Modelo robusto induzido por ligadura de periodontite de murine para a avaliação de neutrófilos orais

A doença periodontal (DP) é uma condição osteolítica associada à morbidade hospedeira significativa e carga econômica, que se manifesta pela inflamação gingival e perda de apego de tecidos moles e suporte osseoso para a dentição afetada^1,2,3,4. Este processo é regido por interações entre a microbiota oral e o sistema imunológico inato do hospedeiro. Também está associada à exacerbação de outras doenças inflamatórias sistêmicas, incluindo diabetes, doenças cardiovasculares e câncer^5,6,7,8. Historicamente, foi a hipótese de que a patogênese pd é dependente de grandes quantidades de bactérias específicas, como Porphyromonas gingivalis⁹. No entanto, evidências recentes sugerem que o componente microbiano da DP é mediado pelo biofilme odontológico. O biofilme é uma comunidade organizada e complexa de inúmeros microrganismos que podem existir em estados disbióticos e disbióticos saudáveis^10,11. O biofilme oral normalmente oferece resistência ao hospedeiro, impedindo o estabelecimento de focos de bactérias patogênicas e promove a estrutura e função ideal do tecido gingival através da regulação da resposta imune do hospedeiro^12,13. Perturbações da relação equilibrious entre organismos comensal dentro da cavidade oral e do sistema imunológico hospedeiro podem levar a alterações na homeostase tecidual, resultando em disbacteriose e desenvolvimento das aparências clínicas e radiográficas de marca registrada de PD^{5,10,12,13,14}.

Curiosamente, o estabelecimento de uma disbacteriose oral, embora necessária para o início da DP, não é suficiente para conduzir a DP em todos os indivíduos, iludindo-se para a capacidade da resposta imune do hospedeiro para subverter a transição da microbiota entre os estados simbióticos e disbióticos¹⁵. Isso coloca um foco particular sobre os meios através dos quais a DP influencia um dos personagens principais do sistema imunológico inato, ou seja, o granulocito polimorfóide (PMN), ou neutrófilo, a partir de perspectivas locais e sistêmicas^16,17.

Em seres humanos, PMNs são recrutados a partir da circulação a uma taxa de ~ 2 x 10⁶ células / h em tecidos conectivos periodontais saudáveis, onde são a população de leukócitos predomáveis. Aqui, eles são posteriormente expulsos do sulco gingival na cavidade oral como um componente do líquido crevicular gingival. Na presença de DP, a neufilia se manifesta dentro da circulação e da cavidade oral, onde essas células efetoras possuem um fenótipo hiperinflamatório que leva à destruição acima mencionada do periodontium^{17,18,19,20,21,22}. Portanto, entender o papel das PMNs na DP e em outras condições inflamatórias sistêmicas é de extrema importância.

Embora seja amplamente aceito que as doenças crônicas estejam reciprocamente ligadas à DP, os mecanismos subjacentes ainda não foram elucidados, contribuindo para dificuldades na gestão dessas condições sistêmicas mórbidas e potencialmente fatais. Vários modelos animais experimentais, cada um com vantagens e desvantagens únicas, têm sido utilizados para estudar a fisiopatologia da DP^23,24. Concentrando-se especificamente em modelos de urina, há uma variedade de protocolos através dos quais o estudo da DP é facilitado; no entanto, possuem várias deficiências técnicas e fisiométricas^{25,26,27,28,29,30,31}.

Primeiro, o modelo oral do rato do gavage exige inoculations orais numerosos de micróbios patogénicos periodontais humanos para gerar a inflamação do gingival e a perda do osso. Além disso, é geralmente precedido por um período de tratamento antibiótico para subverter a flora oral murine commensal²⁵. Este modelo muitas vezes requer treinamento especializado para realizar com segurança o gavage oral, usa apenas uma pequena fração de patógenos periodontais do microbioma oral humano mais complexo e requer vários meses para estabelecer a perda de ossos alveolares.

Em contraste, modelos de urina quimicamente induzida utilizam a entrega oral de ácido sulfonic trinitrobenzene (TNBS) ou sódio de sulfato dextran (DSS), agentes comumente usados no estabelecimento de modelos de colite murina durante um período de vários meses para induzir a perda de ossos periodontais²⁶. Modelos à base de abscesso intraoral e extraoral estão disponíveis, que envolvem os incisivos e tecidos de urina do dorsum, bem como calvarium, respectivamente. No antigo modelo abscesso, várias injeções de bactérias são administradas, criando múltiplos abcessos gingival e uma escassez de perda óssea alveolar, limitando seu uso no estudo da DP. Os últimos modelos de abscesso são significativamente mais aptos a estudar a virulência bacteriana, inflamação e resorção óssea em locais fora da cavidade oral, o que elimina a avaliação do periodontium e microbioma oral^{27,28,29,30,31}.

Usando o modelo de periodontite induzido por ligadura, uma sutura de seda trançada tem sido comumente instalada circunferentemente em torno do segundo molar. Como alternativa, um único segmento linear de material de sutura pode ser inserido entre o primeiro e o segundo molares^32,33. O objetivo da colocação da ligadura é facilitar o acúmulo bacteriano e gerar disbiose dentro dos sulci de gingival, resultando na inflamação do tecido periodontal e na destruição dos tecidos que compõem o periodontium. Mais notavelmente, este modelo é capaz de produzir significativamente mais perda óssea alveolar em comparação com o modelo de gavage oral³⁴mais comumente usado. Complicando ainda mais o uso do modelo de gavage oral é a resistência natural por várias cepas de camundongos (ou seja, C57BL/6) ao desenvolvimento de perda óssea alveolar. Isso também é problemático, pois esta cepa é a mais utilizada na pesquisa animal baseada em urina^35.

Os procedimentos existentes descritos por Marchesan et al. e Abe e Hajishengallis foram concebidos para simplificar o ato técnico de colocar a ligadura^33,36. Infelizmente, o protocolo anterior requer equipamentos especializados impressos em 3D e possuem o potencial de perda de ligadura prematura, aumentando assim o uso de animais e os custos associados ao tempo adicional gasto na sala de cirurgia. Além disso, ambos os protocolos geram apenas pequenas regiões do periodontium doente disponíveis para um estudo.

As vantagens que se encontram com esta técnica baseiam-se no estudo simultâneo da disbiose oral e imunologia que regem o periodontium, utilização de animais de baixo custo com diversas origens genéticas e práticas simples de habitação e pecuária. Como tal, os objetivos devem ser maximizar os volumes de tecidos doentes e, na tentativa de praticar os princípios de redução da pesquisa animal, reduzir o consumo animal a um nível tão baixo quanto possível. Isso requer garantir que todos os animais sejam capazes de serem incluídos nas análises experimentais^37. No entanto, deve-se notar que não importa qual modelo animal de doença periodontal é utilizado, não há um único modelo que abrange todos os elementos da fisiopatologia da DP humana.

Este novo protocolo emprega a colocação de uma ligadura em torno de vários dentes molar maxiares usando instrumentação e materiais que são encontrados na maioria dos laboratórios. Permite uma quantidade de tempo suficiente instalar facilmente e confiàvelmente uma ligadura que seja pouco susceptível de avulse prematuramente. Finalmente, à medida que as PMNs coordenam a destruição do periodontium em PD, também é apresentada uma nova metodologia para recuperar neutrófilos orais de forma análoga aos seres humanos.