שיטת הלימוד הסטנדרטית והמדמדית למחקר בלבלוב אנגיוגנטית בתלת-ממד של התאים הנגזרים מתוך מבחנה
Summary
שיטה זו מתארת את התרבות של תאים מבוססי iPSC-נגזרות כמו 40 מיקרוכלי תלת-ממד של מיקרו בפלטפורמת microfluאידיג מתוקננת. פלטפורמה זו מאפשרת לימוד של לבלוב אנגיוגנטית מונחה הדרגתי ב-3D, כולל השקה וייצוב של נבטי האנגיוגנטי באופן מדרגי ותפוקה גבוהה.
Abstract
מחקר התרופות הפרה-קליני של מחלות כלי הדם דורש במודלים של ואצלב שamendable להקרנה בתפוקה גבוהה. עם זאת, במודלים מסוימים של הקרנת מבחנה שאין להם תפוקה מספיקה יש להם רלוונטיות פיזיולוגית מוגבלת, המעכבת את תרגום הממצאים מחוץ לvivo. מצד שני, פלטפורמות תרבות התאים המיקרופלואידיc הראו רלוונטיות פיזיולוגית שאין כמוה במבחנה, אך לעתים קרובות חסרה התפוקה, המדרגיות והסטנדרטיזציה הנדרשים. אנו מדגימים פלטפורמה איתנה לחקר אנגיוגנזה של תאי האנדותל שנגזר מתאי גזע המושרה על ידי האדם (ipsc-ecs) בסביבה פיסיולוגית תאית רלוונטית, כולל זלוף ומעברי צבע. IPSC-ECs הם מתורבתים כמו 40 המכונה 3D מיקרוכלי מיקרו נגד הגרדום קולגן-1. עם יישום של הדרגתי של גורמים אנגיוגנטיים, הסימנים החשובים של אנגיוגנזה ניתן ללמוד, כולל הבידול לתוך תא קצה וקנה והיווצרות של לומן מבשם. Perfusion עם צבע מעקב פלורסנט מאפשר ללמוד חדירות במהלך ואחרי ההשקה של נבטי אנגיוגנטית. לסיכום, שיטה זו מציגה את הכדאיות של ECs-הנגזרים מתוך מתקן מתוקננת ומדרגי תלת-ממדי, המשלב את תנאי התרבות הרלוונטיים הפיסיולוגיים בפלטפורמה בעלת החוסן והמדרגיות הנדרשים שישולבו בתוך תשתית סינון הסמים.
Introduction
במודלים של חוץ גופית ממלאים תפקיד בסיסי בגילוי ובתיקוף של מטרות סמים חדשות של מחלות כלי דם. עם זאת, במודלים מסוימים של הקרנת מבחנה שלהם יש תפוקה מספקת יש רלוונטיות פיזיולוגית מוגבלת1, המעכבת את תרגום הממצאים מחוץ לvivo. כך, כדי לקדם קליני מראש מחקר התרופות כלי דם, שיפור במודלים החוץ-גופית של יום יש צורך לשלב הקרנת תפוקה גבוהה עם מיקרו-הסביבה הרלוונטית הסלולר 3d.
במהלך העשור האחרון, נעשה התקדמות משמעותית כדי להגביר את הרלוונטיות הפיזיולוגית של מודלים מתחום החוץ של הvasקולטורה. במקום תאים אנדותל שטוח על משטחים שטוחים כגון פלסטיק רקמות הרקמה, תאים אנדותל יכול להיות מוטבע בתוך מקפלים תלת-ממד, כגון פיברוב ו ג’ל קולגן2. בתוך מטריצות אלה, התאים האנדותל להראות פנוטיפ רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית הקשורים השפלה מטריקס היווצרות לומן. עם זאת, מודלים אלה מדגימים רק קבוצת משנה של התהליכים הרבים המתרחשים במהלך לבלוב האנגיוגנטי כמו רמזים חשובים מהסביבה הסלולרית עדיין חסרים.
פלטפורמות התרבות התא מיקרופלואידיג מתאימים באופן ייחודי כדי להגדיל עוד יותר את הרלוונטיות הפיזיולוגית של מודלים של מבחנה של ואסילטטורה. לדוגמה, ניתן לחשוף את תאי האנדותל למתח הטיה, שהוא גירוי ביומכאני חשוב עבור ואסילטורה. גם, את האפשרות מרחב שליטה נוזלים בתוך מיקרופלואידיקה מאפשר היווצרות של מעברי צבע ביוקולריות3,4,5,6. מעברי צבע כאלה ממלאים תפקיד חשוב בvivo במהלך היווצרות והתהוות במהלך האנגיוגנזה. עם זאת, בעוד מיקרופלואידיג תא התרבות פלטפורמות הראו רלוונטיות פיזיולוגית ללא תחרות על המסורתי 2D ו-3D שיטות תרבות התא, הם לעתים קרובות חסר התפוקה הנדרשת, המדרגיות והתקינה הנדרשת עבור הקרנת סמים 7. גם, רבים של פלטפורמות אלה אינם זמינים מסחרית ודורשים את הקצה משתמשי למיקרו המכשירים שלהם לפני השימוש8. זה לא רק דורש מכשיר הייצור והידע הטכני, אלא גם מגביל את רמת בקרת איכות לרעה משפיע על התוכסות9.
עד היום, התאים הראשוניים של האדם הראשי נשארים מקור התאים הנפוץ ביותר למודל אנגיוגנזה בתוך מבחנה10. עם זאת, לתאים אנושיים ראשוניים יש מספר מגבלות המעכבו את היישום השגרתי בגישות ההקרנה. ראשית, קיימת אפשרות מוגבלת להגדיל ולהרחיב את התרבויות הראשיות הנגזרות תאים. כך, עבור ניסוי בקנה מידה גדול, קבוצות של תורמים שונים צריך להיות בשימוש, מה שגורם הבדלים גנומית ו אצווה-to-אצווה וריאציות. שנית, לאחר כמה קטעים, תאי האנדותל הראשוניים מאבדים בדרך כלל נכסים רלוונטיים כאשר הם מתורבתים בתוך מבחנה11,12.
תאים אנדותל שמקורם בתאי גזע המושרה על ידי האדם (iPSC) הם חלופה מבטיחה: הם דומים התאים הראשוניים, אבל עם גנוטיפ יציבה יותר כי הוא גם נוטה לעריכת הגנום מדויק. יתר על כן, iPSCs מסוגלים לחדש את עצמי ולכן ניתן להרחיב כמויות כמעט בלתי מוגבל, אשר להפוך את התאים הנגזרים iPSC חלופה אטרקטיבית תאים ראשוניים לשימוש בתוך מודלים מחוץ לתחום הסינון13.
כאן, אנו מתארים שיטה לתאי התרבות האנדותל ככלי תלת-ממד תלת-ממדי בפלטפורמת מיקרופלואידיc מתוקננת עם תפוקה גבוהה של תאים. Perfusion מוחל על ידי הצבת המכשיר על פלטפורמת נדנדה, אשר מבטיח פעולה חזקה ומגדיל את המדרגיות של התהליך. כאשר המיקרוכלים מנוצלים באופן רציף וחשופים למעבר של גורמי אנגיוגנטיים, לבלוב אנגיוגנטי מחקר בסביבה פיזיולוגית יותר של מיקרואקולוגיה סלולרית. בעוד הפרוטוקול תואם מקורות שונים של (הראשי) בתאי האנדותל14,15, התמקדנו בשימוש ב-ipsc האנושי-ecs הנגזר על מנת להגביר את הסטנדרטיזציה של השיטה ולהקל על שילובם בתוך מחקר של תרופות כלי דם.
Protocol
Representative Results
Discussion
שיטה זו מתארת את התרבות של 40 מיקרוסייבל המיקרו-כלי בתוך פלטפורמת תרבות תא מיקרופלואידיסי חזקה ומדרגית. לעומת שיטות התרבות 2D ו-3D המסורתית, שיטה זו מראה כיצד הסביבה הפיזיולוגית הרלוונטית הסלולר הכוללת מעברי צבע ופרזיה רציפה ניתן לשלב עם תרבות תא תלת-ממד עם תפוקה נאותה להקרנה מטרות.
אחד היתרונות העיקריים על פני מיקרופלואידיג המקבילה הוא כי שיטה זו אינה מסתמכת על משאבות עבור זלוף אבל משתמש פלטפורמת נדנדה כדי לגרום זלוף רציפה בכל יחידות microfluidic בו. הדבר מבטיח כי השיטת הפעולה איתנה ומדרגית: לוחיות הרישוי יכולות להיות מוערמות בפלטפורמת נדנדה. חשוב לעשות זאת, כל יחידות microflu, להישאר בנפרד למיעון, אשר מאפשר שיטה זו להיות מיושם בתוך הקרנת סמים כולל הדור של עקומת תגובה מינון. יתר על כן, ללא משאבה, הדמיה החלפת בינונית הוא הרבה יותר פשוט עם פחות סיכון (cross)-זיהום.
יתרון נוסף של שיטה זו הוא שימוש של פלטפורמה סטנדרטית, מיוצר מראש, בעוד מיקרופלואידיג תאים המקבילה פלטפורמות התרבות צריך להיות מפוברק על ידי משתמשי הקצה. זמינות זו מקלה על אימוץ העניין בקרב קבוצות המחקר האקדמיות והפרמצבטיות האחרות, המובילות לסטנדרטיזציה. כמו כן, בניגוד מיקרו-טיפוס מיקרופלואידים, ממשק הצלחת 384-באר מבטיח תאימות עם ציוד המעבדה הנוכחי (למשל, משמרים, מטפלים בצלחות ו פיפטות רב-ערוצי), הקלה על האינטגרציה בתוך תשתית ההקרנה הנוכחית .
קיימים מספר שלבים קריטיים בביצוע הפעולה. ג’ל קולגן-1 צריך למלא לחלוטין את ערוץ ג’ל. במהלך טעינת ג’ל, ניתן לצפות במילוי זה על-ידי בדיקת הערוצים המיקרופלואידים דרך חלון התצפית (איור 2a) או על-ידי היפוך הצלחת הפוך (כפי שמוצג באיור 1a). בזמן המילוי, ג’ל הקולגן צריך להישאר במרכז הערוץ, מבלי לזרום לתוך ערוצי זלוף סמוכים. שמנו לב כי איכות ה-קולגן-1 ג’ל היא חיונית לביצוע הביצועים הנכונים. קולגן-1 אצוות עם צמיגות גבוהה מדי יוביל למילוי לא שלם של הערוץ ג’ל. לאחר 10 דקות של פולימוניזציה ב-37 ° c, הג צריך להיות הומוגנית וברור. אם קולגן -1 לא מאוחסן כראוי (למשל, עקב הטמפרטורות לתנודות במקרר), קולגן יהיה לפולימו בתוך הערוצים עם היווצרות סיבים גלויים בבירור. זה יכול לגרום לפלישה של ECs לתוך הג ללא תוספת של גורמים אנגיוגנטיים, אך ללא התפתחות נאותה לומן.
כאשר התאים הם נזרע, הפתרון ציפוי fibronectin מוסר מן הבארות, משאיר רק את ערוצי microflu, מלאים בפתרון ציפוי. שאיפה של פתרון ציפוי מצינורות microflu, יכול לגרום הפרעה ג’ל או שאיפה ג’ל. ההשעיה התא צריך להחליף/להחליפו זה פתרון ציפוי. זה עובד בצורה הטובה ביותר כאשר ההשעיה התא הוא נזרע באמצעות שיטת שאיבה פסיבית, כמו באופן ישיר ללטף את ההשעיה התא לתוך הערוצים להראות צפיפות הזריעה פחות.
כאשר המיקרוכלים יוצרים מונאולייר יציב כנגד הג, הבדלים קטנים אלה מהווים בזמנים שונים הדרושים לצורך הגעה לשטף. לפיכך, נקודת ההתחלה של הקביעה נקבעת בשטף ולא בזמן התרבות. במידת הצורך, ניתן להאריך את זמן התפירה עד שמונאולייר ברור נוצר כנגד הג.
בתוך הבארות, בועות אוויר יכול להיות לכוד על ידי מילוי שגוי של הבארות (ראה איור 2b). אלה בועות אוויר יהיה להגביל את זרימת המדיום, גם כאשר המכשיר ממוקם על פלטפורמת נדנדה, וכתוצאה מכך קריסה של מיקרוכלי מעבר הדרגתי היווצרות המעבר. לחיצה על עצת הפיפטה כנגד הקיר הצדדי של הבארות תגדיל את ההצלחה של מילוי מלא של הבאר. אם בועת אוויר לכודה בתוך הבארות, זה יכול להיות מוסר על ידי החדרת בעדינות קצה הצנרת סטרילי לתחתית הזכוכית. בועות אוויר יכולות להתרחש גם בתוך הערוצים microfluidic. כאשר המדיום הוסר מן הבארות, אידוי של בינוני מורגש מתוך הערוצים microflu, לאחר 30 דקות (עקב כרכים מיקרוליטר בתוך הערוצים). לפיכך, שינויים בינוניים רצוי לבצע במהירות האפשרית. כאשר המדיום מתווסף בערוץ עם בינוני התאדה, בועות האוויר יהיה לכוד בתוך ערוצי microfluidic. אלה בועות אוויר בתוך הערוצים microflu, ניתן להסיר באופן ידני על ידי הצבת מP20 הצינורות ישירות על מפרץ או לשקע ולאלץ בינוני דרך microfluidic מתוך הבאר הפוכה. הסרה מוצלחת של בועות האוויר מביא לירידה קטנה אך ניכרת בנפח הטוב האחר. טבלה 1 מפרטת שגיאות נפוצות וכיצד לפתור אותן.
חוסר משאבה היא מגבלה כאשר הדמיה רציפה נדרשת, כמו פלטפורמת הנדנדה מגביל את המשתמש לתמונה במרווחי זמן רציפים. יתרה מזאת, הפרזיה של המדיום בפלטפורמה זו מורכבת מזרימה דו-כיוונית עם רמות נמוכות של מתח הטיה, ואילו יום נחשף לזרימה חד כיוונית עם רמות גבוהות יותר של מתח הטיה. בעוד אנו לא מתבוננים בהשפעות שליליות של הזרימה הדו-כיוונית ביחס לליבלוב האנגיוגנטית, הזרימה היא גירוי ביומכאני חשוב ורצוי לשליטה. עם זאת, בעוד יש כיוונוני משאבה זמינים מסחרית, ממשק עם צלחת 384-באר נשאר מאתגרת והגדרות המשאבה לעכב באופן חמור את המדרגיות של שיטת הפעולה.
האפשרות להשתמש iPSC-ECs ללמוד לבלוב אנגיוגנטית פותח הזדמנויות חדשות במידול מחלות ומחקר הסמים. בניגוד ECs הראשי, תאים אלה יכולים להיווצר כמויות כמעט ללא גבולות עם גנוטיפ יציבה, על ידי שימוש בטכניקות עריכת הגנום, התאים ניתן ליצור כי כולל הסתרה גן ו טוק-ins. עם זאת, כמו הפרוטוקולים להבדיל ECs מ-iPSC הם חדשים יחסית, זה עדיין לא ברור מה מוביל iPSC-ECs כי הטוב ביותר לשקף ECs הראשי ואילו תתי-משנה של EC או ניתן ליצור. בנוסף, עדיין נותרו שאלות לגבי הרלוונטיות שלהם. לדוגמה, האם ה-iPSC-ECs עדיין מפגין את הפלסטיות האופייני לתאי האנדותל? ולאיזו מידה התאים הנגזרים מגיבים ופועלים עם המיקרו-סביבה הסלולרית שלהם? הפלטפורמה הסטנדרטית המוצגת כאן יכולה לשמש כדי לענות על כמה מהשאלות הללו כדי לאמת עוד יותר את השימוש של ECs-הנגזרים מתוך מבחנה.
הכיוון העתידי הישיר ביותר לצורך מעשה זה יהיה שילוב של סוגי תאים אחרים המשחקים תפקיד חשוב במהלך אנגיוגנזה, כגון קרום הלב ומקרופאגים. זה יקל על היכולת ללמוד את התפקיד של מקרופאגים בזמן ההשקה בין נבטים או הדבקות של קרום הלב לאחר היווצרות נימי. כמו כן, ניתן לתרבות סוגים שונים של תאים אחרים בתוך או נגד מטריצה המומנת (למשל, הראינו את התרבות של הנוירונים ומבנים אפיתל שונים כגון tubules האבוליים ומעיים קטנים), אשר ניתן לשלב עם כלי הדם מיטות שנוצרות באמצעות שיטה זו. לבסוף, יהיה זה מעניין ללמוד לבלוב אנגיוגנטי בהידרוגים סינתטיים, כיוון שהרכב המוגדר שלהם מגדיל עוד יותר את התקינה של המבנה ומאפשר כוונון נוקשות ומניעים מחייבים המשפיעים על אינטראקציות מטריצות של תאים.
לסיכום, שיטה זו מציגה את הכדאיות של ECs-הנגזרים מתוך מתקן מתוקננת ומדרגי תלת-ממדי, המשלב את תנאי התרבות הרלוונטיים הפיסיולוגיים בפלטפורמה בעלת החוסן והמדרגיות הנדרשים שישולבו בתוך תשתית סינון הסמים.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
העבודה הזאת היא חלק נתמך על ידי מענק מחקר של התוכנית של מאגר מצליח של “Meer Kennis” (פרויקט מספר 114022501) של ארגון הולנד לחקר ופיתוח בריאות (ZonMw) וקרן הלב ההולנדית הקונסורציום CVON חבר.
Materials
| 0.2-10 μL Electronic repeater pipette | Sigma | Z654566-1EA | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-056 | |
| 3-lane OrganoPlate | Mimetas | 4003-400B | |
| 4% PFA in PBS | Alfa Aesar | J61899 | |
| Basal culture medium | NCardia | ||
| Collagen-1 | Cultrex | 3447-020-01 | |
| Combitips Advanced Biopur 2.5 mL | VWR | 613-2071 | |
| dPBS | Gibco | 14190-094 | |
| Eppendorf Repeater M4 pieptte | VWR | 613-2890 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F4759-1MG | 1 mg/mL in milliQ water |
| HBSS | Gibco | 14025-050 | |
| Hoechst | Molecular Probes | H3569 | 10 mg/mL solution in water |
| iPSC-derived endothelial cells | NCardia | ||
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | 37 g/L in milliQ water |
| OrganoPlate Perfusion Rocker Mini | Mimetas | Rocker platform used to provide flow | |
| Pen/Strep | Sigma | P4333 | |
| Phalloidin | Sigma | P1951 | 1 mg/mL in DMSO |
| PMA | Focus-Biomolecules | 10-2165 | 2 μg/mL in PBS containing 0.1% DMSO |
| S1P | Ecehelon Biosciences | S-2000 | 1 mM in methanol containing 1% acetic acid |
| TRITC-albumin | Invitrogen | A34786 | |
| VEGF | Peprotech | 450-32-10 | 50 μg/mL in water containing 0.1% BSA |
References
- Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).
- Davis, G. E., et al. Control of vascular tube morphogenesis and maturation in 3D extracellular matrices by endothelial cells and pericytes. Methods in Molecular Biology. , 17-28 (2013).
- Kim, S., Chung, M., Jeon, N. L. Three-dimensional biomimetic model to reconstitute sprouting lymphangiogenesis in vitro. Biomaterials. 78, 115-128 (2016).
- Kim, C., Kasuya, J., Jeon, J., Chung, S., Kamm, R. D. A quantitative microfluidic angiogenesis screen for studying anti-angiogenic therapeutic drugs. Lab Chip. 15 (1), 301-310 (2015).
- Kim, J., et al. Engineering of a Biomimetic Pericyte-Covered 3D Microvascular Network. PLoS One. 10 (7), e0133880 (2015).
- Tourovskaia, A., Fauver, M., Kramer, G., Simonson, S., Neumann, T. Tissue-engineered microenvironment systems for modeling human vasculature. Experimental biology and medicine. 239 (9), 1264-1271 (2014).
- Junaid, A., Mashaghi, A., Hankemeier, T., Vulto, P. An end-user perspective on Organ-on-a-Chip: Assays and usability aspects. Current Opinion in Biomedical Engineering. 1, 15-22 (2017).
- Pagano, G., et al. Optimizing design and fabrication of microfluidic devices for cell cultures: An effective approach to control cell microenvironment in three dimensions. Biomicrofluidics. 8 (4), 046503 (2014).
- Berthier, E., Young, E. W., Beebe, D. Engineers are from PDMS-land, Biologists are from Polystyrenia. Lab Chip. 12 (7), 1224-1237 (2012).
- Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425 (2018).
- Dejana, E., Hirschi, K. K., Simons, M. The molecular basis of endothelial cell plasticity. Nature Communications. 8, 14361 (2017).
- Geraghty, R. J., et al. Guidelines for the use of cell lines in biomedical research. British Journal of Cancer. 111 (6), 1021-1046 (2014).
- Passier, R., Orlova, V., Mummery, C. Complex Tissue and Disease Modeling using hiPSCs. Cell Stem Cell. 18 (3), 309-321 (2016).
- van Duinen, V., et al. Perfused 3D angiogenic sprouting in a high-throughput in vitro platform. Angiogenesis. 22 (1), 157-165 (2019).
- Wevers, N. R., et al. A perfused human blood-brain barrier on-a-chip for high-throughput assessment of barrier function and antibody transport. Fluids Barriers CNS. 15 (1), 23 (2018).
