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Bioengineering

Standardisierter und skalierbarer Assay zur Untersuchung perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

Published: November 06, 2019
doi:
10.3791/59678
, , , , , , ,
1Department of Internal Medicine (Nephrology) and the Einthoven Laboratory for Vascular and Regenerative Medicine,Leiden University Medical Center, 2Division of Systems Biomedicine and Pharmacology, Department of Analytical BioSciences and Metabolomics,Leiden University, 3Ncardia, 4Department of Anatomy and Embryology,Leiden University Medical Center, 5Mimetas

Summary

Diese Methode beschreibt die Kultur von iPSC-abgeleiteten Endothelzellen als 40 durchfundierte 3D-Mikrogefäße in einer standardisierten mikrofluidischen Plattform. Diese Plattform ermöglicht die Untersuchung von gradientengetriebenen angiogenen Keimen in 3D, einschließlich Anastomose und Stabilisierung der angiogenen Sprossen in einer skalierbaren und hochdurchsatzigen Weise.

Abstract

Die präklinische Arzneimittelforschung von Gefäßerkrankungen erfordert In-vitro-Modelle der Vaskulatur, die für ein Screening mit hohem Durchsatz geändert werden können. Aktuelle In-vitro-Screening-Modelle mit ausreichendem Durchsatz haben jedoch nur eine begrenzte physiologische Relevanz, was die Übersetzung von Befunden von in vitro nach in vivo behindert. Auf der anderen Seite haben mikrofluidische Zellkulturplattformen eine beispiellose physiologische Relevanz in vitro gezeigt, aber oft fehlt der erforderliche Durchsatz, Skalierbarkeit und Standardisierung. Wir zeigen eine robuste Plattform zur Untersuchung der Angiogenese von Endothelzellen, die aus humaninduzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC-ECs) in einer physiologisch relevanten zellulären Mikroumgebung abgeleitet wurden, einschließlich Perfusion und Gradienten. Die iPSC-ECs werden als 40 perfused 3D Mikrogefäße gegen ein gemustertes Kollagen-1-Gerüst kultiviert. Bei Anwendung eines Gradienten angiogener Faktoren können wichtige Merkmale der Angiogenese untersucht werden, einschließlich der Differenzierung in Spitzen- und Stielzellen und der Bildung von perfusableem Lumen. Die Perfusion mit fluoreszierenden Tracerfarbstoffen ermöglicht die Untersuchung der Permeabilität während und nach der Anastomose der angiogenen Sprossen. Zusammenfassend zeigt diese Methode die Machbarkeit von iPSC-abgeleiteten ECs in einem standardisierten und skalierbaren 3D-Angiogen-Assay, der physiologisch relevante Kulturbedingungen in einer Plattform kombiniert, die die erforderliche Robustheit und Skalierbarkeit hat, die in Drogen-Screening-Infrastruktur.

Introduction

In-vitro-Modelle spielen eine grundlegende Rolle bei der Entdeckung und Validierung neuer Wirkstoffziele von Gefäßerkrankungen. Aktuelle In-vitro-Screening-Modelle mit ausreichendem Durchsatz haben jedoch nur eine begrenzte physiologische Relevanz1, was die Übersetzung von Befunden von in vitro nach in vivo behindert. Um die präklinische Gefäßarzneimittelforschung voranzutreiben, sind daher verbesserte In-vitro-Modelle der Vaskulatur notwendig, die ein Hochdurchsatz-Screening mit einer physiologisch relevanten zellulären 3D-Mikroumgebung kombinieren.

Innerhalb des letzten Jahrzehnts wurden erhebliche Fortschritte erzielt, um die physiologische Relevanz von In-vitro-Modellen der Vaskulatur zu erhöhen. Anstatt Endothelzellen auf flachen Oberflächen wie Gewebekulturkunststoffen zu kultivieren, können Endothelzellen in 3D-Gerüste wie Fibrin- und Kollagengelen2eingebettet werden. Innerhalb dieser Matrizen zeigen die Endothelzellen einen physiologisch relevanteren Phänotyp, der mit Matrixabbau und Lumenbildung verbunden ist. Diese Modelle zeigen jedoch nur eine Teilmenge der vielen Prozesse, die während des angiogenen Keimens auftreten, da wichtige Hinweise aus der zellulären Mikroumgebung noch fehlen.

Mikrofluidische Zellkulturplattformen sind einzigartig geeignet, um die physiologische Relevanz von In-vitro-Modellen der Vaskulatur weiter zu erhöhen. Beispielsweise können Endothelzellen Scherspannung ausgesetzt werden, was ein wichtiger biomechanischer Stimulus für die Vaskulatur ist. Auch die Möglichkeit, Flüssigkeiten in der Mikrofluidik räumlich zu steuern, ermöglicht die Bildung biomolekularer Gradienten3,4,5,6. Solche Gradienten spielen bei der Bildung und Musterung während der Angiogenese eine wichtige Rolle in vivo. Doch während mikrofluidische Zellkulturplattformen eine unvergleichliche physiologische Relevanz gegenüber herkömmlichen 2D- und 3D-Zellkulturmethoden gezeigt haben, fehlt ihnen oft der notwendige Durchsatz, skalierbarkeit und Standardisierung, der für das Arzneimittelscreening erforderlich ist. 7. Auch viele dieser Plattformen sind nicht kommerziell erhältlich und verlangen von den Endbenutzern, ihre Geräte vor der Verwendung8mikrofabrizieren. Dies erfordert nicht nur Fertigungsgeräte und technisches Wissen, sondern schränkt auch den Grad der Qualitätskontrolle ein und wirkt sich negativ auf die Reproduzierbarkeit9aus.

Bis heute sind primäre humane Endothelzellen nach wie vor die am weitesten verbreitete Zellquelle, um die Angiogenese in vitro10zu modellieren. Primäre menschliche Zellen haben jedoch eine Reihe von Einschränkungen, die ihre routinemäßige Anwendung bei Screening-Ansätzen behindern. Erstens gibt es eine begrenzte Möglichkeit, primäre zellabgeleitete Kulturen zu vergrößern und zu erweitern. Daher müssen für groß angelegte Experimente Chargen von verschiedenen Spendern verwendet werden, die zu genomischen Unterschieden und Batch-zu-Batch-Variationen führen. Zweitens verlieren primäre Endothelzellen nach einigen Passagen in der Regel relevante Eigenschaften, wenn sie in vitro kultiviert werden11,12.

Endothelzellen, die aus humaninduzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) gewonnen werden, sind eine vielversprechende Alternative: Sie ähneln Primärzellen, aber mit einem stabileren Genotyp, der auch für eine präzise Genombearbeitung geeignet ist. Darüber hinaus können sich iPSCs selbst erneuern und so in nahezu unbegrenzten Mengen erweitert werden, was iPSC-abgeleitete Zellen zu einer attraktiven Alternative zu Primärzellen für den Einsatz in In-vitro-Screening-Modellen13macht.

Hier beschreiben wir eine Methode zur Kultur von Endothelzellen als perfusable 3D-Mikrogefäße in einer standardisierten, hochdurchsatzigen mikrofluidischen Zellkulturplattform. Die Perfusion wird angewendet, indem das Gerät auf einer Wippplattform platziert wird, was einen robusten Betrieb gewährleistet und die Skalierbarkeit des Assays erhöht. Da die Mikrogefäße kontinuierlich durchblutet und einem Gradienten angiogener Faktoren ausgesetzt sind, wird das angiogene Keimen in einer physiologisch relevanteren zellulären Mikroumgebung untersucht. Während das Protokoll mit vielen verschiedenen Quellen von (primären) Endothelzellen14,15kompatibel ist, haben wir uns auf die Verwendung menschlicher iPSC-abgeleiteter ECs konzentriert, um die Standardisierung dieses Assays zu erhöhen und seine Integration zu erleichtern. in der gefäßmedikamentösen Forschung.

Protocol

1. Gerätevorbereitung Übertragen Sie die mikrofluidische 384-Well-Platte auf eine sterile Laminar-Flow-Haube. Entfernen Sie den Deckel, und fügen Sie mit einer Mehrkanal- oder sich wiederholenden Pipette 50 l Wasser oder phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in jede der 40 Beobachtungsbrunnen(Abbildung 1b, gut B2) ein.HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Lassen Sie die Platte mit dem Deckel im sterilen Kulturschrank bei Raumtemperatur (RT) auf. 2. Bereiten Gel und Beschichtung Bereiten Sie 2,5 ml mit 10 g/ml Fibronectin (FN) Beschichtungslösung vor. Verdünnung von 25 l 1 mg/ml Fibronectin-Stammlösung in 2,5 ml Dulbeccos PBS (dPBS, Calcium- und Magnesiumfrei). Legen Sie die Lösung in das Wasserbad bei 37 °C bis zum Gebrauch. Bereiten Sie 100 l Kollagen-1-Lösung vor. Fügen Sie 10 l HEPES (1 M) zu 10 l NaHCO3 (37 g/L) hinzu und mischen Sie sie durch Pipettieren. Legen Sie die Röhre auf Eis und fügen Sie 80 l Kollagen-1 (5 mg/ml) hinzu, um eine neutralisierte Kollagen-1-Konzentration von 4 mg/ml zu ergeben. Verwenden Sie eine Pipette, um sorgfältig zu mischen und die Bildung von Blasen zu vermeiden. Fügen Sie dem Geleinlass jeder mikrofluidischen Einheit 1,5 l Kollagen-1-Lösung (4 mg/ml) hinzu(Abbildung 1b, gut B1). Stellen Sie sicher, dass das Tröpfchen Desbiss in der Mitte jedes Brunnens platziert wird, damit das Gel in den Kanal gelangen kann (siehe Abbildung 2a).HINWEIS: Phasenleiter verhindern das Füllen der angrenzenden Kanäle und ermöglichen gelmustern. Die korrekte Gelbelastung kann unter einem Hellfeldmikroskop bestätigt werden, indem die Meniskusbildung durch das “Beobachtungsfenster” (gut B2) beobachtet oder die Platte auf den Kopf gekippt wird. Wenn das Gel den Kanal nicht vollständig gefüllt hat, kann ein zusätzliches Tröpfchen von 1 L hinzugefügt werden. Legen Sie die mikrofluidische Platte 10 min in einen Inkubator (37 °C, 5%CO2), um Kollagen-1 zu polymerisieren.HINWEIS: Der Zeitpunkt der Polymerisation ist entscheidend; Aufgrund der geringen Volumina in der Mikrofluidik kann die Verdunstung bereits nach 15 min Inkubation beobachtet werden, was zu Gelkollaps oder Schrumpfung führt. Nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und übertragen Sie sie auf eine sterile Laminarstromhaube. Fügen Sie der Auslassbohrung des oberen Perfusionskanals jeder mikrofluidischen Einheit 50 l von 10 g/ml FN-Beschichtungslösung hinzu(Abbildung 1b, gut A3). Drücken Sie die Pipettenspitze gegen die Seite des Brunnens, um den Brunnen korrekt zu füllen, ohne Luftblasen einzufangen (siehe Abbildung 2b). Der Kanal sollte gefüllt werden, und die Flüssigkeit sollte am Auslass (gut C1) anheften, ohne den Auslass gut zu füllen. Legen Sie die Platte mindestens 2 Tage lang in den Inkubator (37 °C, 5% CO2).HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden, da das Kollagen-1-Gel zusammen mit der Beschichtungsmischung mindestens 5 Tage im Inkubator stabil ist. Wenn die Beschichtungsmischung aufgefrischt wird, könnten längere Zeiträume möglich sein, aber dies wurde nicht getestet. Entscheidend ist der Grad der FN-Beschichtung, da dies die Austrocknung des Kollagen-1-Gels verhindert. 3. Zellsaatierung/Mikrogefäßkultur Fügen Sie 5 ml fetales Kalbsserum und 2,5 ml Pen/Strep zu 500 ml basalen Endothelzellkulturmedium hinzu und filtern Sie mit einem Flaschen-Top-Filter mit 0,22 m Porengröße. Dieses Medium wird heute als Basalmedium bezeichnet. Vorbereitung des vaskulären Wachstumsmediums: Fügen Sie 3 l mit 50 g/ml vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) und 2 l mit 20 g/ml Basis-Fibroblasten-Wachstumsfaktoren (bFGF) auf 5 ml Basalmedium hinzu. Die gefrorenen iPSC-ECs in einem 37 °C-Wasserbad schnell auftauen (<1 min) auftauen und in ein 15 ml Rohr übertragen und in 10 ml Basalmedium verdünnen. Zählen Sie die Zellen.HINWEIS: Eine einzelne Durchstechflasche enthält 1 Million Zellen in 0,5 ml mit >90% Lebensfähigkeit. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 100 x g für 5 min. Aspirieren Sie Überstand, ohne das Zellpellet zu stören, und setzen Sie im Basalmedium eine Konzentration von 2 x 107 Zellen/ml aus. Übertragen Sie die mikrofluidische 384-Well-Platte aus dem Inkubator auf eine sterile Laminar-Flow-Haube. Aspirate FN-Beschichtungslösung aus dem Perfusionseinlass (gut A1). Fügen Sie 25 l Basalmedium in die Einlassbrunnen (gut A1) hinzu. Fügen Sie jedem oberen Perfusionseinlass ein Tröpfchen mit 1 L Zellsuspension hinzu(Abbildung 1b, gut A1). Das Tröpfchen sollte in wenigen Sekunden abflachen (siehe Abbildung 3a,b für eine Abbildung dieser “passiven Pumpmethode”).HINWEIS: Prüfen Sie unter dem Mikroskop, ob die Aussaat homogen ist. Wenn nicht, fügen Sie weitere 1 L in den Auslass und warten Sie, bis das Tröpfchen abflacht. Inkubieren Sie die mikrofluidische Wellplatte für 1 h bei 37 °C, 5%CO2. Danach sollten die Zellen haften haben. Wenn nicht, warten Sie weitere 30 min. Entfernen Sie das Basalmedium aus den oberen Perfusionsauslassbrunnen (Abbildung 1b, gut A3). Fügen Sie das Medium warme Gefäßkultur in den oberen Perfusionsein- und -auslass(Abbildung 1b, Brunnen A1 und A3) hinzu. Legen Sie die Platte auf die Wippplattform (auf 7° Winkel, 8 min Schaukelintervall) im Inkubator (37 °C, 5% CO2). Stellen Sie die Platte mit einem Hellfeldmikroskop mit automatisierter Stufe an Tag 1 und 2 nach der Aussaat auf, um die Zelllebensfähigkeit zu bestätigen. Nach 2 Tagen sollte sich eine konfluente Monoschicht gegen das Kollagen-1-Gerüst gebildet haben.HINWEIS: Wenn die Kanäle nicht gleichmäßig konfluent zu sein scheinen, können die Mikrogefäße für weitere 24 h kultiviert werden. 4. Studie Angiogenic Sprouting einschließlich Tip- und Stalk-Zell-Bildung Bereiten Sie 4,5 ml angiogenes Keimmedium vor, indem Sie das Basalmedium mit 4,5 l VEGF (50 g/ml-Bestand), 4,5 l Phorbol 12-Myristate-13-Acetat (PMA) (2 g/ml-Bestand) und 2,25 l Sphingosin-1-Phosphat (S1P) (1 mM-Bestand) ergänzen. Bereiten Sie 8,5 ml Gefäßwachstumsmedium vor (Basalmedium ergänzt durch 30 ng/ml VEGF und 20 ng/ml bFGF). Aspirieren Sie Medium aus den Brunnen und fügen Sie 50 l frischeGefäßkulturmedium in die oberen Perfusionsein- und Auslassbrunnen und Gelein- und Auslassbrunnen(Abbildung 1b, Brunnen A1, A3, B1 und B3). Fügen Sie jedem unteren Perfusionskanal ein- und auslassbrunnen 50 l angiogene Sprossenmischung hinzu(Abbildung 1b, Brunnen C1 und C3). Legen Sie das Gerät wieder in den Inkubator (37 °C, 5% CO2) auf die Rockerplattform, um einen Gradienten angiogener Wachstumsfaktoren zu bilden. Bild 1 Tag und 2 Tage nach Zugabe der angiogenen Wachstumsfaktoren mit einem Hellfeldmikroskop mit automatisierter Stufe.HINWEIS: Kultivieren Sie die Mikrogefäße weiter, um Anastomose zu untersuchen (gehen Sie zu Abschnitt 5) oder fixieren und färben Sie die Mikrogefäße, um die Keimlänge und Morphologie an Tag 2 und Tag 6 zu quantifizieren (siehe Abschnitt 6). 5. Studie Anastomose und Sprossenstabilisierung Bild mit einem Hellfeldmikroskop mit automatisierter Bühne. Fügen Sie dem oberen Perfusionseinlass(Abbildung 1b, gut A1) 1 l fluoreszierend beschriftetes Albumin (0,5 mg/ml) hinzu und mischen Sie sie mit einer 50-L-Pipette. Übertragen Sie die Platte auf ein Fluoreszenzmikroskop mit automatisiertem Stadium und Inkubator-Set bei 37 °C. Mikroskop auf 10x Objektiv einstellen und Belichtungseinstellungen korrigieren (z. B. Tetramethylrhodinamin [TRITC]-Kanal, 20 ms Exposition). Erfassen Sie Zeitrafferbilder jede Minute für 10 min. Entfernen Sie die Platte aus dem Mikroskop und übertragen Sie die Platte auf eine sterile Laminarstromhaube. Entfernen Sie alle Mittel aus den Brunnen und ersetzen Sie sowohl das Gefäßkulturmedium als auch das angiogene Keimmedium in den entsprechenden Brunnen (siehe Schritte 4.3 und 4.4). Legen Sie das Gerät wieder in den Inkubator (37 °C, 5% CO2), um das angiogene Keimen fortzusetzen. Wiederholen Sie die Schritte 5.1 x 5.6, um die Durchlässigkeit an Tag 6 zu untersuchen. 6. Fixierung, Färbung und Bildgebung Aspirieren Sie alle Kulturmedien aus allen Brunnen.HINWEIS: Restmittel oder Flüssigkeiten in den mikrofluidischen Kanälen beeinflussen die Fixierung aufgrund ihres geringen Volumens von 1 x 2 l nicht. Fügen Sie dem gesamten Perfusionseinlass (Abbildung 1b , A1 und C1) und den Auslassbrunnen 25 l4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS hinzu(Abbildung 1b, A1 und C1). 10 min bei RT inkubieren. Stellen Sie das Gerät unter einen leichten Winkel (ca. 5°), um den Durchfluss zu induzieren (z. B. indem Sie eine Seite der Platte auf einen Deckel legen). Aspirieren PFA aus den Brunnen. Waschen Sie alle Perfusionseinlässe und -auslässe zweimal mit 50 l der ausgewogenen Salzlösung (HBSS) von Hank. ASpirate HBSS aus Brunnen. Permeabilisieren Sie bei RT für 10 min, indem Sie allen Perfusionsein- und -auslägen 50 l 0,2% nichtionisches Tensid hinzufügen. Aspirieren Sie das nichtionische Tensid aus Brunnen. Waschen Sie die Perfusionskanäle zweimal, indem Sie allen Perfusionsein- und Auslassbrunnen 50 L HBSS hinzufügen. ASpirate HBSS aus Brunnen. Färben Sie die Kerne mit Hoechst (1:2.000) und F-Actin mit Phalloidin (1:200) in HBSS. Bereiten Sie 2,2 ml für 40 Einheiten vor, und fügen Sie 25 l zu jedem Perfusionseinlass und Auslass gut hinzu. Legen Sie die Platte unter einen leichten Winkel und inkubieren Bei RT für mindestens 30 min. Zweimal mit 50 l HBSS in allen Perfusionseinläsen und -auslägebten waschen. Direktes Abbilden mit einem Fluoreszenzmikroskop mit automatisierter Stufe oder Aufbewahrung der lichtgeschützten Platte bei 4 °C für den späteren Gebrauch.

Representative Results

Die mikrofluidische 3D-Zellkulturplattform besteht aus 40 perfundierten mikrofluidischen Einheiten (Abbildung 1a,b), die verwendet wird, um angiogene Keimung von perfundierten Mikrogefäßen gegen ein gemustertes Kollagen-1-Gel zu untersuchen (Abbildung 1c). Diese Mikrogefäße werden kontinuierlich durchsetzt und einem Gradienten angiogener Wachstumsfaktoren ausgesetzt (Abbildung 3a-d). Die angiogenen Sprossen können entweder 2 Tage nach Gradientenexposition untersucht oder für mehr als 5 Tage nach Gradientenexposition kultiviert werden, um Anastomose und Sprossenstabilisierung zu untersuchen (siehe Zeitleiste, Abbildung 1d). Die Aussaat der iPSC-ECs nach der passiven Pumpmethode sollte zu homogenen Sädichten führen (Abbildung 4a,b). Kultur unter kontinuierlicher Perfusion führte zu konfluenten Mikrogefäßen in 2 Tagen, wobei die Zellen den Umfang des mikrofluidischen Kanals vollständig auskleideten und eine konfluente Monoschicht gegen das gemusterte Kollagen-1-Gel bildung. Die Exposition gegenüber einem Gradienten angiogener Faktoren führte zu einer richtungsweisenden angiogenen Keimung der Mikrogefäße innerhalb des gemusterten Kollagen-1-Gels (Abbildung 5a-g). Klare Spitzenzellbildung und Invasion in das Kollagen-1-Gel war 24 h nach Zugabe des angiogenen Gradienten sichtbar, während Stielzellen einschließlich Lumenbildung nach 48 h sichtbar waren (Abbildung 5a). Nach der Fixierung und Färbung kann das Kapillarnetz mit Phalloidin visualisiert werden, um F-Actin zu färben und mit Hoechst 33342 den Kern zu färben (Abbildung 5b,c). Diese Sprossen können quantifiziert werden (z.B. Form und Länge14). Ohne Addition von Wachstumsfaktoren sollte keine Invasion in das Kollagen-1-Gel beobachtet werden (Abbildung 5d). Konfokale Bildgebung wurde verwendet, um den Sprossendurchmesser zu bestimmen und die Lumenbildung zu bestätigen (Abbildung 5e-g). Die Sprossen wachsen weiter in Richtung des Gradienten und erreichen den entgegengesetzten Perfusionskanal innerhalb von 3 bis 4 Tagen nach Zugabe angiogener Wachstumsfaktoren. Dies führt zu einer Umgestaltung des Gefäßnetzes, mit einer deutlichen Verringerung der Anzahl angiogener Sprossen (Abbildung 6a). Die Lumenbildung wurde durch Perfusion des Gefäßnetzes mit fluoreszierend markierten Makromolekülen (z.B. Albumin oder Dextrans) bewertet. Durch die Durchfeinerung der Mikrogefäße mit 0,5 mg/ml mit Albumin vor und nach anastomosis ergab sich nach 10 min ein deutlicher Unterschied in der Sprossendurchlässigkeit(Abbildung 6b-e), was darauf hindeutet, dass sich die Kapillaren nach Anastomose stabilisieren und reifen. Abbildung 1: Mikrofluidisches Zellkulturprotokoll für iPSC-abgeleitete Mikrogefäße. (a) Der Boden des mikrofluidischen Zellkulturgeräts wird mit den 40 mikrofluidischen Einheiten dargestellt, die unter der 384-Well-Platte integriert sind. In der größeren Ansicht wird eine der 40 mikrofluidischen Einheiten angezeigt. (b) Jede mikrofluidische Einheit befindet sich unter 9 Brunnen mit 3 Einlaufbrunnen und 3 Auslassbrunnen. Die mikrofluidischen Kanäle sind durch Grate (“Phaseguides”) getrennt, die die Musterung von Hydrogelen im zentralen Kanal (“Gelkanal”) ermöglichen, während noch Kontakt mit den angrenzenden Kanälen (“Perfusionskanäle”) besteht. (c) Methode zur Kultur eines durchgebohrten Mikrogefäßes innerhalb des mikrofluidischen Geräts, das verwendet wird, um gradientengetriebene angiogene Keimung durch eine gemusterte Kollagen-1-Matrix zu untersuchen. (d) Zeitplan für das Studium der angiogenen Keimung und/oder Anastomose. Diese Zahl wurde von van Duinen et al.14geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 2: Ladevorgänge für Gel und Medium. (a) Beispiele für korrekte und falsche Gelablagerungen. Korrekte Ablage führt zu einem gemusterten Kollagen-1-Gel im mittleren Kanal, das anschließend polymerisiert wird. (b) Beispiele für eine korrekte und falsche Befüllung der Brunnen. Brunnen werden in der Größenordnung von 1 x 4 gefüllt, um Luftblaseneinschlüsse innerhalb der mikrofluidischen Kanäle zu verhindern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 3: Kontinuierliche hydrostatische Druckströmung und Gradientenstabilisierung. (a) Hydrostatische Druckunterschiede zwischen Brunnen führen zu passiver Nivellieren und Durchfluss innerhalb der mikrofluidischen Kanäle. (b) Das Setzen des Geräts auf einer Rockerplattform, die auf 7° und 8 min Zykluszeit eingestellt ist, führt zu einer kontinuierlichen, bidirektionalen Perfusion innerhalb der mikrofluidischen Kanäle. (c) Gradienten entstehen durch die Einführung von zwei unterschiedlichen Konzentrationen in den Brunnen, die durch passive Nivellierung kontinuierlich aufgefrischt werden. (d) Gradientenvisualisierung mit Fluorescein isothiocyanat (FITC)-dextran. Bidirektionaler Durchfluss stabilisiert den Gradienten bis zu 3 Tage. Skalenbalken = 200 m. Diese Zahl wurde von van Duinen et al.14geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 4: Passives Pumpenverfahren für die Zellaussaat. (a) Passives Pumpen wird durch Druckunterschiede angetrieben, die durch Unterschiede in der Oberflächenspannung verursacht werden. Dies führt zu einem Fluss aus dem Tröpfchen (hoher Innendruck) in Richtung Reservoir (niedriger Innendruck). (b) Zeitraffer eines Tröpfchens (graue Umriss), das auf dem Einlass (weißer Umriss) des mikrofluidischen Kanals (blauer Umriss) platziert wird. Direkt nach dem Zusatz (Abbildung 4b, i), schrumpft das Tröpfchen auf dem Einlass (Abbildung 4b, ii: 1 s nach Zugabe; iv: 2 s nach Zugabe), was zu einem Fluss in Richtung Ausgang führt. Dies wird so lange fortgesetzt, bis der Tröpfchenmeniskus durch den Einlass fixiert wird (Abbildung 4b, iv). Maßstabsleiste = 400 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 5: Robustes 3D-Sprossen von iPSC-EC-Mikrogefäßen. (a) Sprießen von iPSC-EC im Laufe der Zeit. Mikrogefäße wurden für 48 h (rechts) angebaut und dann mit einem angiogenen Cocktail stimuliert, der 50 ng/ml VEGF, 500 nM S1P und 2 ng/ml PMA enthält. Die ersten Spitzenzellen, die in das Kollagen-1-Gerüst (Mitte) eindringen, sind 24 h nach der Belichtung sichtbar. Die ersten Lumen sind 48 h nach belichtung (rechts) sichtbar (Pfeile), während die Spitzenzellen weiter in Richtung des Farbverlaufs migriert sind. (b) Array von 15 Mikrogefäßen, die mit VEGF, S1P und PMA für 2 Tage stimuliert und für F-Actin (gelb) und Kerne (blau) gebeizt wurden. Skala bar = 200 m . (c) Stimuliertes Mikrogefäß (positive Kontrolle). (d) Unstimuliertes Mikrogefäß (negative Kontrolle). (e) Die maximale Projektion einer einzelnen Kapillare innerhalb des Gels. (f) Gleich wie (g) aber auf die Mitte fokussiert. Gepunktete Linie gibt die Position der orthogonalen Ansicht in Panel g. Scale Bars (a-d: 200 m; e-g: 20 m) an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 6: Visualisierung der angiogenen Sprossendurchlässigkeit vor und nach der Anastomose. (a) Anastomose mit Basalkanal löst den Schnitt und die Reifung angiogener Sprossen aus. Nahaufnahme des Kapillarbettes bei 2, 4, 6 und 7 Tagen nach Stimulation mit angiogenen Wachstumsfaktoren. (b) Angiogene Sprossen nach 2 Tagen nach Zugabe von angiogenen Wachstumsfaktoren. Angiogene Sprossen bilden sich im Gel, sind aber noch nicht mit dem unteren Perfusionskanal verbunden. (c) Perfusion des Mikrogefäßes mit 0,5 mg/ml Albumin-Alexa 555 Lösung. Fluoreszierende Bilder, die bei 0 und 10 min.(d,e)erhalten wurden wie in den Paneelen b und c, aber nach 7 Tagen Stimulation. Sprossen sind mit der anderen Seite verbunden und bilden ein konfluentes Mikrogefäß im basalen Perfusionskanal. Skalenbalken = 100 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Problem Ursache Lösung Collagen-1 tritt den Kanal nicht vollständig ein oder füllt ihn nicht vollständig Kollagen-1 Tröpfchen wird nicht auf den Einlass gelegt Legen Sie den Tröpfchen vorsichtig auf den Einlass aus dem Gelkanal Volumen von Kollagen-1 ist zu niedrig Verwenden Sie 1,5 l des Gels, um den Kanal vollständig zu füllen Kollagen-1 ist zu zähflüssig Verwenden Sie eine andere Charge kollagen-1 Kollagen-1 fließt in Perfusionskanäle Kollagen-1 wird direkt in den Einlass des Gelkanals pipettiert Legen Sie den Tröpfchen vorsichtig auf den Einlass aus dem Gelkanal Kollagen-1 ist nicht klar/Faserbildung Kollagen-1 wird nicht richtig gespeichert Kollagen-1 bei 4 °C lagern, nicht einfrieren NaHCO3 und HEPES werden vor dem Hinzufügen von Kollagen-1 nicht gut gemischt Mischen Sie die NaHCO3 und HEPES sorgfältig durch Pipettieren, bevor Sie das Kollagen-1 Tröpfchen schrumpft nicht mit passiver Pumpmethode Tröpfchen haftet auf der Seite des Brunnens Aspirieren Sie Tröpfchen und fügen Sie neue Tröpfchen auf dem Einlass Stellen Sie sicher, dass der Auslassbrunnen mit mindestens 20 Es wird kein Keimen beobachtet Wachstumsfaktoren werden nicht addiert oder Aliquots werden nicht ordnungsgemäß gespeichert Frisches angiogenes Keimmedium zubereiten Luftblasenblöcke Perfusion / Gradientenbildung Entfernen Sie Luftblasen mit einer P20- oder P200-Pipette Volumenunterschiede zwischen Brunnen Volumen in allen Brunnen müssen gleich sein, um einen linearen Farbverlauf zu bilden Zellen nicht lebensfähig Platte nicht auf Rockerplattform/Rockerplattform abgestellt Stellen Sie sicher, dass die Rockerplattform eingeschaltet ist und die richtige Zykluszeit/-winkel (8 min/7°) hat. Keine Durchblutung durch Vorhandensein von Luftblasen möglich Entfernen Sie Luftblasen mit einer P20- oder P200-Pipette Es werden keine Lumen gebildet, Zellen wandern als einzelne Zellen Angiogenic Sprouting Gemisch wurde hinzugefügt, bevor eine Monoschicht gebildet wurde Warten Sie weitere 24 stunden, bevor Sie die angiogenen Wachstumsfaktoren hinzufügen Große Unterschiede in der Keimdichte Unterschiede in der Zelldichte nach der Aussaat Prüfen Sie, ob die Zelldichte homogen und zwischen mikrofluidischen Einheiten vergleichbar ist. Fügen Sie bei Bedarf ein weiteres Tröpfchen zellgefedert hinzu Tabelle 1: Fehlerbehebung bei häufigen Fehlern.

Discussion

Diese Methode beschreibt die Kultur von 40 perfusableen endotheliale Mikrogefäßen innerhalb einer robusten und skalierbaren mikrofluidischen Zellkulturplattform. Im Vergleich zu herkömmlichen 2D- und 3D-Zellkulturmethoden zeigt diese Methode, wie eine physiologisch relevante zelluläre Mikroumgebung, die Gradienten und kontinuierliche Perfusion umfasst, mit einer 3D-Zellkultur mit angemessenem Durchsatz für das Screening kombiniert werden kann. Zwecke.

Einer der Hauptvorteile gegenüber vergleichbaren mikrofluidischen Assays ist, dass diese Methode nicht auf Pumpen für die Perfusion angewiesen ist, sondern eine Rockerplattform verwendet, um eine kontinuierliche Perfusion in allen mikrofluidischen Einheiten gleichzeitig zu induzieren. Dadurch wird sichergestellt, dass der Assay robust und skalierbar ist: Platten können auf einer Rockerplattform gestapelt werden. Wichtig ist, dass alle mikrofluidischen Einheiten individuell adressierbar bleiben, was es ermöglicht, diese Methode im Arzneimittelscreening einschließlich der Erzeugung einer Dosis-Wirkungs-Kurve umzusetzen. Darüber hinaus ist ohne Pumpe, Bildgebung und Mittlerer Austausch viel einfacher mit geringerem Risiko einer (Kreuz-)Kontamination.

Ein weiterer Vorteil dieser Methode ist die Nutzung einer standardisierten, vorgefertigten Plattform, während vergleichbare mikrofluidische Zellkulturplattformen von den Endnutzern hergestellt werden müssen. Diese Verfügbarkeit erleichtert die Annahme dieses Assays bei anderen akademischen und pharmazeutischen Forschungsgruppen, was zur Standardisierung führt. Im Gegensatz zu mikrofluidischen Prototypen sorgt die 384-Well-Plattenschnittstelle zu der Kompatibilität mit den aktuellen Laborgeräten (z. B. Aspiratoren, Plattenhandler und Mehrkanalpipetten) und erleichtert die Integration in die aktuelle Siebinfrastruktur. .

Es gibt mehrere kritische Schritte bei der Durchführung dieses Testes. Das Kollagen-1-Gel sollte den Gelkanal vollständig füllen. Während der Gelbeladung kann diese Füllung beobachtet werden, indem die mikrofluidischen Kanäle entweder durch das Beobachtungsfenster (Abbildung 2a) oder durch Umdrehen der Platte auf den Kopf (siehe Abbildung 1a) untersucht werden. Während der Füllung sollte das Kollagengel im Mittelkanal bleiben, ohne in benachbarte Perfusionskanäle zu fließen. Wir stellten fest, dass die Qualität des Kollagen-1-Gels entscheidend für die richtige Assay-Performance ist. Kollagen-1-Chargen mit zu hoher Viskosität führen zu einer unvollständigen Füllung des Gelkanals. Nach 10 min Polymerisation bei 37 °C sollte das Gel homogen und klar sein. Wenn Kollagen-1 nicht richtig gelagert wird (z.B. aufgrund schwankender Temperaturen im Kühlschrank), polymerisiert kollagen innerhalb der Kanäle mit deutlich sichtbarer Faserbildung. Dies kann zu einer Invasion der ECs in das Gel ohne Zugabe von angiogenen Faktoren, aber ohne angemessene Lumenentwicklung führen.

Wenn die Zellen gesät sind, wird die Fibronectin-Beschichtungslösung aus den Brunnen entfernt, so dass nur die mikrofluidischen Kanäle mit Beschichtungslösung gefüllt werden. Die Aspiration der Beschichtungslösung aus mikrofluidischen Kanälen kann zu Gelstörungen oder Gelabsaugung führen. Die Zellsuspension muss diese Beschichtungslösung ersetzen/verdrängen. Dies funktioniert am besten, wenn die Zellsuspension mit dem passiven Pumpverfahren gesät wird, da das direkte Pipettieren der Zellsuspension in die Kanäle weniger reproduzierbare Sädichten zeigt.

Da die Mikrogefäße eine stabile Monoschicht gegen das Gel bilden, führen diese kleinen Unterschiede nur zu unterschiedlichen Zeiten, die für das Erreichen der Konfluenz erforderlich sind. So wird der Assay-Startpunkt durch Diekonfluenz und nicht durch Kulturzeit bestimmt. Bei Bedarf kann die Kultivierungszeit verlängert werden, bis eine klare Monoschicht gegen das Gel gebildet wurde.

Innerhalb der Brunnen können Luftblasen durch falsche Befüllung der Brunnen eingefangen werden (siehe Abbildung 2b). Diese Luftblasen schränken den Fluss des Mediums ein, selbst wenn das Gerät auf einer Wippplattform platziert wird, und führen zum Zusammenbruch des Mikrogefäßes und zu einer unsachgemäßen Gradientenbildung. Das Drücken der Pipettenspitze gegen die Seitenwand der Brunnen erhöht den Erfolg, den Brunnen vollständig zu füllen. Wenn eine Luftblase in den Brunnen gefangen ist, kann sie durch sanftes Einsetzen einer sterilen Pipettenspitze in den Glasboden entfernt werden. Luftblasen können auch innerhalb der mikrofluidischen Kanäle auftreten. Wenn Medium aus den Brunnen entfernt wurde, ist die Verdunstung des Mediums aus den mikrofluidischen Kanälen nach 30 min (aufgrund der Mikrolitervolumina innerhalb der Kanäle) spürbar. So werden mittlere Veränderungen vorzugsweise so schnell wie möglich durchgeführt. Wenn Medium in einem Kanal mit verdampftem Medium hinzugefügt wird, werden Luftblasen in den mikrofluidischen Kanälen eingeschlossen. Diese Luftblasen innerhalb der mikrofluidischen Kanäle können manuell entfernt werden, indem eine P20 Pipette direkt auf den Ein- oder Auslass platziert wird und das Medium durch die Mikrofluidik aus dem gegenüberliegenden Brunnen gezwungen wird. Die erfolgreiche Entfernung der Luftblasen führt zu einer kleinen, aber spürbaren Volumenabnahme im anderen Brunnen. In Tabelle 1 sind häufige Fehler aufgeführt und wie Sie diese beheben können.

Das Fehlen einer Pumpe ist eine Einschränkung, wenn eine kontinuierliche Bildgebung erforderlich ist, da die Rockerplattform den Benutzer in sequenziellen Zeitintervallen auf das Bild beschränkt. Darüber hinaus besteht die Durchblutung des Mediums in dieser Plattform aus bidirektionalen Strömungen mit geringer Scherspannung, während die Vaskulatur in vivo einem unidirektionalen Fluss mit höherer Scherspannung ausgesetzt ist. Während wir keine negativen Auswirkungen des bidirektionalen Flusses in Bezug auf die angiogene Keimung beobachten, ist der Fluss ein wichtiger biomechanischer Stimulus und vorzugsweise kontrolliert. Obwohl es handelsübliche Pumpen-Setups gibt, bleibt die Anbindung an die 384-Well-Platte eine Herausforderung und Pumpen-Setups behindern die Skalierbarkeit dieses Assays erheblich.

Die Möglichkeit, iPSC-ECs zur Untersuchung von angiogenen Keimungen zu verwenden, eröffnet neue Möglichkeiten in der Krankheitsmodellierung und Arzneimittelforschung. Im Gegensatz zu primären ECs können diese Zellen in nahezu unbegrenzten Mengen mit einem stabilen Genotyp erzeugt werden, und durch die Verwendung von Genom-Editing-Techniken können Zellen erzeugt werden, die GenKnockouts und Knock-Ins einschließen. Da die Protokolle zur Unterscheidung von ECs von iPSC jedoch relativ neu sind, ist noch unklar, was zu iPSC-ECs führt, die primär eCs am besten widerspiegeln, und welche Subtypen von EC erzeugt werden können oder werden können. Auch gibt es noch Fragen in Bezug auf ihre Relevanz. Zeigen iPSC-ECs beispielsweise noch die Plastizität, die typisch für Endothelzellen ist? Und inwieweit reagieren und interagieren iPSC-abgeleitete Zellen auf ihre zelluläre Mikroumgebung? Die hier vorgestellte standardisierte Plattform könnte genutzt werden, um einige dieser Fragen zu beantworten, um die Verwendung von iPSC-abgeleiteten ECs in vitro weiter zu validieren.

Die geradlinigste zukünftige Richtung für diesen Test wird die Integration anderer Zelltypen sein, die eine wichtige Rolle während der Angiogenese spielen, wie Pericyten und Makrophagen. Dies wird die Fähigkeit erleichtern, die Rolle von Makrophagen während der Anastomose zwischen Sprossen oder die Einhaltung von Pericyten nach der Kapillarbildung zu untersuchen. Es ist auch möglich, verschiedene andere Zelltypen innerhalb oder gegen eine extrazelluläre Matrix zu kultiieren (z.B. haben wir die Kultur von Neuronen und verschiedenen epithelialer Strukturen wie proximalen Tubuli und Dünndarmen gezeigt), die mit dem Vaskulären kombiniert werden können Betten, die mit dieser Methode generiert werden. Schließlich wird es interessant sein, angiogene Keimung in synthetischen Hydrogelen zu untersuchen, da ihre definierte Zusammensetzung die Standardisierung des Assays weiter erhöht und die Abstimmung von Steifigkeits- und Bindungsmotiven ermöglicht, die Zell-Matrix-Wechselwirkungen beeinflussen.

Zusammenfassend zeigt diese Methode die Machbarkeit von iPSC-abgeleiteten ECs in einem standardisierten und skalierbaren 3D-Angiogen-Assay, der physiologisch relevante Kulturbedingungen in einer Plattform kombiniert, die die erforderliche Robustheit und Skalierbarkeit hat, die in Drogen-Screening-Infrastruktur.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wird zum Teil durch ein Forschungsstipendium des Programms “Meer Kennis met Minder Dieren” (Projektnummer 114022501) der niederländischen Organisation für Gesundheitsforschung und -entwicklung (ZonMw) und des CVON-Konsortiumsder Spartenstipendiums der Niederländischen Herzstiftung unterstützt. Verbinden.

Materials

0.2-10 μL Electronic repeater pipette Sigma Z654566-1EA
1 M HEPES Gibco 15630-056
3-lane OrganoPlate Mimetas 4003-400B
4% PFA in PBS Alfa Aesar J61899
Basal culture medium NCardia
Collagen-1 Cultrex 3447-020-01
Combitips Advanced Biopur 2.5 mL VWR 613-2071
dPBS Gibco 14190-094
Eppendorf Repeater M4 pieptte VWR 613-2890
Fibronectin Sigma-Aldrich F4759-1MG 1 mg/mL in milliQ water
HBSS Gibco 14025-050
Hoechst Molecular Probes H3569 10 mg/mL solution in water
iPSC-derived endothelial cells NCardia
NaHCO3 Sigma S5761 37 g/L in milliQ water
OrganoPlate Perfusion Rocker Mini Mimetas Rocker platform used to provide flow
Pen/Strep Sigma P4333
Phalloidin Sigma P1951 1 mg/mL in DMSO
PMA Focus-Biomolecules 10-2165 2 μg/mL in PBS containing 0.1% DMSO
S1P Ecehelon Biosciences S-2000 1 mM in methanol containing 1% acetic acid
TRITC-albumin Invitrogen A34786
VEGF Peprotech 450-32-10 50 μg/mL in water containing 0.1% BSA
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References

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3D Angiogenic SproutingIPSC-derived Endothelial CellsIn Vitro AssayMicrofluidic PlatformHigh-throughput ScreeningAngiogenesisCollagenFibronectinPerfusionCardiovascular Disease

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van Duinen, V., Stam, W., Borgdorff, V., Reijerkerk, A., Orlova, V., Vulto, P., Hankemeier, T., van Zonneveld, A. J. Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro. J. Vis. Exp. (153), e59678, doi:10.3791/59678 (2019).
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