 24 h dopo l’aggiunta del gradiente angiogenico, mentre le cellule di gambo, inclusa la formazione di lume, erano visibili dopo 48 h (Figura 5a). Dopo la fissazione e la colorazione, la rete capillare può essere visualizzata utilizzando il phalloidin per macchiare F-actin e utilizzando Hoechst 33342 per macchiare il nucleo (Figura 5b,c). Questi germogli possono essere quantificati (ad esempio, forma e lunghezza14). Senza l’aggiunta di fattori di crescita, nessuna invasione nel gel di collagene-1 dovrebbe essere osservata (Figura 5d). L’imaging confocale è stato utilizzato per determinare il diametro del germoglio e per confermare la formazione del lume (Figura 5e-g). I germogli continuano a crescere verso la direzione del gradiente e raggiungono il canale di perfusione opposto entro 3/4 giorni dopo l’aggiunta di fattori di crescita angiogenici. Ciò si traduce nel rimodellamento della rete vascolare, con una chiara riduzione del numero di germogli angiogenici (Figura 6a). La formazione di lumen è stata valutata mediante perfusione della rete vascolare con macromolecole fluorescenti (ad esempio, albumina o dextrans). Perfassociare i microvessels con 0,5 mg/mL etichettato albumina prima e dopo l’anastomosis ha rivelato una chiara differenza nella permeabilità del germoglio dopo 10 min (Figura 6b-e), che suggerisce che i capillari stabilizzano e maturano dopo l’anastomosi. Figura 1: Protocollo di coltura cellulare microfluidica per micronavi derivate da iPSC. (a) Viene visualizzato il fondo del dispositivo di coltura cellulare microfluidica che mostra le 40 unità microfluidiche integrate sotto la piastra 384. La vista più grande mostra una delle 40 unità microfluidiche. (b) Ogni unità microfluidica è posizionata sotto 9 pozzi con 3 pozzi di insegliazione e 3 pozzi di uscita. I canali microfluidici sono separati da creste (‘phaseguides’), che consentono la modellazione di idrogel nel canale centrale (‘canale gel’) mentre c’è ancora contatto con i canali adiacenti (‘canali di perfusione’). (c) Metodo per la coltura di un microvaso perfuso all’interno del dispositivo microfluidico, che viene utilizzato per studiare il gradiente guidato angiogenico spuntando attraverso una matrice di collagene-1 modellato. (d) Cronologia per lo studio della germogliazione angiogenica e/o dell’anastomosi. Questa cifra è stata modificata da van Duinen etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: Procedure di caricamento per gel e media. (a) Esempi di deposizione di gel corretta e errata. L’archiviazione corretta si traduce in un gel di collagene-1 modellato nel canale centrale, che viene successivamente polimerizzato. (b) Esempi di riempimento corretto e non corretto dei pozzi. I pozzi vengono riempiti nell’ordine di 1/4 per evitare l’intrappolamento delle bolle d’aria all’interno dei canali microfluidici. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: Flusso a pressione idrostatica continua e stabilizzazione del gradiente. (a) Le differenze di pressione idrostatica tra i pozzi provocano livellamento passivo e flusso all’interno dei canali microfluidici. (b) Collocare il dispositivo su una piattaforma rocker impostata a 7 e 8 min ciclo si traduce in una perfusione continua e bidirezionale all’interno dei canali microfluidici. (c) I gradienti si formano introducendo due diverse concentrazioni all’interno dei pozzi, che vengono continuamente rinfrescate mediante livellamento passivo. (d) Visualizzazione gradiente con fluoresceinisociocianato (FITC)-dextran. Il flusso bidirezionale stabilizza il gradiente fino a 3 giorni. Barra della scala: 200 m. Questa cifra è stata modificata da van Duinen etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4: Metodo di pompaggio passivo per la semina cellulare. (a) Il pompaggio passivo è guidato da differenze di pressione causate da differenze di tensione superficiale. Ciò si traduce in un flusso dalla goccia (alta pressione interna) verso il serbatoio (bassa pressione interna). (b) Intervallo di tempo di una goccia (contorno grigio) che viene posizionata sopra l’ingresso (contorno bianco) del canale microfluidico (contorno blu). Subito dopo l’addizione (Figura 4b, i), la goccia sulla parte superiore dell’imlettinca si restringe (Figura 4b, ii: 1 s dopo l’aggiunta; iv: 2 s dopo l’aggiunta), che si traduce in un flusso verso l’uscita. Questo continua fino a quando il menisco gocciolina è appuntato dall’inserizione (Figura 4b, iv). Barra di scala – 400 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5: Robusto germoglio 3D di micronavi iPSC-EC. (a) Sprouting di iPSC-EC nel tempo. Le microvessels sono state coltivate per 48 h (a destra) e poi stimolate con un cocktail angiogenico contenente 50 ng/mL VEGF, 500 nM S1P e 2 pMA ng/mL. Le prime cellule di punta che invadono lo scaffold di collagene-1 (al centro) sono visibili 24 h dopo l’esposizione. I primi lumen sono visibili (frecce) 48 h dopo l’esposizione (a destra) mentre le celle di punta sono migrate ulteriormente nella direzione del gradiente. (b) Matrice di 15 microvessels che sono stati stimolati con VEGF, S1P e PMA per 2 giorni e macchiati per F-actin (giallo) e nuclei (blu). Barra di scala – 200 m. (c) Micronave stimolato (controllo positivo). (d) Micronave non stimolato (controllo negativo). (e) La proiezione massima di un singolo capillare all’interno del gel. (f) Uguale a (g) ma focalizzato sul centro. La linea punteggiata indica la posizione della vista ortogonale nel pannello g. Barre di scala (a-d: 200 m; e-g: 20 m). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 6: Visualizzazione della permeabilità del germoglio angiogenico prima e dopo l’anastomosi. (a) Anastomosi con trigger di canale basale e maturazione dei germogli angiogenici. Primo piano del letto capillare a 2, 4, 6 e 7 giorni dopo la stimolazione con fattori di crescita angiogenici. (b) Germogli angiogenici dopo 2 giorni dopo l’aggiunta di fattori di crescita angiogenici. I germogli angiogenici si formano all’interno del gel, ma non sono ancora collegati al canale di perfusione inferiore. (c) Perfusione del micronave con soluzione 0,5 mg/mL albumin-Alexa 555. Immagini fluorescenti ottenute a 0 e 10 min. (d,e) Come nei pannelli b e c, ma dopo 7 giorni di stimolazione. I germogli sono collegati all’altro lato e formano un microrecipient confluente nel canale di perfusione basale. Barre di scala : 100 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Problema Causa Soluzione Il collagene 1 non entra o riempie completamente il canale La goccia di collagene-1 non è posizionata sopra l’inseridio Posizionare con attenzione la goccia sulla parte superiore dell’ingresso dal canale gel Il volume di collagene 1 è troppo basso Utilizzare 1,5 l del gel per riempire completamente il canale Il collagene 1 è troppo viscoso Utilizzare un altro lotto di collagene-1 Il collagene-1 fluisce nei canali di perfusione Il collagene-1 viene convogliato direttamente nell’inserimento del canale gel Posizionare con attenzione la goccia sulla parte superiore dell’ingresso dal canale gel Il collagene-1 non è la formazione chiara/fibra Il collagene 1 non viene conservato correttamente Conservare il collagene-1 a 4 gradi centigradi, non congelare NaHCO3 e HEPES non si mescolano bene prima di aggiungere collagene-1 Mescolare con attenzione il NaHCO3 e HEPES pipettando prima di aggiungere il collagene-1 Goccia non si riduce utilizzando il metodo di pompaggio passivo Gocciolina aderisce al lato del pozzo Gocciolina aspirata e aggiungere una nuova goccia sulla parte superiore dell’inseridio Assicurarsi che il pozzo di uscita sia riempito con almeno 20 Non si osserva alcun germoglio I fattori di crescita non vengono aggiunti o gli aliquot non vengono memorizzati correttamente Preparare un nuovo mezzo angiogenico Blocchi d’aria perfusione / formazione di gradiente Rimuovere le bolle d’aria utilizzando una pipetta P20 o P200 Differenze di volume tra i pozzi I volumi in tutti i pozzi devono essere uguali per formare un gradiente lineare Celle non vitali Piastra non posizionata sulla piattaforma rocker/piattaforma rocker spenta Assicurarsi che la piattaforma rocker sia attiva e che abbia il giusto tempo/angolo di ciclo (8 min/7o) Nessuna perfusione possibile a causa della presenza di bolle d’aria Rimuovere le bolle d’aria utilizzando una pipetta P20 o P200 Non si formano lumamen, le cellule migrano come singole cellule La miscela di germogli angiogenica è stata aggiunta prima della formazione di un monostrato Attendere altri 24 h prima di aggiungere i fattori di crescita angiogenici Principali variazioni nella densità di germogli Differenze nella densità delle cellule dopo la semina Controllare se la densità cellulare è omogenea e comparabile tra unità microfluidiche. Se necessario, aggiungere un’altra goccia di sospensione cellulare Tabella 1: Risoluzione degli errori comuni.

Discussion

Questo metodo descrive la coltura di 40 microvessels endoteliali perfutilizzabili all’interno di una piattaforma di coltura cellulare microfluidica robusta e scalabile. Rispetto ai tradizionali metodi di coltura cellulare 2D e 3D, questo metodo mostra come un microambiente cellulare fisiologico rilevante che include gradienti e perfusione continua può essere combinato con la coltura cellulare 3D con una velocità effettiva adeguata per lo screening Scopi.

Uno dei principali vantaggi rispetto ai saggi microfluidici comparabili è che questo metodo non si basa sulle pompe per la perfusione, ma utilizza una piattaforma rocker per indurre simultaneamente una perfusione continua in tutte le unità microfluidiche. Questo assicura che il saggio sia robusto e scalabile: le piastre possono essere impilate su una piattaforma rocker. È importante sottolineare che tutte le unità microfluidiche rimangono indirizzabili individualmente, il che consente di implementare questo metodo all’interno dello screening farmacologico, compresa la generazione di una curva dose-risposta. Inoltre, senza una pompa, l’imaging e la sostituzione media sono molto più semplici con meno rischio di contaminazione (incrociata).

Un altro vantaggio di questo metodo è l’uso di una piattaforma standardizzata pre-fabbricata, mentre piattaforme di coltura cellulare microfluidica comparabili devono essere fabbricate dagli utenti finali. Questa disponibilità facilita l’adozione di questo saggio tra gli altri gruppi di ricerca accademica e farmaceutica, portando alla standardizzazione. Inoltre, a differenza dei prototipi microfluidici, l’interfaccia a piastre 384 assicura la compatibilità con le attuali apparecchiature di laboratorio (ad esempio, aspiratori, gestori di lastre e pipette multicanale), facilitando l’integrazione all’interno dell’attuale infrastruttura di screening .

Ci sono diversi passaggi critici nell’esecuzione di questo saggio. Il gel di collagene 1 dovrebbe riempire completamente il canale gel. Durante il caricamento del gel, questo riempimento può essere osservato ispezionando i canali microfluidici attraverso la finestra di osservazione (Figura 2a) o capovolgendo la piastra a testa in giù (come mostrato nella Figura 1a). Durante il riempimento, il gel di collagene deve rimanere nel canale centrale, senza scorrere nei canali di perfusione adiacenti. Abbiamo notato che la qualità del gel di collagene-1 è fondamentale per una corretta performance di analisi. I lotti di collagene-1 con viscosità troppo elevata porteranno a un riempimento incompleto del canale di gel. Dopo 10 min di polimerizzazione a 37 gradi centigradi, il gel deve essere omogeneo e limpido. Se il collagene-1 non viene conservato correttamente (ad esempio, a causa delle temperature fluttuanti in frigorifero), il collagene polimerizzerà all’interno dei canali con una formazione di fibre chiaramente visibili. Ciò può comportare l’invasione dei EC nel gel senza l’aggiunta di fattori angiogenici, ma senza un adeguato sviluppo del lume.

Quando le cellule sono semiate, la soluzione di rivestimento della fibronectina viene rimossa dai pozzi, lasciando solo i canali microfluidici pieni di soluzione di rivestimento. L’aspirazione della soluzione di rivestimento da canali microfluidici potrebbe causare interruzioni del gel o aspirazione al gel. La sospensione cellulare deve sostituire / sostituire questa soluzione di rivestimento. Questo funziona meglio quando la sospensione cellulare viene semidata utilizzando il metodo di pompaggio passivo, in quanto direttamente il pipetting della sospensione cellulare nei canali mostrano densità di semina meno riproducibili.

Poiché i microvasi formano un monoteman stabile contro il gel, queste piccole differenze si traducono solo in tempi diversi necessari per raggiungere la confluenza. Così, il punto di inizio del saggio è determinato dalla confluenza piuttosto che dal tempo della cultura. Se necessario, il tempo di coltura può essere esteso fino a quando non si è formato un chiaro monostrato contro il gel.

All’interno dei pozzi, bolle d’aria possono essere intrappolati da riempimento errato dei pozzi (vedi figura 2b). Queste bolle d’aria limiteranno il flusso di mezzo, anche quando il dispositivo è posizionato su una piattaforma rocker, e si tradurrà in collasso del microrecipient e formazione di gradiente improprio. Premendo la punta della pipetta contro la parete laterale dei pozzeri aumenterà il successo di riempire completamente il pozzo. Se una bolla d’aria è intrappolata all’interno dei pozzi, può essere rimossa inserendo delicatamente una punta sterile pipetta nel fondo di vetro. Le bolle d’aria possono verificarsi anche all’interno dei canali microfluidici. Quando il mezzo è stato rimosso dai pozzetti, l’evaporazione del mezzo è evidente dai canali microfluidici dopo 30 min (a causa dei volumi di microlilitri all’interno dei canali). Pertanto, le modifiche medie vengono preferibilmente eseguite il più velocemente possibile. Quando il mezzo viene aggiunto in un canale con mezzo evaporato, le bolle d’aria saranno intrappolate all’interno dei canali microfluidici. Queste bolle d’aria all’interno dei canali microfluidici possono essere rimosse manualmente posizionando una pipetta P20 direttamente sull’inserile o sulla presa e forzando il mezzo attraverso la microfluidica dal pozzo opposto. La rimozione di successo delle bolle d’aria si traduce in una piccola ma evidente diminuzione del volume nell’altro pozzo. Nella tabella 1 sono elencati gli errori comuni e le modalità di risoluzione dei problemi.

La mancanza di una pompa è una limitazione quando è necessaria l’imaging continuo, in quanto la piattaforma rocker limita l’utente all’immagine a intervalli di tempo sequenziali. Inoltre, la perfusione di mezzo in questa piattaforma consiste in un flusso bidirezionale con bassi livelli di sollecitazione di taglio, mentre la vascolatura in vivo è esposta a un flusso unidirezionale con livelli più elevati di stress da taglio. Anche se non osserviamo gli effetti negativi del flusso bidirezionale per quanto riguarda la germogliazione angiogenica, il flusso è un importante stimolo biomeccanico e preferibilmente controllato. Tuttavia, mentre ci sono configurazioni di pompa disponibili in commercio, interfacciandosi con la piastra 384-well rimane impegnativo e configurazioni di pompa grave ostacolano la scalabilità di questo saggio.

La possibilità di utilizzare iPSC-EC per studiare la germogliazione angiogenica apre nuove opportunità nella modellazione delle malattie e nella ricerca sui farmaci. A differenza degli EC primari, queste cellule possono essere generate in quantità quasi illimitate con un genotipo stabile e utilizzando tecniche di editing del genoma, possono essere generate cellule che includono knockout genici e knock-in. Tuttavia, poiché i protocolli per differenziare le EC da iPSC sono relativamente nuovi, non è ancora chiaro cosa porti agli iPSC-EC che riflettono meglio le EC primarie e quali sottotipi di EC sono o possono essere generati. Inoltre, ci sono ancora domande riguardanti la loro rilevanza. Ad esempio, gli iPSC-EC presentano ancora la plasticità tipica delle cellule endoteliali? E in che misura le cellule derivate da iPSC rispondono e interagiscono con il loro microambiente cellulare? La piattaforma standardizzata qui presentata potrebbe essere utilizzata per rispondere ad alcune di queste domande al fine di convalidare ulteriormente l’utilizzo di EC derivati da iPSC in vitro.

La direzione futura più diretta per questo saggio sarà l’integrazione di altri tipi di cellule che svolgono un ruolo importante durante l’angiogenesi, come periciti e macrofagi. Questo faciliterà la capacità di studiare il ruolo dei macrofagi durante l’anastomosi tra germogli o l’aderenza dei periciti dopo la formazione capillare. Inoltre, è possibile coltura vari altri tipi di cellule all’interno o contro una matrice extracellulare (ad esempio, abbiamo mostrato la coltura di neuroni e varie strutture epiteliali come tubuli prossimali e intestini piccoli), che possono essere combinati con il vascolare letti generati con questo metodo. Infine, sarà interessante studiare la germogliazione angiogenica negli idrogel sintetici, poiché la loro composizione definita aumenta ulteriormente la standardizzazione del saggio e consente di accordarsi di rigidità e motivi di legame che influenzano le interazioni cella-matrice.

In conclusione, questo metodo mostra la fattibilità delle EC derivate da iPSC in un saggio angiogenico 3D standardizzato e scalabile che combina condizioni di coltura fisiologiche rilevanti in una piattaforma che ha la robustezza e la scalabilità necessarie da integrare all’interno l’infrastruttura di screening dei farmaci.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è in parte sostenuto da una sovvenzione di ricerca del programma “Meer Kennis met Minder Dieren” (progetto numero 114022501) dell’Organizzazione olandese per la ricerca e lo sviluppo sanitario e della sovvenzione del consorzio CVON della Dutch Heart Foundation Ricollegare.

Materials

0.2-10 μL Electronic repeater pipette Sigma Z654566-1EA
1 M HEPES Gibco 15630-056
3-lane OrganoPlate Mimetas 4003-400B
4% PFA in PBS Alfa Aesar J61899
Basal culture medium NCardia
Collagen-1 Cultrex 3447-020-01
Combitips Advanced Biopur 2.5 mL VWR 613-2071
dPBS Gibco 14190-094
Eppendorf Repeater M4 pieptte VWR 613-2890
Fibronectin Sigma-Aldrich F4759-1MG 1 mg/mL in milliQ water
HBSS Gibco 14025-050
Hoechst Molecular Probes H3569 10 mg/mL solution in water
iPSC-derived endothelial cells NCardia
NaHCO3 Sigma S5761 37 g/L in milliQ water
OrganoPlate Perfusion Rocker Mini Mimetas Rocker platform used to provide flow
Pen/Strep Sigma P4333
Phalloidin Sigma P1951 1 mg/mL in DMSO
PMA Focus-Biomolecules 10-2165 2 μg/mL in PBS containing 0.1% DMSO
S1P Ecehelon Biosciences S-2000 1 mM in methanol containing 1% acetic acid
TRITC-albumin Invitrogen A34786
VEGF Peprotech 450-32-10 50 μg/mL in water containing 0.1% BSA
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van Duinen, V., Stam, W., Borgdorff, V., Reijerkerk, A., Orlova, V., Vulto, P., Hankemeier, T., van Zonneveld, A. J. Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro. J. Vis. Exp. (153), e59678, doi:10.3791/59678 (2019).
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