mRNAエレクトロポレーションを用いて鳥類胚における複数のタンパク質の迅速かつ効率的な発現

エレクトロポレーションは、電気パルスを使用してプラズマ膜内に一時的な細孔を作り出し、核酸や化学物質などの物質がサイトソールに入り込むことを可能にする物理的なトランスフェクション方法です。エレクトロポレーションは、細菌、酵母、植物、および哺乳動物細胞1、2、3にDNAを提供するために広く使用^{されています。}これは、発達中の鳥胚内の標的細胞および組織に遺伝的ペイロードを導入するために日常的に使用され、細胞4、5、6、細胞の集団の遺伝子制御または標識移動の遺伝子制御を研究する。 ⁷.しかし、DNAエレクトロポレーション8にはいくつかの実験的な制限も存在する。例えば、DNAエレクトロポレーションは、多くの場合、細胞あたりの発現ベクターの非常に可変数を導入し、その後、それらがコードするmRNAとタンパク質を導入します。この変動性は、画像解析とデータ解釈9、10の両方を複雑にするかなりの細胞細胞の不均一性につながる可能性があります。さらに、DNAエレクトロポレーションからのタンパク質は、エレクトロポレーション後3時間しか発現し始め、12時間まで細胞数と蛍光強度の最大効率に達せず、核への転移に要する時間が原因で完了する可能性が高い。生体内11の転写と翻訳の両方.

対照的に、mRNAトランスフェクションは、マイクロインジェクション12、13によるキセノプス・レービス卵母細胞、mRNAリポフェクタミントランスフェクション14によるヒト幹細胞の再プログラミングを含む様々なモデルシステムで効果的に使用されている。、成体^マウス15における再石灰性神経幹細胞を電気的にする。我々は、異なる蛍光タンパク質(GP)をコードするインビトロ合成mRNAを用いて、初期の鳥類胚発生時に細胞を効率的に標識するmRNAエレクトロポレーションの能力を試験した。我々の研究では、キセノプスおよびゼブラフィッシュ胚のタンパク質を発現するために一般的に使用される多目的発現ベクターであるpCS2+ベクターを用いて使用した。pCS2+におけるSP6およびT7 RNAポリメラーゼプロモーターは、インビトロ転写/翻訳システムで使用した場合、任意のクローン遺伝子からのmRNAおよびタンパク質の合成を可能にします。

ここでは、mRNAエレクトロポレーションにより、ウズラ胚のガストレーションにおける蛍光タンパク質(GP)の迅速かつ効率的な発現が可能であることを実証する。我々は、これらの研究で使用される発現ベクターの多くを設計し、生成した。例えば、LifeAct-eGFP^遺伝子16をpCS2+ベ^クター17にサブクローニングし、CMVプロモーターおよびSP6プロモーターから発現した。挿入された遺伝子は、SP6プロモーターの下流にあり、SV40ポリ(A)^テール18の上流にある。mRNAとDNAと共にエレクトロポレートされた胚では、インビトロ転写されたmRNAからコードされた胎児は、最初にエレクトロポレーションの20分以内に検出されたが、DNA発現ベクターからのGPは、核、ゴルジ、および核をコードする複数のmRNAの3時間後にのみ検出された。膜タンパク質は同時に胚にエレクトロポレートされ、個々の細胞内の複数のタンパク質の迅速かつ効率的な発現をもたらす。最後に、光漂白(FRAP)アッセイ後の生体内蛍光回収を用いて、電ポレートされたmRNAの大部分が2時間以内に崩壊することを示す。したがって、限られた新しいタンパク質翻訳と組み合わせた高速初期タンパク質産生は、発現の時間的制御が必要な場合にmRNAエレクトロポレーションを貴重な技術にする。