مقايسة معياريه وقابله للتطوير لدراسة الخلايا الغشائية ثلاثية الابعاد المشتقة من iPSC في المختبر
Summary
يصف هذا الأسلوب ثقافة الخلايا البطانية المشتقة من iPSC كالاوعيه المجهرية ثلاثية الابعاد 40 perfused في منصة ميكروفلويدريك القياسية. تمكن هذه المنصة دراسة الانحدار الموجه للاوعيه الدموية في 3D ، بما في ذلك الانسمام وتثبيت براعم الاوعيه الدموية بطريقه قابله للتطوير وعاليه الانتاجيه.
Abstract
البحوث الدوائية قبل السريرية للامراض الوعائية يتطلب في المختبر نماذج من الاوعيه الدموية التي هي القابلة للتعديل لفحص عاليه الانتاجيه. ومع ذلك ، فان نماذج الفرز الحالية في المختبر التي لديها إنتاجيه كافيه لا تكون لها سوي اهميه فسيولوجية محدوده ، مما يعوق ترجمه النتائج من المختبر إلى الجسم المجري. من ناحية أخرى, وقد أظهرت منصات ثقافة الخلايا ميكروفلويدريك صله فسيولوجية لا مثيل لها في المختبر, ولكن في كثير من الأحيان تفتقر إلى الانتاجيه المطلوبة, قابليه التحجيم والتوحيد. ونحن نظهر منصة قويه لدراسة الاوعيه الدموية من الخلايا البطانية المستمدة من الخلايا الجذعية مستحث الإنسان المستحثة (iPSC-ECs) في البيئة الخلوية ذات الصلة الفسيولوجية ، بما في ذلك الانصهار والتدرجات. يتم استزراع iPSC-ECs كما 40 الاوعيه الدقيقة 3D المجهرية ضد الكولاجين منقوشة-1 سقالة. عند تطبيق التدرج من العوامل الوعائية ، يمكن دراسة السمات الهامه لتولد الاوعيه ، بما في ذلك التمايز في الخلية الطرف والساق وتشكيل التجويف القابل للاستخدام. Perfusion مع الاصباغ التتبع الفلورسنت تمكن دراسة نفاذيه اثناء وبعد الانسمام من براعم الاوعيه. في الختام ، يظهر هذا الأسلوب جدوى ECs المستمدة من iPSC في اختبار الوعائية ثلاثية الابعاد موحده وقابله للتطوير التي تجمع بين الظروف الثقافية ذات الصلة الفسيولوجية في منصة التي لديها المتانة المطلوبة والقابلية لدمجها داخل البنية التحتية لفحص المخدرات.
Introduction
في نماذج المختبر تلعب دورا أساسيا في اكتشاف والتحقق من صحة أهداف جديده من المخدرات من امراض الاوعيه الدموية. ومع ذلك ، الحالية في المختبر نماذج الفرز التي لديها الانتاجيه الكافية فقط لها صله فسيولوجية محدوده1، مما يعوق ترجمه النتائج من المختبر إلى المجرية. التالي ، للمضي قدما في أبحاث المخدرات الوعائية قبل السريرية ، وتحسين في نماذج المختبر من الاوعيه الدموية اللازمة التي تجمع بين الفحص عاليه الانتاجيه مع البيئة الدقيقة الخلوية ثلاثية الابعاد ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية.
وخلال العقد الماضي ، أحرز تقدم كبير في زيادة الاهميه الفسيولوجية لنماذج الاوعيه الدموية في المختبر. بدلا من زراعه الخلايا البطانية علي الأسطح المسطحة مثل البلاستيك الانسجه الثقافة ، يمكن ان تكون جزءا لا يتجزا من الخلايا البطانية في السقالات 3D ، مثل الليفيبين والكولاجين الهلام2. داخل هذه المصفوفات ، تظهر الخلايا البطانية النمط الظاهري ذات الصلة الفسيولوجية أكثر المرتبطة بتحلل المصفوفة وتشكيل التجويف. ومع ذلك ، هذه النماذج فقط إظهار مجموعه فرعيه من العديد من العمليات التي تحدث اثناء الموجات الوعائية كما العظة الهامه من البيئة الخلوية الدقيقة لا تزال تفتقر.
المنصات الثقافية الخلوية microfluidic هي مناسبه بشكل فريد لزيادة الاهميه الفسيولوجية للنماذج في المختبر من الاوعيه الدموية. علي سبيل المثال ، يمكن ان تتعرض الخلايا البطانية للإجهاد القص ، وهو محفز نشاط هام للاوعيه الدموية. أيضا ، وامكانيه التحكم في السوائل مكانيا داخل ميكروفلويديكس يسمح لتشكيل التدرجات الجزيئية الحيوية3،4،5،6. هذه التدرجات تلعب دورا هاما في الجسم الخارجي اثناء تشكيل وزخرفه اثناء الاوعيه. ومع ذلك ، في حين أظهرت منصات ثقافة الخلايا ميكروفلويديك الصلة الفسيولوجية لا مثيل لها علي التقليدية 2d و 3d أساليب ثقافة الخلية ، وانها غالبا ما تفتقر إلى الانتاجيه اللازمة ، والتدرجية والتوحيد القياسي المطلوب للكشف عن المخدرات 7. أيضا ، العديد من هذه المنصات ليست متاحه تجاريا وتتطلب المستخدمين النهائيين لتصنيع أجهزتهم قبل استخدام8. هذا لا يتطلب فقط جهاز التصنيع والمعرفة التقنية ، ولكن أيضا يحد من مستوي مراقبه الجودة ويؤثر سلبا علي استنساخ9.
حتى الآن ، تظل الخلايا البطانية البشرية الاوليه هي مصدر الخلايا الأكثر استخداما علي نطاق واسع لنموذج تولد الاوعيه في المختبر10. ومع ذلك ، فان الخلايا البشرية الاوليه لديها عدد من القيود التي تعيق تطبيقها الروتيني في نهج الفرز. أولا ، هناك امكانيه محدوده لزيادة وتوسيع الثقافات المشتقة من الخلايا الاوليه. التالي ، بالنسبة للتجربة الواسعة النطاق ، يلزم استخدام دفعات من جات مانحه مختلفه ، مما ينتج عنه اختلافات جينيه واختلافات بين الدفعات والدفعات. ثانيا ، بعد بضع مقاطع ، تفقد الخلايا البطانية الاساسيه عموما الخصائص ذات الصلة عند استزراعها في المختبر11،12.
الخلايا البطانية المستمدة من الخلايا الجذعية مستحث الإنسان المستحثة (iPSC) هي بديل واعد: انها تشبه الخلايا الاوليه ، ولكن مع النمط الجيني أكثر استقرارا التي هي أيضا قابله للتحرير الجينوم دقيقه. وعلاوة علي ذلك ، فان iPSCs قادره علي التجديد الذاتي ، التالي يمكن توسيعها بكميات غير محدوده تقريبا ، مما يجعل الخلايا المشتقة من Ipscs بديلا جذابا للخلايا الاوليه للاستخدام داخل نماذج الفحص الأنبوبي13.
هنا ، ونحن وصف طريقه للثقافة الخلايا البطانية كما الاوعيه المجهرية 3D القابلة للاستخدام في نظام موحد ، وارتفاع الانتاجيه ميكروفلويدريك خليه ثقافة. يتم تطبيق perfusion عن طريق وضع الجهاز علي منصة الروك ، والذي يضمن عمليه قويه ويزيد من قابليه الفحص. كما يتم باستمرار perfused أوعيه الدقيقة ويتعرض لتدرج من العوامل الوعائية ، يتم دراسة تنتشر وعائي في البيئة الدقيقة الخلوية ذات الصلة أكثر الفسيولوجية. في حين ان البروتوكول متوافق مع العديد من مصادر مختلفه من (الابتدائية) الخلايا البطانية14,15, ركزنا علي استخدام الإنسان المشتقة ipsc ECs من أجل زيادة توحيد هذا الفحص وتسهيل اندماجها داخل البحوث المخدرات الاوعيه الدموية.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا الأسلوب ثقافة الاوعيه المجهرية البطانية القابلة للاستخدام بال40 داخل منصة ثقافة خلايا ميكروفلويدريك قويه وقابله للتطوير. بالمقارنة مع الأساليب التقليدية لاستزراع الخلايا ثنائيه الابعاد وثلاثية الابعاد ، فان هذه الطريقة تبين كيف يمكن الجمع بين البيئة الخلوية ذات الصلة الفسيولوجية التي تشمل التدرجات والتروية المستمرة مع ثقافة الخلايا ثلاثية الابعاد مع إنتاجيه كافيه للفحص اغراض.
واحده من المزايا الرئيسية علي مقارنه المقايسات ميكروفلوريك هو ان هذه الطريقة لا تعتمد علي مضخات للبيروفيوجن ولكن يستخدم منصة الروك للحث علي التروية المستمرة في جميع وحدات ميكروفلويدريك في وقت واحد. وهذا يضمن ان المقايسة قويه وقابله للتطوير: يمكن ان تكون الصفائح مكدسه علي منصة الروك. والاهم من ذلك ، تظل جميع الوحدات المجهرية قابله للتوجيه بشكل فردي ، وهو ما يسمح بتنفيذ هذه الطريقة ضمن فحص المخدرات بما في ذلك توليد منحني الجرعة والاستجابة. وعلاوة علي ذلك ، بدون مضخة ، والتصوير والاستبدال المتوسط هو ابسط بكثير مع مخاطر اقل من (الصليب)-التلوث.
ومن المزايا الأخرى لهذه الطريقة استخدام منصة موحده سابقه التصنيع ، بينما تحتاج منصات ثقافة الخلايا المجهرية القابلة للمقارنة إلى ان تكون ملفقه من قبل المستخدمين النهائيين. وييسر هذا التوافر اعتماد هذا الفحص بين مجموعات البحوث الاكاديميه والصيدلانية الأخرى ، مما يؤدي إلى التوحيد القياسي. أيضا ، علي عكس النماذج ميكروفلويديك ، واجهه لوحه 384 البئر يضمن التوافق مع المعدات المختبرية الحالية (علي سبيل المثال ، الطامحين ، معالجات لوحه والأنابيب متعددة القناات) ، وتسهيل التكامل داخل البنية التحتية الحالية الفرز .
هناك العديد من الخطوات الهامه في تنفيذ هذا الفحص. هلام الكولاجين-1 يجب ان تملا تماما قناه هلام. خلال التحميل هلام ، ويمكن ملاحظه هذا الحشو عن طريق التفتيش علي قنوات ميكروفلويدريك اما من خلال نافذه المراقبة (الشكل 2a) أو عن طريق التقليب لوحه راسا علي عقب (كما هو مبين في الشكل 1a). اثناء التعبئة ، يجب ان يبقي جل الكولاجين في القناة المركزية ، دون التدفق إلى القناات المتاخمة. لاحظنا ان نوعيه هلام الكولاجين-1 أمر حاسم لأداء الفحص السليم. الكولاجين-1 دفعات مع اللزوجة عاليه جدا سوف يؤدي إلى ملء غير مكتملة من قناه هلام. بعد 10 دقيقه من البلمره في 37 درجه مئوية ، يجب ان يكون هلام متجانسة وواضحة. إذا لم يتم تخزين الكولاجين-1 بشكل صحيح (علي سبيل المثال ، بسبب تقلب درجات الحرارة في الثلاجة) ، فان الكولاجين سوف تتبلمر داخل القناات مع تشكيل ألياف مرئية بوضوح. هذا يستطيع نتجت في غزوه من ال [اكس] داخل الهلام دون أضافه من عاملات وعائية, غير ان دون مناسبه تجويف تطوير.
عندما يتم البذر الخلايا ، يتم أزاله محلول طلاء الفيبرونكتين من الآبار ، وترك فقط القناات ميكروفلويديك مليئه محلول الطلاء. يمكن ان يسبب طموح محلول الطلاء من القناات ميكروفلويدريك الهلام اضطراب أو هلام الطموح. تعليق الخلية يحتاج إلى استبدال/أزاحه هذا الحل طلاء. هذا يعمل بشكل أفضل عندما يتم المصنفة تعليق الخلية باستخدام طريقه الضخ السلبي ، كما الماصات مباشره تعليق الخلية في القناات تظهر كثافة البذر اقل استنساخه.
وبما ان الاوعيه المجهرية تشكل طبقه أحاديه مستقره ضد الهلام ، فان هذه الاختلافات الصغيرة تؤدي فقط في أوقات مختلفه لازمه للوصول إلى كونفلوينسي. التالي ، يتم تحديد نقطه بداية الفحص بواسطة كونفلوينسي بدلا من وقت الثقافة. إذا لزم الأمر ، يمكن تمديد وقت الخياطة حتى يتم تشكيل أحاديه واضحة ضد الهلام.
داخل الآبار ، يمكن ان تكون المحاصرين فقاعات الهواء عن طريق ملء غير صحيح من الآبار (انظر الشكل 2b). هذه فقاعات الهواء سوف تحد من تدفق المتوسطة ، حتى عندما يتم وضع الجهاز علي منصة الروك ، ويؤدي إلى انهيار الاوعيه الدقيقة وتشكيل التدرج غير لائق. سيؤدي الضغط علي طرف الماصة ضد الجدار الجانبي للآبار إلى زيادة نجاح ملء البئر تماما. إذا كانت فقاعه الهواء محصورة داخل الآبار ، فيمكن ازالتها عن طريق إدخال طرف ماصه معقم برفق في أسفل الزجاج. فقاعات الهواء يمكن ان تحدث أيضا داخل القناات ميكروفلويديك. عندما تمت أزاله المتوسطة من الآبار ، وتبخر المتوسطة ملحوظ من القناات ميكروفلويديك بعد 30 دقيقه (بسبب احجام ميكروليتر داخل القناات). التالي ، يفضل اجراء التغييرات المتوسطة في أسرع ما يمكن. عندما يتم أضافه المتوسطة في قناه مع المتوسطة تبخرت ، سيتم المحاصرين فقاعات الهواء داخل القناات ميكروفلويديك. ويمكن أزاله هذه الفقاعات الهواء داخل القناات ميكروفلويديك يدويا عن طريق وضع ماصه P20 مباشره علي مدخل أو منفذ وإجبار المتوسطة من خلال ميكروفلويديك من البئر المعاكس. النجاح في أزاله فقاعات الهواء يؤدي إلى انخفاض صغير ولكن ملحوظ في حجم في البئر الأخرى. يسرد الجدول 1 الأخطاء الشائعة وكيفيه استكشافها.
عدم وجود مضخة هو الحد عند التصوير المستمر هو مطلوب ، ومنصة الروك يحد من المستخدم إلى الصورة في فترات زمنيه متسلسلة. وعلاوة علي ذلك ، فان الانصهار من المتوسطة في هذه المنصة يتكون من تدفق ثنائي الاتجاه مع مستويات منخفضه من الإجهاد القص ، في حين يتعرض الاوعيه الدموية في الجسم المجري إلى تدفق أحادي الجانب مع مستويات اعلي من الإجهاد القص. في حين اننا لا نلاحظ الآثار السلبية للتدفق ثنائي الاتجاه فيما يتعلق بالموجات الوعائية, تدفق هو التحفيز نشاط الهامه ويفضل التحكم فيها. ومع ذلك ، في حين ان هناك الاجهزه مضخة المتاحة تجاريا ، والتواصل مع لوحه 384 البئر لا تزال صعبه ومضخة الاجهزه تعيق بشده قابليه هذا الفحص.
امكانيه استخدام ipsc-ECs لدراسة تنتشر الوعائية يفتح فرصا جديده في نمذجة الامراض والبحوث المخدرات. وعلي النقيض من ECs الاوليه ، يمكن ان تتولد هذه الخلايا في كميات لا حدود لها تقريبا مع النمط الجيني مستقره وباستخدام تقنيات تحرير الجينوم ، يمكن توليد الخلايا التي بما في ذلك الضربات القاضية الجينات والطرق الاضافيه. ومع ذلك ، كما البروتوكولات للتمييز ECs من iPSC هي جديده نسبيا ، فانه لا يزال من غير الواضح ما يؤدي إلى iPSC-ECs التي تعكس أفضل ECs الاساسيه والأنواع الفرعية من EC هي أو يمكن ان تتولد. أيضا ، لا تزال هناك اسئله متبقية بشان صلتها. علي سبيل المثال ، هل لا يزال يحمل iPSC-ECs اللدونة التي هي نموذجيه للخلايا البطانية ؟ والي اي درجه الخلايا المشتقة iPSC الاستجابة والتفاعل مع بيئتهم الخلوية الصغيرة ؟ ويمكن استخدام المنصة الموحدة المعروضة هنا للرد علي بعض هذه الاسئله من أجل المزيد من التحقق من صحة استخدام ECs المشتقة من iPSC في المختبر.
سيكون الاتجاه المستقبلي الأكثر استقامة لهذا الفحص هو تكامل أنواع الخلايا الأخرى التي تلعب دورا هاما اثناء تولد الاوعيه ، مثل العجانات والضامة. وهذا سوف يسهل القدرة علي دراسة دور الضامة اثناء الانسمام بين براعم أو التزام pericytes بعد تشكيل الشعرية. أيضا ، فمن الممكن للثقافة مختلف أنواع الخلايا الأخرى داخل أو ضد مصفوفة خارج الخلية (علي سبيل المثال ، لقد أظهرنا ثقافة الخلايا العصبية والهياكل الظهاريه المختلفة مثل الأنابيب القريبة والأمعاء الصغيرة) ، والتي يمكن الجمع بينها وبين الاوعيه الدموية أسره التي تم إنشاؤها باستخدام هذه الطريقة. وأخيرا ، سيكون من المثير للاهتمام لدراسة تنتشر الوعائية في الهلام المائي الاصطناعية ، كما تكوينها المحدد يزيد من توحيد المقايسة ويسمح توليف صلابة والدوافع ملزمه التي تؤثر علي التفاعلات الخلية مصفوفة.
في الختام ، يظهر هذا الأسلوب جدوى ECs المستمدة من iPSC في اختبار الوعائية ثلاثية الابعاد موحده وقابله للتطوير التي تجمع بين الظروف الثقافية ذات الصلة الفسيولوجية في منصة التي لديها المتانة المطلوبة والقابلية لدمجها داخل البنية التحتية لفحص المخدرات.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وهذا العمل مدعوم جزئيا بمنحه بحثيه من برنامج “مير كيننيس” (المشروع رقم 114022501) الذي أعدته المنظمة الهولندية للبحوث والتنمية في مجال الصحة (ZonMw) ومنحه مؤسسه القلب الهولندية (CVON). اعاده.
Materials
| 0.2-10 μL Electronic repeater pipette | Sigma | Z654566-1EA | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-056 | |
| 3-lane OrganoPlate | Mimetas | 4003-400B | |
| 4% PFA in PBS | Alfa Aesar | J61899 | |
| Basal culture medium | NCardia | ||
| Collagen-1 | Cultrex | 3447-020-01 | |
| Combitips Advanced Biopur 2.5 mL | VWR | 613-2071 | |
| dPBS | Gibco | 14190-094 | |
| Eppendorf Repeater M4 pieptte | VWR | 613-2890 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F4759-1MG | 1 mg/mL in milliQ water |
| HBSS | Gibco | 14025-050 | |
| Hoechst | Molecular Probes | H3569 | 10 mg/mL solution in water |
| iPSC-derived endothelial cells | NCardia | ||
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | 37 g/L in milliQ water |
| OrganoPlate Perfusion Rocker Mini | Mimetas | Rocker platform used to provide flow | |
| Pen/Strep | Sigma | P4333 | |
| Phalloidin | Sigma | P1951 | 1 mg/mL in DMSO |
| PMA | Focus-Biomolecules | 10-2165 | 2 μg/mL in PBS containing 0.1% DMSO |
| S1P | Ecehelon Biosciences | S-2000 | 1 mM in methanol containing 1% acetic acid |
| TRITC-albumin | Invitrogen | A34786 | |
| VEGF | Peprotech | 450-32-10 | 50 μg/mL in water containing 0.1% BSA |
References
- Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).
- Davis, G. E., et al. Control of vascular tube morphogenesis and maturation in 3D extracellular matrices by endothelial cells and pericytes. Methods in Molecular Biology. , 17-28 (2013).
- Kim, S., Chung, M., Jeon, N. L. Three-dimensional biomimetic model to reconstitute sprouting lymphangiogenesis in vitro. Biomaterials. 78, 115-128 (2016).
- Kim, C., Kasuya, J., Jeon, J., Chung, S., Kamm, R. D. A quantitative microfluidic angiogenesis screen for studying anti-angiogenic therapeutic drugs. Lab Chip. 15 (1), 301-310 (2015).
- Kim, J., et al. Engineering of a Biomimetic Pericyte-Covered 3D Microvascular Network. PLoS One. 10 (7), e0133880 (2015).
- Tourovskaia, A., Fauver, M., Kramer, G., Simonson, S., Neumann, T. Tissue-engineered microenvironment systems for modeling human vasculature. Experimental biology and medicine. 239 (9), 1264-1271 (2014).
- Junaid, A., Mashaghi, A., Hankemeier, T., Vulto, P. An end-user perspective on Organ-on-a-Chip: Assays and usability aspects. Current Opinion in Biomedical Engineering. 1, 15-22 (2017).
- Pagano, G., et al. Optimizing design and fabrication of microfluidic devices for cell cultures: An effective approach to control cell microenvironment in three dimensions. Biomicrofluidics. 8 (4), 046503 (2014).
- Berthier, E., Young, E. W., Beebe, D. Engineers are from PDMS-land, Biologists are from Polystyrenia. Lab Chip. 12 (7), 1224-1237 (2012).
- Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425 (2018).
- Dejana, E., Hirschi, K. K., Simons, M. The molecular basis of endothelial cell plasticity. Nature Communications. 8, 14361 (2017).
- Geraghty, R. J., et al. Guidelines for the use of cell lines in biomedical research. British Journal of Cancer. 111 (6), 1021-1046 (2014).
- Passier, R., Orlova, V., Mummery, C. Complex Tissue and Disease Modeling using hiPSCs. Cell Stem Cell. 18 (3), 309-321 (2016).
- van Duinen, V., et al. Perfused 3D angiogenic sprouting in a high-throughput in vitro platform. Angiogenesis. 22 (1), 157-165 (2019).
- Wevers, N. R., et al. A perfused human blood-brain barrier on-a-chip for high-throughput assessment of barrier function and antibody transport. Fluids Barriers CNS. 15 (1), 23 (2018).
