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Bioengineering

Uma plataforma Microfluídico multicamada para a condução de expressão gênica sem células prolongada

Published: October 06, 2019
doi:
10.3791/59655
, , , , , ,
1Institute for Complex Molecular Systems, Department of Biomedical Engineering, Computational Biology Group,Eindhoven University of Technology, 2Institute for Molecules and Materials,Radboud University, 3Institute of Bioengineering,School of Engineering École Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL)

Summary

Descreve-se o processo de fabricação de um dispositivo microfluídico baseado em PDMS, multicamada, que permite a realização de reações in vitro de transcrição e tradução (IVTT) durante períodos prolongados. Além disso, uma visão geral abrangente do hardware e software necessários para automatizar e manter essas reações para durações prolongadas é fornecida.

Abstract

As limitações da biologia sintética Cell-Based estão tornando-se cada vez mais aparentes enquanto os investigadores visam desenvolver circuitos reguladores genéticos sintéticos maiores e mais complexos. A análise das redes reguladoras genéticas sintéticas in vivo é demorada e sofre de falta de controle ambiental, com componentes sintéticos exógenos interagindo com processos hospedeiros resultando em comportamento indesejado. Para superar essas questões, a caracterização sem células de novos circuitos está se tornando mais prevalente. As misturas in vitro de transcrição e tradução (IVTT) permitem a regulação do ambiente experimental e podem ser otimizadas para cada sistema único. Os protocolos apresentados aqui detalham a fabricação de um dispositivo microfluídico multicamada que pode ser utilizado para sustentar reações de IVTT para durações prolongadas. Em contraste com as reações em lote, onde os recursos são esgotados ao longo do tempo e (por-) os produtos se acumulam, o uso de dispositivos microfluídico permite a reposição de recursos, bem como a remoção de produtos de reação. Dessa forma, o ambiente celular é emulado pela manutenção de um ambiente fora de equilíbrio em que o comportamento dinâmico dos circuitos de genes pode ser investigado durante longos períodos de tempo. Para explorar plenamente o dispositivo microfluídico multicamada, hardware e software foram integrados para automatizar as reações de IVTT. Ao combinar as reações do IVTT com a plataforma microfluíica aqui apresentada, torna-se possível analisar de forma abrangente comportamentos de rede complexos, promovendo a compreensão dos mecanismos que regulam os processos celulares.

Introduction

As células são capazes de perceber e responder ao seu ambiente usando complexas redes reguladoras dinâmicas1,2. O campo da biologia sintética utiliza nosso conhecimento dos componentes que ocorrem naturalmente compreendendo essas redes para projetar sistemas biológicos que podem ampliar a funcionalidade das células3,4. Inversamente, também é possível aprofundar a nossa compreensão das redes naturais que regem a vida através da concepção simplificada, análogos sintéticos de circuitos existentes ou por sistemas biológicos de engenharia de encaminhamento que exibem comportamentos que ocorrem naturalmente. A engenharia de de novo de tais sistemas biológicos é executada em uma forma bottom-up onde os circuitos genéticos novos ou as vias de sinalização são projetados em uma maneira racional, usando as peças bem definidas5,6. A combinação do design racional das redes com o projeto de sistemas biologicamente relevantes possibilita a caracterização e o estudo em profundidade de sistemas reguladores biológicos com vários níveis de abstração7.

As obras pioneiras de Elowitz e Leibler8 e Gardner et al.9 foram as primeiras a demonstrar a introdução bem-sucedida de redes genéticas sintéticas em hospedeiros celulares. Na década seguinte, numerosos pesquisadores continuaram a desenvolver esses sucessos iniciais, apesar do surgimento de várias limitações em relação à introdução de circuitos sintéticos nas células7,10,11 ,12. Idealmente, a introdução de circuitos sintéticos em hospedeiros celulares deve ocorrer de forma modular. Infelizmente, a complexidade do ambiente celular torna isso particularmente desafiador, com a função de muitas partes e redes sendo altamente dependentes do contexto12,13,14. Como resultado, as redes muitas vezes experimentam interações indesejadas com componentry hospedeiro nativo que pode afetar a função do circuito sintético. Da mesma forma, os componentes da rede exógena podem inibir os processos de acolhimento, competir por recursos compartilhados dentro do hospedeiro e influenciar acinética de crescimento15,16,17. Consequentemente, a fim de projetar e prever racionalmente o comportamento das redes sintéticas em um ambiente in vivo, é necessário um modelo abrangente de todas as dinâmicas de acolhimento e de circuitos específicos18.

Uma alternativa viável ao uso de hospedeiros celulares para a caracterização de redes sintéticas é a aplicação de tecnologias in vitro de transcrição e tradução (IVTT). Atuando como testbed para redes sintéticas, as reações são realizadas em soluções que compreendem todos os componentes necessários para possibilitar a expressão gênica19,20,21. Dessa forma, um ambiente biologicamente relevante, embora artificial, é criado no qual as redes sintéticas podem ser testadas22,23,24,25,26, 27,28. Uma grande vantagem do uso de soluções de IVTT é a capacidade de realizar reações em condições especificadas pelo usuário, com pesquisadores capazes de sintonizar a composição exata de cada reação2. Além disso, a abordagem sem célula permite o teste de alta taxa de transferência de redes sintéticas, uma vez que elimina a necessidade de executar demoradas etapas de clonagem celular. Como resultado, a duração dos ciclos de design-Build-Test sucessivos é significativamente reduzida29,30,31,32. O ciclo de design pode ser ainda mais acelerado através da utilização de técnicas de clonagem livre de células, como o conjunto de Gibson para rapidamente projetar novas redes, e através da construção de redes de modelos de DNA linear que-ao contrário dos plasmímetros necessários para in vivo Testing- pode ser amplificado através de reações em cadeia da polimerase (PCR)33,34.

As reações em lote são o método mais simples pelo qual as reações de IVTT podem ser executadas, exigindo um único vaso de reação em que todos os componentes da reação são combinados35. Tais reações são suficientes para a expressão da proteína e o teste de circuito básico contudo provam insuficiente ao tentar estudar o comportamento dinâmico a longo prazo de uma rede. Ao longo de uma reação em lote, os reagentes são esgotados ou sofrem degradação, resultando em uma diminuição contínua das taxas de transcrição e tradução. Além disso, como as reações progridem subprodutos que podem interferir com-ou inibir completamente-o funcionamento correto da rede. Em última análise, o uso de reatores de lote limita o comportamento dinâmico que pode ser observado, sendo que a regulação negativa é particularmente desafiadora para implementar5,36.

A versatilidade de sistemas de ivtt permite métodos alternativos múltiplos por que as reações prolongadas de ivtt podem ser executadas, variando do fluxo contínuo aos métodos baseados gota assim como umas aproximações mais simples da diálise2,30, 37,38,39,40. A aplicação de dispositivos microfluídico oferece aos usuários maior controle sobre suas reações, aumentando a taxa de transferência e minimizando os custos35,41,42, com cada abordagem específica tendo sua próprias vantagens. O uso do fluxo contínuo pode facilmente ser aperfeiçoado para rendimentos crescentes da expressão entretanto, a inabilidade remover eficazmente produtos específicos da reação faz o estudo do comportamento dinâmico não-trivial39. Embora empregando sistemas microfluídico baseados em gotas permite a triagem de alta produtividade de novas redes, a dificuldade de fornecer reagentes frescos para a reação resulta nas gotas que se assemelham a pequenas reações em lote de volume43. Os reatores à base de diálise permitem a introdução de reagentes frescos, bem como a remoção de alguns produtos de reação no entanto, moléculas de RNA e proteínas maiores se acumulam dentro do reator, sendo muito grande para difundir através dos poros da membrana. Além disso, grandes volumes de reagentes são necessários para sustentar essas reações por períodos prolongados30,44. Em 2013, maerkl et al. apresentaram um dispositivo microfluídico multicamada projetado especificamente para a realização de reações de ivtt prolongadas36,45. O uso de dispositivos microfluídico multicamadas permite o controle direto do fluxo de fluido, permitindo o redirecionamento do fluxo, bem como o isolamento do fluido em regiões específicas do dispositivo46,47. Estas regiões isoladas podem funcionar como câmaras independentes da reação da nanolitro-escala onde as reações de IVTT podem ser executadas. Ao longo de uma única reação de IVTT, injeções periódicas de reagentes frescos no reator são usadas para reabastecer componentes de IVTT e modelos de DNA. Simultaneamente, um volume igual da solução de reação antiga é deslocado, removendo produtos de reação. Desta forma, um ambiente fora de equilíbrio é mantido onde as taxas de transcrição basal e de tradução permanecem em estado estacionário, prolongando a vida útil das reações de IVTT e permitindo que comportamentos dinâmicos ricos ocorram. Aplicando esta abordagem, os pesquisadores são capazes de investigar as taxas cinéticas dos processos individuais que ocorrem dentro de um circuito específico, auxiliando na engenharia para a frente de novas redes genéticas. Por exemplo, Niederholtmeyer et al. implementaram essa abordagem para caracterizar vários elementos de um oscilador de anel genético, determinando as taxas cinéticas dos mesmos36. Em outros estudos, Yelleswarapu et al. mostraram que as taxas cinéticas do fator Sigma 28 (σ28) determinadas em condições de lote foram insuficientes para descrever o comportamento de um oscilador baseado em σ28, e que a adição de dados baseados em fluxo Previsões de modelo melhoradas do comportamento de rede22.

O objetivo deste manuscrito é apresentar um protocolo completo para a fabricação de dispositivos microfluílicos multicamadas capazes de realizar reações de IVTT de longo prazo. Além disso, este manuscrito descreverá todo o hardware e software necessários para realizar reações de IVTT prolongadas. A atuação do dispositivo microfluídico-necessário para controlar o fluxo de fluidos nele-é alcançada usando uma série de Válvulas pneumáticas que se conectam diretamente aos dispositivos microfluílicos através de comprimentos de tubulação. Por sua vez, as válvulas pneumáticas são controladas através de uma interface de controle virtual personalizada. O fluxo de fluido dentro dos dispositivos microfluílicos é conseguido usando a pressão contínua que é fornecida por um sistema de regulação de pressão comercialmente disponível. As reações de IVTT são executadas tipicamente entre 29 ° c e 37 ° c e uma incubadora do microscópio é usada para regular a temperatura durante reações. No entanto, a funcionalidade da mistura IVTT gradualmente se degrada quando armazenada acima de 4 ° c. Como tal, este manuscrito se expandirá no sistema de resfriamento de chip usado para resfriar a mistura de IVTT antes da injeção no dispositivo microfluídico. Em conclusão, este manuscrito fornece uma visão geral abrangente dos procedimentos necessários para realizar com sucesso reações de IVTT prolongadas usando um reator de fluxo microfluídico, de tal forma que outros pesquisadores poderão replicar essa tecnologia com relativa Facilidade.

Protocol

1. preparação da bolacha Nota: nossos protocolos são específicos para o 40 XT positivo fotoresistente e SU8 3050 fotoresistente negativo usado durante esta pesquisa. Os fotorresistentes alternativos podem ser usados, porém as velocidades de rotação específicas, as temperaturas do cozimento, e os tempos do cozimento variarão. O design do dispositivo microfluídico fornecido por Niederholtmeyer et al.36 está ligado na tabela de materiais. Coloque dois wafers de silício limpos (100 mm de diâmetro, orientada, 525 μm de espessura) em um forno pré-aquecido definido para 250 ° c e deixar as bolachas para desidratar durante a noite (~ 16 h).Nota: também é possível Prime os wafers usando deposição de vapor HMDS; no entanto, isso não é necessário se os wafers estão suficientemente desidratados. Retire um wafer de silício do forno e deixe esfriar a temperatura ambiente antes de prosseguir com o revestimento de rotação. Aplique 3-4 ml do fotoresistente de 40 XT ao centro do wafer. Para obter uma altura de recurso de 25 μm aplique o seguinte protocolo de rotação: spin para 20 s a 500 rpm (110 RPM/s), aumente a velocidade de rotação para 3100 rpm (300 RPM/s) e segure aqui por 30 s, e desacelere a bolacha para 0 rpm com uma desaceleração de 200 rpm/s. usando um o tecido do microfiber remove com cuidado toda a perolização da borda que pode ter ocorrido durante o revestimento da rotação. Leve assar usando duas placas de calor separadas para 70 ° c e 120 ° c da seguinte maneira: permitir que a bolacha se sente a 70 ° c por 30 s. Em seguida, transfira a bolacha para a chapa de 120 ° c e deixe-a descansar aqui por 3,5 min antes de devolver a bolacha à chapa de 70 ° c por mais 30 s. Retire a bolacha da placa de cozedura e – evitando choques bruscos de temperatura – deixe arrefecer até à temperatura ambiente. Coloque o Fotomáscara da camada de fluxo (lado da emulsão para baixo) na película do fotoresistente e exponha o Wafer usando uma lâmpada UV até que uma exposição total de 200 MJ/cm2 esteja conseguida. Pós-exposição assar usando duas placas quentes (70 ° c e 105 ° c) da seguinte maneira: permitir que a bolacha para sentar-se a 70 ° c para 20 s antes de transferir a bolacha para a placa de aquecimento 105 ° c e deixá-lo aqui para 40 s. Finalmente retorne a bolacha à placa de fogão de 70 ° c para uns 20 s mais adicionais para terminar o borne-exposição cozem. Permita que a bolacha esfrie à temperatura ambiente em uma pilha de tecidos do microfiber. Desenvolva o Wafer transferindo-o para uma placa de Petri preenchida com 726 desenvolvedor fotoresista do Fumin para iniciar o processo de desenvolvimento. O desenvolvimento é acelerado quando executado em um agitador de bancada e toda a bolacha está submersa no desenvolvedor. Enxague a bolacha com água desmineralizada e use um microscópio estéreo para verificar a superfície da bolacha para qualquer resíduo fotororesista. Se o resíduo fotoresistente pode ser visto, a seguir retorne o Wafer ao colaborador. Reflow o fotoresistente positivo coloc a bolacha em uma placa quente ajustada em 110 ° c por 25 minutos. Este processo resultará em características arredondadas, bem como recozimento qualquer rachaduras que podem ter aparecido durante o processo de fabricação. Prossiga para silanizar o Wafer conforme descrito na etapa 1,17. Retire a segunda bolacha de silício do forno, permitindo-lhe arrefecer até à temperatura ambiente antes de prosseguir com o revestimento de centrifugação. Aplique 5 ml de SU8 3050 fotoresistente ao centro da bolacha. Para obter uma altura de recurso de 30 μm aplicar o seguinte protocolo de rotação: girar para 20 s em 500 rpm (110 RPM/s), aumentar a velocidade de rotação para 4.000 rpm (330 rpm/s) e segure aqui para 42 s, e desacelerar o Wafer para 0 rpm com uma desaceleração de 200 rpm/s. usando um o tecido do microfiber remove com cuidado toda a perolização da borda que pode ter ocorrido durante o revestimento da rotação. Leve cozer usando duas placas quentes separadas (65 ° c e 95 ° c) da seguinte maneira: permita que a bolacha se sente a 65 ° c por 30 s. Em seguida, transfira a bolacha para a chapa de 95 ° c e deixe-a descansar aqui durante 14 minutos antes de devolver a bolacha à chapa de 65 ° c por mais 30 s. Retire a bolacha da placa de cozedura e deixe arrefecer até à temperatura ambiente. Meça a intensidade da lâmpada UV antes da exposição e use-a para determinar a duração da exposição exigida para conseguir uma dosagem total da exposição de 260 mJ/cm2. Coloque a máscara fotográfica (lado da emulsão para baixo) no filme fotorssionista e coloque a bolacha embaixo da fonte de luz UV. Exponha a bolacha usando uma lâmpada UV até que uma exposição total de 260 mJ/cm2 seja conseguida. Pós-exposição assar usando duas placas quentes (65 ° c e 95 ° c) da seguinte maneira: permitir que a bolacha para sentar-se a 65 ° c para 60 s antes de transferir a bolacha para a placa de aquecimento 95 ° c e deixá-lo aqui para 4,5 min. devolva o Wafer à placa de aquecimento de 65 ° c por mais 30 s para completar o cozimento pós-exposição. Permita que a bolacha esfrie à temperatura ambiente em uma pilha de tecidos do microfiber. Desenvolva o Wafer transferindo-o para um prato de Petri preenchido com o foto mrdev-600 para iniciar o processo de desenvolvimento. O desenvolvimento é acelerado quando executado em um agitador de bancada e toda a bolacha está submersa no desenvolvedor. Enxague a bolacha com isopropanol e use um microscópio estéreo para verificar a superfície da bolacha para qualquer resíduo fotororesista. Se o resíduo fotoresistente pode ser visto, a seguir retorne o Wafer ao colaborador. Uma vez que inteiramente desenvolvido, duro cozer o fotoresistente coloc a bolacha em uma placa quente ajustada em 150 ° c por 1 h. Silanize ambos os wafers para impedir a adesão de PDMS durante os processos da macio-litografia. Para realizar a silanização, Pipet 2-3 gotículas (por wafer) do silano em um pequeno frasco de vidro. Coloque este frasco, juntamente com os wafers em um dessecador e puxe o vácuo por 5-10 min. Sele o dessecador e deixe as bolachas vácuo por um período de 12 – 16 h.Cuidado: o silano é tóxico e não deve ser inalado. Tome cuidado para trabalhar em uma capa de fumaça e para usar luvas de nitrilo ao manusear o silano. Isto inclui coloc a bomba de vácuo na capa das emanações ao puxar o vácuo no desiccator. Liberte o aspirador do dessecador e retire os wafers SILANIZADOS. Enxague com água e use um vapor de N2 para secar os wafers. Neste ponto, os wafers podem ser colocados em armazenamento até que seja necessário. 2. microfluidic dispositivo de fabricação Nota: o processo de litografia suave utilizado para fabricar dispositivos microfluílicos multicamadas com base em PDMS pode ser separado em três etapas distintas: 1) a preparação do PDMS tanto das camadas de fluxo quanto de controle, 2) o alinhamento e a colagem das duas camadas PDMS, 3) o conclusão do dispositivo. Preparação do PDMS Prepare duas soluções de precursor PDMS combinando a base e os agentes de cura em uma taça de plástico e usando uma vara de mistura para agitar os dois componentes até que totalmente misturado. A camada de controle requer 20 g de agente de base e 1 g de agente de cura (20:1 ratio). A camada de fluxo requer 40 g do agente de base e 8 g do agente de cura (5:1 ratio). Degas as soluções em um desiccator. Coloque o wafer de camada de fluxo em uma placa de Petri e despeje a mistura de 5:1 PDMS Ratio sobre a bolacha. Degas o PDMS por 30 min para remover as bolhas de ar. Gire o revestimento a bolacha da camada de controle (preparada usando o SU8 3050photoresist negativo) com relação 20:1 PDMS. Despeje 5-10 mL do PDMS para o centro da bolacha e execute o seguinte protocolo de rotação (manter a esquerda sobre PDMS para uso posterior): girar a 500 RPM para 15 s (100rpm/s), aumentar a velocidade de rotação para 1450 RPM (300 RPM/s) para 45 s e, em seguida, desacelere a bolacha para 0 rpm (200 rpm/s). Para assegurar uma espessura de película homogênea de PDMS, coloc o Wafer revestido PDMS em uma superfície nivelada em um prato de Petri fechado (para evitar a contaminação da poeira). Deixe a bolacha sentar-se por 30 min. Retire a camada de fluxo do dessecador e coloque as camadas de fluxo e de controle em um forno (80 ° c). Cure ambas as camadas para 28-30 min e remover quando o PDMS é maleável o suficiente para manipular, enquanto permanecendo ligeiramente pegajoso. Prossiga imediatamente com o processo de alinhamento. Alinhamento e colagem Usando um bisturi, remova cada um dos quatro dispositivos do PDMS no Wafer da camada de fluxo. Ao remover a camada PDMS da bolacha de silício, cubra imediatamente o lado da feição com fita adesiva para evitar a contaminação por partículas de poeira. Alinhe aproximadamente os blocos de camada de fluxo na camada de controle por olho, colocando o lado do recurso do dispositivo em contato com a camada de controle PDMS. Subseqüentemente, faça ajustes finos à posição de cada um dos blocos da camada de fluxo para alinhar os canais da camada de fluxo com os canais da camada de controle, usando um microscópio estereofónico para ajudar na visualização dos ajustes. Aplique pressão para remover os bolsos de ar entre as duas camadas PDMS. Despeje a relação 20:1 restante PDMS salvos anteriormente em torno dos blocos de camada de fluxo alinhados. Coloque 100 g de pesos em cada um dos dispositivos para garantir um contacto suficiente durante o processo de colagem. Retorne os dispositivos alinhados (incluindo os pesos) ao forno do ° c 80 e deixe-os para lig pelo menos 1,5 h e não mais do que 6 h. Terminando o dispositivo Retire a bolacha do forno e extraia cada um dos dispositivos individuais do Wafer da camada de controle, cobrindo o lado do recurso de cada dispositivo com fita adesiva. Iterativamente, perfure um único furo para cada uma das 9 entradas da camada de fluxo, 24 entradas da canaleta da camada de controle, e a única tomada da camada de fluxo de cada dispositivo. Perfure o dispositivo com o lado do recurso voltado para cima, usando uma câmera para garantir que os furos sejam perfurados dentro dos limites da feição. Para cada dispositivo, limpe uma única corrediça do microscópio com isopropanol e acetona e seque as corrediças um córrego de N2. Subseqüentemente, coloc as corrediças do microscópio em uma placa quente ajustada a 150 ° c por 15 minutos. Use o plasma de oxigênio para ligar os dispositivos PDMS às lâminas de vidro, aplicando uma potência de 50 W para 45 s. Certifique-se de que o lado do recurso do dispositivo está virado para cima quando estiver a piscar. Uma vez que termine, coloc o lado da característica do dispositivo para baixo na corrediça de vidro, aplicando a pressão para remover o gás prendido entre as superfícies. Coloc os dispositivos lig em uma placa quente ajustada a 110 ° c para 1 h. os pesos podem ser coloc sobre os dispositivos para melhorar a aderência do dispositivo. 3. configuração de hardware Nota: para obter controle sobre os chips microfluídico, inúmeras peças de hardware precisam ser instaladas e conectadas umas com as outras. Três grupos distintos de ferragem são exigidos: 1) sistema de controlo pneumático para os canais de controle, 2) um regulador de pressão pneumático para controlar o fluxo dos reagentes da reação dentro do dispositivo, e 3) um sistema refrigerando para refrigerar a solução da reação de IVTT antes injeção no dispositivo microfluídico. Uma visão geral da configuração de hardware é fornecida na Figura 1. Deve-se notar que os protocolos aqui fornecidos tentam ser o mais geral possível, no entanto, certas peças específicas de equipamentos utilizados ao longo de nossa pesquisa são referenciadas. Todo o hardware pode ser substituído por alternativas capazes de executar a mesma função. Nesses casos, os protocolos aqui podem ser usados para delinear as etapas gerais necessárias para configurar o sistema e os requisitos de cada um dos componentes. As configurações alternativas de hardware são apresentadas por Brower et al.48 e White e Streets49. Sistema de controle pneumático (veja Figura 2) Usando o protocolo dos fabricantes, estabeleça uma conexão TCP entre o controlador Fieldbus e a estação de trabalho do usuário. Use o software de controle (fornecido como arquivos suplementares) para compor comandos MODBUS que são enviados através da conexão TCP para o controlador, e actuam as válvulas solenóide. Expanda o controlador Fieldbus com oito módulos de saída digital de 4 canais, um para cada válvula solenóide que está sendo usada. Cada válvula de solenóide preside sobre um pino de conexão. Conecte o fio positivo a uma das quatro saídas positivas em um dos módulos de saída digital, enquanto conecta o fio negativo a uma das portas de aterramento dos módulos de saída digital.Nota: para obter o sistema funcione corretamente, os solenóides devem ser conectados sistematicamente, com o primeiro solenóide que está sendo conectado à primeira porta de saída, o segundo solenóide à segunda porta de saída e assim por diante. Em nosso sistema, duas matrizes da válvula são usadas com 8 e 22 válvulas de solenóide respectivamente. As portas de saída 1-8 conectam ao array de 8 válvulas, e as portas de saída 9-30 conectam ao array de 22 válvulas. Conecte ambas as matrizes de válvulas a uma fonte de ar comprimido usando 1/4 “tubulação. Use reguladores de pressão para definir a pressão da matriz de 22 válvulas para 3 bar, e a matriz de 8 válvulas para 1 bar. Regulação da pressão de fluxo (ver Figura 3)Nota: para fluir fluidos através da camada de fluxo do dispositivo microfluídico, um regulador de pressão de 4 portas comercialmente disponível é usado. A pressão de saída de cada porta é regulada através do software fornecido com o controlador de pressão. Conecte o regulador de pressão a um computador usando o conector USB fornecido. Conecte o regulador de pressão a uma fonte de ar comprimido, assegurando-se de que a pressão fornecida não exceda a pressão máxima permitida pelo regulador. Conecte um Luer masculino ao conector da farpa de 3/32 “a cada um dos quatro portos fêmeas da saída do fechamento de Luer do regulador de pressão. Ligue um comprimento de tubagem macia (OD: 3 mm, ID: 1 mm, L: 10 cm) à farpa. Conecte um segundo Luer masculino ao conector da farpa de 3/32 “à extremidade aberta da tubulação macia e prenda isto às portas do conector do reservatório fluido. Use o software fornecido para definir a pressão desejada de cada saída do regulador de fluxo, pressionando os reagentes armazenados dentro dos reservatórios para resultar no fluxo dos reagentes para o dispositivo microfluídico. A conexão dos reservatórios ao dispositivo microfluídico será discutida na seção 4,2. Configuração de resfriamento off-chip (veja a Figura 4) Use a tubulação do PVC (OD: 10 milímetros, identificação: 6 milímetros) para conectar o sistema de água-refrigerando ao bloco de água da frio-placa usando encaixes da compressão. Encha o reservatório de fluido do sistema de resfriamento de água com um refrigerante e incline suavemente a unidade para deslocar qualquer ar aprisionado, adicionando continuamente refrigerante ao reservatório para garantir que ele permaneça cheio. Quando todo o gás é retirado do sistema, encha o reservatório para aproximadamente 90-95% do seu volume máximo. Tubulação de PTFE da bobina (OD: 0, 42 “, identificação: 0, 22”) na cara fria do elemento de Peltier e prenda isto com fita. Assegure-se de que uma extremidade do tubo de PTFE esteja conectada aos reservatórios do sistema de controle de pressão da camada de fluxo (conforme descrito na seção 4,3). A outra extremidade da tubulação de PTFE deve projetar-se não mais de 1 cm da superfície de Peltier. Insira um comprimento de 5 – 10 cm de tubo PEEK (OD: 0,794 mm, ID: 0,127 mm) na extremidade saliente da tubagem de PTFE. O enchimento da tubulação e a conexão ao dispositivo microfluídicos são explicados mais mais na seção 4,3. Coloque a face quente do elemento Peltier na chapa fria do bloco de água, aplicando um composto térmico suficiente às duas faces. Assegure-se de que o tubo, o elemento de Peltier, e o bloco refrigerando estejam no contato direto um com o outro em todas as vezes. Ligue o elemento Peltier ao controlador de temperatura (através de um conector de barramento serial), de tal forma que a tensão fornecida ao Peltier pode ser regulada. Coloc firmemente um termistor na superfície de Peltier, conectando a saída ao controlador de temperatura. Depois de ligar o refrigerador de água, adapte a tensão fornecida ao Peltier até que a temperatura esteja estável a 4 ° c.Nota: com esta configuração, a temperatura de Peltier é controlada manualmente adaptando a tensão fornecida, quando o termistor servir somente para monitorar a temperatura. 4. preparando um experimento Observação: antes de iniciar um experimento, o dispositivo microfluídico deve ser preparado e os reagentes de reação devem ser inseridos no tubo correto para injeção no dispositivo. Esta seção discutirá: 1) a conexão da tubulação do canal de controle ao dispositivo, 2) a conexão de reagentes uncooled do entrada ao dispositivo, e 3) a conexão de reagentes refrigerados do entrada ao dispositivo. Conectando a tubulação do canal de controle Para cada um dos canais de controle do dispositivo microfluídico, corte um comprimento de tubulação (OD: 0, 6 “, ID: 0, 2”). Em uma extremidade, insira o pino de um 23 G, 1/2 “Luer stub e no outro inserir um pino de conexão de aço inoxidável (OD: 0,65 mm, ID: 0,35 mm, L: 8 mm). Conecte o stub de Luer a um Luer masculino a 3/32 “conector de nylon da farpa. Insira a farpa do conector em um comprimento de tubos de poliuretano (OD: 4 mm, ID: 2,5 mm). Insira esta tubagem de poliuretano directamente numa das válvulas solenóide. Anexar um 23 G, 1/2 “Luer stub a uma seringa e inseri-lo em um curto (3-4 cm) pedaço de tubo (OD: 0, 6”, ID: 0, 2 “). Coloque a extremidade aberta deste tubo em um reservatório de água ultrapura e encha a seringa com água ultrapura. Número de cada canal de controle do dispositivo microfluídico, como mostrado na Figura 5. Para cada canal (excluindo os canais de controle de 1 a 3, que não são preenchidos com água), encontre o tubo correspondente (conectado às válvulas solenóides) e insira um pino metálico na extremidade aberta do tubo anexado à seringa. Injete água na tubagem do canal de controlo até que a metade do comprimento tenha sido preenchida. Desconecte o tubo da seringa e insira o pino do conector de aço inoxidável no orifício correspondente do dispositivo microfluídico. Repita para todos os canais de controle. Use a interface de controle para abrir todas as válvulas solenóide. Isto irá pressurizar o fluido dentro da tubulação do canal de controle, forçando-o no dispositivo microfluídico e fechando todas as válvulas com base em membrana dentro do dispositivo. Um exemplo de membranas abertas e fechadas dentro do dispositivo é dado na Figura 6. Ligar os reagentes não arrefecidos ao dispositivo Para cada um dos reagentes não arrefecidos, corte um comprimento de tubagem (OD: 0, 6 “, ID: 0, 2”) para ligar a saída do reservatório às entradas do dispositivo microfluídico. Tome uma extremidade do tubo e insira-a no reservatório, assegurando que a tubagem atinja a base do reservatório. A saída da tubulação do reservatório deve ser apertada de tal forma que um selo de ar apertado é alcançado. Insira um pino de conexão de aço inoxidável (OD: 0,65 mm, ID: 0,35 mm, L: 8 mm) na extremidade aberta da tubulação. Anexar um 23 G, 1/2 “Luer stub para o final de uma pequena (1 mL) seringa. Adicione um comprimento curto da tubulação (OD: 0, 6 “, ID: 0, 2”) ao stub de Luer. Colocando a extremidade do tubo na solução de reagente desejada, encha a seringa com o reagente. Insira o pino do conector de aço inoxidável na tubagem de poliuretano conectada à seringa e encha o tubo com o reagente. Ao usar pequenos volumes de reação, o reagente não entrará no reservatório, e o próprio tubo atuará como o reservatório. Desconecte a seringa e insira o pino do conector em um dos orifícios de entrada da camada de fluxo do dispositivo microfluídico. Aplique pressão a cada um dos reservatórios utilizando o software regulador de pressão para forçar os reagentes no dispositivo microfluídico. Conexão de fluidos resfriados ao dispositivo microfluídico Certifique-se de que o resfriador de água e o elemento Peltier foram ativados, com a temperatura da superfície do Peltier definido como 4 ° c. Monte a configuração de resfriamento o mais próximo possível do dispositivo microfluídico, minimizando o volume não arrefecido entre o Peltier e a entrada do dispositivo. Conecte a extremidade aberta da tubulação de PTFE à tubulação conectada a um dos reservatórios fluidos (conforme descrito na seção 4,2) usando um pino de conector de aço inoxidável (OD: 0,65 mm, ID: 0,35 mm, L: 8 mm). Conecte uma pequena seringa (1 mL) a um stub Luer (23 G, 1/2 “) com um comprimento curto de tubulação (OD: 0, 6”, ID: 0, 2 “) anexado ao final. Encha a seringa com o reagente a ser resfriado (aqui, a solução de reação de IVTT). Ligue a tubagem PEEK à seringa através da tubagem Conectiva e aplique pressão constante na seringa, forçando o reagente através da tubagem PEEK e na tubagem PTFE. Desconecte o tubo PEEK da seringa e insira-o diretamente em uma das entradas do canal de fluxo do dispositivo microfluídico. Quando a pressão é aplicada através do software do regulador de pressão o reagente de refrigeração será forçado no dispositivo microfluídicos. 5. experimentação Nota: antes de realizar experimentos, todas as conexões de hardware e tubulação detalhadas nos protocolos seções 3 e 4 devem ser concluídas, e todos os reagentes devem ser conectados ao dispositivo. O procedimento experimental pode então ser dividido em quatro partes distintas: 1) o carregamento do dispositivo microfluídico, 2) preparando o microscópio, 3) a calibração do dispositivo, e 4) realizando o experimento. A interface de controle virtual personalizada (veja a Figura 7) usada em toda esta pesquisa é fornecida como um recurso suplementar através da lista de materiais) Carregando o dispositivo microfluídico Coloc o dispositivo microfluídicos, com toda a tubulação do controle e da camada do fluxo unida no estágio do microscópio e fecha todas as aberturas na incubadora. Defina a temperatura ambiente da incubadora para 29 ° c. Certifique-se de que o sistema de arrefecimento foi ligado e está definido para 4 ° c antes de iniciar o experimento. Assegure-se de que todos os canais de fluxo e controle sejam pressurizados. Definir a pressão dos canais de controle 1-3 em 1 bar, e Pressurizar os canais de controle 9-29 em 3 bar. Os reagentes exigem uma pressão de entre 20 e 100 mbar a ser aplicado aos reservatórios fluidos usando o software regulador de pressão. Retire o ar do dispositivo microfluídico utilizando um dos reagentes. Feche a saída do dispositivo (pressurizar o canal de controle 29) e, simultaneamente, Despressurize os canais de controle 1-3 e 15-28. Em seguida, Despressurize seletivamente os canais de controle do Multiplexador para permitir que o reagente selecionado flua no dispositivo. Use o microscópio para monitorar a remoção do ar.Nota: no caso de os reagentes não estarem a carregar correctamente o dispositivo, ou se as bolhas de ar não estiverem a ser removidas, a pressão pode ser aumentada até 350 mbar. Assegure-se de que todos os reagentes fluam corretamente, sem introduzir ar-usando a função nivelada no software de controle. O monitoramento do fluxo de fluido pode ser simplificado carregando primeiro um fluoróforo e monitorando seu deslocamento por reagentes individuais. Preparando o microscópio Usando o microscópio, localize quaisquer pontos de interesse (um único ponto dentro de cada reator é suficiente) dentro do dispositivo microfluídico, e guarde as suas coordenadas. Estes pontos serão fotografados durante a calibração e os processos experimentais.Nota: durante a calibração e os procedimentos experimentais incluídos dentro do software de controle, o microscópio é instruído para capturar periodicamente imagens nas coordenadas previamente armazenadas. Para conseguir isso, o software de controle se comunica com o software do microscópio, informando-o para gravar novas imagens. Esta comunicação é única para cada configuração de microscópio e, como tal, essa funcionalidade foi modificada dentro da interface de software fornecida. Fornecido é um executável fictício, que pode ser modificado pelo usuário final para compatibilidade com seu próprio sistema de microscópio. Calibrando o dispositivo microfluídico Determine o volume de fluido deslocado de cada reator durante uma única etapa de entrada (sequência de bomba fornecida por canais de controle de acionamento peristalticamente 15-17, compreendendo 6 comandos MODBUS executados sequencialmente), executando o protocolo de calibração fornecido no pacote de software. Defina os seguintes campos de dados dentro do software de controle: canal de buffer de eluição, canal de fluorophore, número de ciclos de diluição (o padrão é 10 diluições), número de passos de entrada (o padrão é 15 etapas), número de ciclos de mistura (o padrão é 4 ciclos), e o tempo entre ciclos de mistura (o padrão é 0 segundos). Inicie a calibração pressionando executar experimento de calibração.Nota: durante o processo de calibração, todos os reatores são preenchidos com um fluoróforo e as imagens são gravadas. Subseqüentemente, uma série de diluições é executada onde um eluente é medido nos reatores (baseado no número ajustado de etapas do entrada), deslocando assim o fluorophore. Depois de misturar completamente, novas imagens são tiradas. Este processo repete-se para o número definido de ciclos de diluição. Após a conclusão da calibração, siga os passos apresentados pelo software de controle, completando a análise do experimento de calibração.Nota: a análise fornecerá aos usuários a razão de atualização para cada reator com base na diminuição da fluorescência registrada durante cada ciclode diluição . Esse valor indica a fração do volume do reator deslocado pelo número definido de etapas de entrada . Por sua vez, esse valor será usado durante experimentos para determinar quantas etapas de entrada são necessárias para deslocar um volume de reator específico. Realizando o experimento Defina os valores necessários para o experimento desejado dentro da interface de controle virtual. Crítico é a fração de atualização [%] que determina o volume do reator deslocado por ciclo experimental e deve ser fixado entre 15 e 40%.Observação: o protocolo experimental específico determinará quais campos da interface de controle devem ser definidos antes do início do experimento. Alguns códigos menores serão necessários para adaptar a interface de controle para novos experimentos. Inicie o protocolo experimental pressionando o botão executar experimento na interface de controle.Nota: inalterado, o software fornecido inicia uma expressão de proteína simples. Os reatores 1 e 8 são utilizados como controles, enquanto os reatores 2-7 casa experimentos idênticos. Aqui, 75% do volume do reator compreende a solução de ivtt, e 25% é água ultrapura ou uma solução linear do ADN de 2,5 nanômetro. As diluições ocorrem a cada 15 minutos, com 30% do volume do reator sendo deslocado por diluição. As imagens são gravadas no final de cada ciclo de diluição. 6. análise de dados Nota: foram fornecidos scripts para a análise das imagens (ver ficheiros suplementares ou a tabela de materiais), fazendo uso do pacote de análise ‘ bfopen ‘ , que é necessário para a revisão dos ficheiros ‘. ND2’ (fornecidos pela nossa configuração do microscópio). Execute o script de análise ‘Calibrationscript. m’ e, uma vez solicitado, selecione o arquivo ‘. ND2’ desejado. Uma única imagem do reator será mostrada com que a intensidade correta da imagem pode ser determinada. Use o controle deslizante para otimizar a intensidade da imagem de forma que as bordas do canal microfluídico sejam claramente visíveis. Uma imagem do reator será mostrada. Dentro desta imagem, selecione uma área dentro do canal do reator de que a intensidade da fluorescência deve ser determinada.Nota: a intensidade de fluorescência de cada reator, para cada imagem gravada será determinada com os resultados exibidos em um gráfico simples, permitindo a visualização dos resultados.

Representative Results

Para demonstrar a eficácia da plataforma microfluídico multicamada para a condução de experimentos de IVTT, a configuração descrita foi utilizada para expressar a proteína deGFP. O experimento foi conduzido em uma mistura de30 ivtt reação comercialmente disponível-compreendendo toda a transcrição necessária e a tradução componentry-suplementada com substratos de reação e modelos de DNA. Os experimentos foram conduzidos a uma temperatura de 29 ° c; uma temperatura encontrada para ser ideal para a expressão IVTT de proteínas. O dispositivo microfluídico possui nove entradas exclusivas, das quais quatro foram utilizadas durante este experimento. A primeira continha a mistura de reação de IVTT comercialmente obtida. A mistura da reação de ivtt acomoda todos os componentes exigidos para expressar com sucesso proteínas entretanto, os Gams purified foram adicionados à mistura da reação-em uma concentração final de 1,3 μm-antes do carregamento no dispositivo microfluídicos. A adição da proteína GamS serve para minimizar a degradação de espécies de DNA lineares ao realizar os experimentos. Crucialmente, a mistura de IVTT foi injetada em tubos de politetrafluoroetileno (PTFE) enrolados em um elemento Peltier com uma temperatura superficial de 4 ° c para resfriar a solução antes da injeção do mesmo no dispositivo microfluídico; evitar a degradação da solução de reacção antes da sua utilização. A tubulação do éter cetona do poliéter do micro-furo (auge) foi usada para conectar a tubulação de PTFE que sae da superfície do elemento de Peltier com o dispositivo microfluídicos, reduzindo o volume da mistura da reação de ivtt que não está sendo refrigerada. A segunda solução introduzida no dispositivo continha a codificação linear do modelo do ADN para o degfp-dissolvido na água ultrapura-em uma concentração de 10 nanômetro. A terceira solução, água ultrapura, serviu múltiplos propósitos durante os procedimentos experimentais. Principalmente, a água ultrapura foi utilizada para garantir que o volume deslocado por diluição fosse igual para todos os reatores, atuando como substituto para o DNA nas reações de controle. Adicionalmente, a água ultrapura foi usada igualmente para diluir o fluoróforo durante a calibração do dispositivo e para liberar o volume inoperante do dispositivo ao comutar entre reagentes. A solução final introduzida no dispositivo era uma solução purificada de FITC-Dextran (25 μM) exigida para executar a calibração inicial do dispositivo. As soluções de DNA, água e fluoróforo foram injetadas em tubos (0, 2 “ID, 0, 6” OD), que posteriormente poderiam ser inseridos em um dos canais de entrada do dispositivo microfluídico, conforme a seção 4,2 dos protocolos. Como tal, essas soluções foram armazenadas a 29 ° c para a totalidade dos experimentos. A atuação dos canais de controle do dispositivo microfluídico é alcançada através de um software de controle personalizado, onde cada um dos canais de controle pode ser acionado individualmente. A execução de reações de IVTT prolongadas não pode ser conseguida através deste processo manual e exige o uso de protocolos automatizados incorporados dentro do software de controle. Ao preparar um dispositivo microfluídico para experimentos, protocolos automatizados semelhantes podem ser utilizados para executar uma série de processos úteis: o rubor do volume do dispositivo morto com um novo reagente, a mistura dos reagentes dentro do reator do anel, e o carregamento de um novo reagente no reator, enquanto deslocando um volume igual da solução atual. Além, dois processos complexos estão disponíveis: a condução de uma calibração do dispositivo, e a execução de uma expressão Cell-Free prolongada da proteína. Todos os processos acima mencionados podem ser facilmente executados a partir da interface principal, juntamente com a capacidade de configurar vários parâmetros para variar as configurações específicas do processo, como o canal de entrada, o volume de entrada e a duração da mistura. Devido às flutuações na pressão e nas imperfeições durante a fabricação microfluídicos do dispositivo, o volume de líquido deslocado durante um único ciclo da injeção pode variar entre dispositivos. Como tal, antes de realizar experimentos com IVTT, determinou-se o volume do reator deslocado por ciclo de injeção (fração Refresh). Esta calibração exige o enchimento de todos os oito reatores com uma solução fluorescente da referência. Neste caso, foi utilizada uma solução FITC-Dextran purificada (25 μM). Subsequentemente, os reatores são diluídos 10 vezes com água ultrapura. Medindo-se a diminuição da fluorescência por ciclo de diluição para cada reator, determinou-se o volume de fluido deslocado durante um único ciclo de injeção. Dentro do software de controle, esse valor (a taxa de atualização) foi gravado para uso durante o experimento ivtt. Crucialmente, para dar conta de variações na taxa de fluxo em todo o dispositivo, bem como discrepâncias nos volumes individuais do reator, a taxa de atualização é determinada e armazenada para cada reator individual. A sequência de enchimento e diluição dos reatores foi realizada automaticamente utilizando o programa de calibração perform que faz parte do software de controle. Os resultados do experimento de calibração são mostrados na Figura 8. O processo pré-programado mais complexo executa um experimento IVTT de longa duração, permitindo que os usuários iniciem o experimento e, subsequentemente, permitam que ele opere sem supervisão até a conclusão. Ao longo do experimento, os reatores 1 e 5 foram utilizados como espaços vazios, sendo que apenas a água foi adicionada aos reatores durante as diluições. Os reatores 2 e 6 foram utilizados como controles negativos e continham apenas solução de reação de IVTT e água ultrapura. Os reatores restantes (3, 4, 7, e 8) continham as soluções da reação de IVTT e 2,5 nanômetro da codificação linear do ADN para o gene do deGFP. A inicialização dos reatores é conseguida enchendo inteiramente todos os reatores (excluindo 1 e 5) com a solução da reação de ivtt, antes que 25% do volume do reator fosse deslocado com água ultrapura. A seguir, iniciou-se a injeção periódica de reagentes nos reatores. O experimento foi conduzido de forma que novos reagentes fossem injetados nos reatores a cada 14,7 minutos, sendo que 30% do volume do reator estava sendo deslocado durante cada ciclo de diluição. A composição de cada injeção foi de tal forma que 75% do fluido injetado continha solução de IVTT fresca, enquanto os restantes 25% consistiam de DNA ou água ultrapura. Após cada injeção dos reagentes novos os reatores foram misturados continuamente, depois do qual uma imagem da fluorescência de cada reator foi gravada usando o microscópio. A reação foi permitida subseqüentemente funcionar continuamente para 68 ciclos, tendo por resultado uma duração experimental de 16,5 h. Os resultados deste experimento são dados na Figura 9. Ao realizar experimentos de IVTT prolongados, há duas causas principais para o fracasso de uma reação; a introdução de ar no dispositivo microfluídico ou a degradação da solução de reação de IVTT. A ocorrência do ar dentro do dispositivo microfluídicos é o mais frequentemente o resultado direto de bolhas de ar pequenas que existem nas soluções do entrada, que são injetadas subseqüentemente no dispositivo microfluídicos. Ao entrar no dispositivo, a presença de ar inibe o fluxo adequado de fluidos, pelo qual as reações não são mais atualizadas periodicamente, levando à formação de reações em lote dentro dos anéis do reator. Em alguns casos, o ar é lentamente removido do dispositivo pelo rubor repetido de reagentes, após o qual a reação continua como pretendido (como mostrado na Figura 9). Em outros casos, o ar permanece preso, e só pode ser removido por abortar o experimento e, subsequentemente, aplicar pressão contínua (alta) à camada de fluxo do dispositivo microfluídico, análoga ao processo de enchimento descrito na seção 5,1 dos protocolos. Durante nossas experiências o lisado da pilha é armazenado na tubulação de PTFE em um elemento de Peltier que refrigera a 4 ° c. Ambas as medidas ajudam a limitar a degradação da solução de reação do IVTT ao longo do tempo, com o tubo inerte de PTFE assegurando a interação limitada entre a tubulação e a solução da reação e as temperaturas frias que preservam o (bio) molecular funcional componentry necessário para executar IVTT. Se ocorrer degradação da solução de reação-como resultado de arrefecimento insuficiente ou interações indesejadas entre a solução de reação e o ambiente de armazenamento-então isso vai se expor experimentalmente como uma redução gradual da proteína expressão ao longo do tempo. Uma vez degradada, a solução de reação de IVTT não pode ser recuperada e um novo experimento deve ser preparado. Figura 1. A configuração de hardware necessária para executar reações de IVTT contínuas. A) esquemada configuração do hardware. B) fotografia da configuração utilizada em todo este manuscrito. A implementação de um dispositivo microfluídico multicamada para reações de IVTT contínuas requer uma extensa configuração de hardware para regular a pressão de fluxo, acionar canais de controle, reações de calor e frio e reagentes, armazenar fluidos e imagem do dispositivo durante Experiências. As experiências são executadas em temperaturas de 30 ° c, que é conseguida coloc o microscópio dentro de uma incubadora ajustada a esta temperatura. Para evitar a deterioração da solução de reação de IVTT, ela é armazenada dentro da tubulação de PTFE enrolada sobre a face fria de um elemento Peltier. A temperatura do elemento de Peltier é ajustada a 4 ° c, com um refrigerador de água e um bloco de água que estão sendo usados para manter esta temperatura. Os reagentes que não necessitam de resfriamento, são armazenados em reservatórios de fluidos fora da incubadora do microscópio. A pressão constante é aplicada a estes reservatórios por um regulador de pressão controlado por computador. Desta forma, os fluidos são forçados através do tubo de saída dos reservatórios, que se conectam diretamente aos canais de entrada do dispositivo microfluídico. Cada um dos canais de controle do dispositivo microfluídico é conectado a uma válvula pneumática. Toda a matriz de válvulas está pressão constante. Abrindo a válvula, permite a pressurização do fluido dentro da tubulação que conecta a válvula pneumática ao canal de controle do dispositivo microfluídico, abrindo assim e fechando as membranas PDMS encontradas dentro do dispositivo microfluídico. As válvulas pneumáticas são abertas e fechadas através de uma interface de usuário que comanda um controlador Fieldbus (não mostrado) para abrir e fechar válvulas pneumáticas específicas. Figura adaptada de Yelleswarapu et al.22. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2. Visão geral da instalação da válvula pneumática e da conexão do canal de controle. Uma disposição de 8 válvulas é mostrada com as três conexões do canal de controle cabidas aos Valves 1, 2, e 3. O ar comprimido pode ser fornecido à disposição da válvula através da tubulação de 1/4 “. Para as atuações dos canais de controle são utilizadas duas pressões: 1 bar para os canais de controle de pressão inferiores (1, 2 e 3) e 3 bar para os canais de controle de pressão mais altos (9 a 30, não mostrados aqui). A tubulação pode ser enchida com a água ultrapura e ser inserida em uma das entradas do canal de controle usando um pino do conector do aço inoxidável. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3. Visão geral do regulador de pressão de fluxo comercial e do sistema de reservatórios. Um regulador de pressão comercialmente disponível é usado para injetar fluidos na camada de fluxo do dispositivo microfluídico multicamada. Conectar o controlador de pressão a um computador permite a modulação da pressão usada para executar as injeções fluidas. Os reagentes podem ser armazenados em um reservatório de fluido, que está diretamente ligado ao regulador de pressão. A aplicação da pressão ao reservatório força o líquido fora do reservatório através da tubulação da tomada. Esta tubulação da tomada pode ser conectada diretamente a uma das entradas fluidas do dispositivo microfluídicos usando um pino do conector do aço inoxidável. No caso em que o volume do reagente é incapaz de alcançar o reservatório de fluido, a tubulação de saída atua como um reservatório para o reagente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4. Visão geral do sistema de resfriamento usado para resfriar reagentes de reação. (Esquerda) configuração de resfriamento isolada e (direita) configuração de resfriamento colocada dentro do microscópio e conectada ao dispositivo microfluídico. Um elemento de Peltier é usado para refrigerar a solução da reação de ivtt antes da injeção no dispositivo microfluídicos. O reagente é armazenado dentro da tubulação de PTFE enrolada sobre a frio-cara do elemento de Peltier. Um comprimento da tubulação do auge é usado para transferir o líquido refrigerado ao dispositivo microfluídicos, com o diâmetro interno pequeno (0, 5 “) que minimiza o volume do reagente já não está sendo refrigerado. Ao lado da tubulação enrolada de PTFE, um termistor é coloc, permitindo a monitoração da temperatura do tempo real na superfície do elemento de Peltier. A tensão aplicada ao Peltier é ajustada de tal forma que a temperatura da superfície do Peltier permaneça entre 0 ° c e 4 ° c. Para remover o calor excedente produzido pelo elemento de Peltier, a quente-cara do Peltier é coloc de encontro a um bloco de refrigeração água, com a adição de graxa livre do dissipador de calor do silicone assegurando a transferência térmica óptima entre as duas faces. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5. Visão geral do design do dispositivo microfluídico. O reator de fluxo microfluídico para reações de IVTT contínuas consiste em oito anéis de reator, cada um com um volume de 10,7 nl. Nove entradas permitem o entrada de nove soluções originais da reação no dispositivo. 24 canais de controle regulam o fluxo de fluidos dentro do dispositivo. Os canais de controle 9 a 14 formam um multiplexador. Esses canais de controle devem ser pressurizados em todos os momentos para inibir o fluxo de fluido no dispositivo. A depressudação de dois canais de controle permite simultaneamente a entrada de um único reagente. Os canais de controle 15, 16, e 17 são usados para bombear peristaltically os reagentes no dispositivo em uma maneira controlada. Os canais de controle de 18 a 25 cada controlam a entrada de um dos oito reatores encontrados dentro do dispositivo. O canal de controle 26 pode fechar a canaleta nivelada, assim forçando o líquido nos reatores. O canal de controle 27 auxilia no preenchimento homogêneo dos reatores. Os canais de controle 28 e 29 regulam as tomadas do reator do anel e a única tomada do dispositivo respectivamente. Finalmente, os canais de controle 1, 2 e 3 são usados para bombear peristalticamente o fluido dentro dos reatores do anel, resultando na mistura dos reagentes. O desenho deste dispositivo microfluídico e a figura são ambos adaptados de Neiderholtmeyer et al.29. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 6. Válvula à base de membrana dentro do dispositivo microfluídico. A) canal defluxo dentro do dispositivo microfluídico. Dois canais de controle podem ser vistos em segundo plano. Estes canais não são pressurizados e, como tal, as válvulas estão abertas (fluido pode fluir). B) os dois canais de controle que cruzam os canais de camada de fluxo foram pressurizados, fechando as válvulas (ou seja, o fluxo de fluido é impedido). Após a pressurização dos canais de controle, a membrana PDMS fina separando os canais de fluxo e camada de controle é desviada para cima (a camada de controle fica abaixo da camada de fluxo) que fecha o canal de camada de fluxo. O arredondamento do canal de camada de fluxo é fundamental para garantir que a membrana desviada feche totalmente o canal de fluxo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 7. Interface de usuário usada para controlar o dispositivo microfluídico. Ao longo desta pesquisa, uma interface de controle personalizado tem sido usada para controlar o fluxo de fluidos dentro dos dispositivos microfluílicos. A interface permite que os usuários atuem individualmente cada um dos canais de controle (numerados 1-3 e 9-29), ou para executar protocolos elaborados resultando na lavagem e carregamento de reagentes, a calibração do dispositivo microfluídico, e a execução de Experiências. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 8. Resultados de um experimento de calibração. Durante um experimento de calibração, os reatores são preenchidos com um fluoróforo (25 ΜM FITC-Dextran) após o qual a intensidade de fluorescência é registrada. Subseqüentemente, uma série de diluições segue, onde um número ajustado de etapas do entrada (15) é usado para injetar a água ultrapura nos reatores. Após cada diluição, os reagentes são misturados e a fluorescência é medida. A diminuição da intensidade de fluorescência por diluição revela o volume do anel do reator deslocado para o número definido de passos de entrada; um valor denominado a taxa de atualização. a) aintensidade média e o desvio padrão de todos os oito reatores são mostrados em vermelho, com os traços de intensidade individuais mostrados em cinza. B) a taxa média de atualização e o desvio padrão são mostrados para cada etapa de diluição em vermelho. As proporções de atualização individuais de cada reator individual são mostradas em cinza. Pode-se ver que sete dos oito reatores apresentam comportamento muito semelhante, porém um reator mostra flutuações na taxa de refrescamento após o sétimo ciclo de diluição. Isso destaca a necessidade de taxas de atualização exclusivas para cada um dos reatores, em oposição ao uso de uma taxa de atualização média para a injeção de reagentes nos reatores. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 9. Resultados de um experimento IVTT expressando a proteína deGFP. Uma reação prolongada de IVTT foi iniciada de tal forma que 30% do volume do reator é deslocado a cada 14,6 minutos. A reação foi permitida para funcionar por mais de 16 horas antes de ser terminado. Dois reatores do dispositivo microfluídico foram utilizados como espaços em branco, com apenas a água ultrapura sendo pilotado pelos reatores durante todo o experimento (reatores 1 e 5). Todos os outros reatores compreenderam 75% de solução de reação de IVTT e 25% de água ultrapura (reatores 2 e 6) ou modelos de DNA linear de 2,5 nM codificando para a expressão de deGFP (reatores 3, 4, 7 e 8). Em todos os quatro reatores onde o ADN foi adicionado, há uma expressão desobstruída do deGFP. Três dos quatro reatores fornecem a intensidade similar da fluorescência, com um reator que indica um mais baixo sinal da fluorescência. Isso pode ser causado por uma disparidade no fluxo, resultando em menos DNA entrando no reator, ou devido a variações nas dimensões do reator. Após 14 horas, um aumento repentino é visto no sinal dos reatores que contêm o ADN. Isto é causado por uma bolha de ar entrando na camada de fluxo do dispositivo microfluídico, presumivelmente originando-se de uma das soluções de entrada. A armadilha do ar no dispositivo microfluídicos limita significativamente o fluxo dos líquidos através dos canais, por meio de que nenhum reagente fresco pode ser adicionado a ou removido dos reatores até que o ar se tenha passado. Após a retomada do fluxo, o experimento retorna à sua intensidade de fluorescência anterior. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Arquivos suplementares. Por favor, clique aqui para baixar esses arquivos. 

Discussion

Um dispositivo microfluídico multicamada baseado em PDMS foi apresentado, e sua capacidade de sustentar reações de IVTT por períodos prolongados de tempo foi demonstrada. Embora bem adaptado para este exemplo específico, esta tecnologia pode concebìvel ser usada para inúmeras outras aplicações. O controle adicional sobre o fluxo de fluido-emparelhado com a capacidade de repor continuamente os reagentes de reação enquanto removendo (por) produtos-é ideal para reações contínuas da síntese, a investigação de vários comportamentos dinâmicos, e o simultâneo condução de múltiplas variações de uma única reacção.

Apesar do processo de fabricação relativamente simples de dispositivos baseados em PDMS, o uso deles requer uma extensa configuração de hardware. Compreendendo matrizes da válvula, reguladores de pressão, bombas de pressão, incubadoras, e unidades refrigerando, a transição da fabricação ao uso não é elementar, e exige um investimento inicial significativo. Além disso, a capacidade de configurar consistentemente e realizar experimentos bem-sucedidos com esses dispositivos requer um tempo significativo de investimento; um ponto que este manuscrito pretende abordar. No entanto, uma vez no local, toda a configuração pode ser modificada para um intervalo de finalidades. Além disso, a configuração de hardware compreende inúmeros elementos modulares, cada um dos quais pode ser expandido para permitir que projetos de dispositivos microfluídico mais complexos sejam empregados. Além disso, o design modular permite a substituição de componentes de hardware por alternativas de funcionamento semelhante, de modo que os usuários não estão limitados à configuração específica descrita aqui48,49.

A variabilidade entre dispositivos individuais e nas condições externas (como flutuações de pressão) pode resultar em imprecisões ao realizar experimentos usando esses dispositivos. Para abordar esse problema, uma calibração do sistema deve ser realizada antes de cada experimento, proporcionando uma taxa de atualização única para cada um dos reatores. Embora a calibração aborda as variações de dispositivo para dispositivo e experiência para experimento, é um processo demorado e não impecável. Fluidos com viscosidades diferentes não fluirão com a mesma taxa quando expostos a uma pressão idêntica, e como tal realizando a calibração com vários reagentes pode não produzir proporções de atualizaçãoidênticas. Este efeito é atenuado através da utilização de três canais de controle para a bomba peristalticamente os reagentes para o dispositivo microfluídico, em oposição a regular o fluxo, variando a pressão fornecida apenas. Como último recurso nos casos em que a disparidade na viscosidade é muito grande, uma relação de atualização única pode ser implementada para cada reagente individual realizando experimentos de calibração múltipla.

O uso de uma bomba peristáltica para injetar reagentes no dispositivo microfluídicos atenua os efeitos de usar soluções com viscosidades de variação, porém igualmente cria um problema secundário. Usando etapas discretas para bombear líquidos no dispositivo microfluídicos, significa que a definição das injeções em um único reator, é limitada pelo volume injetado ao executar um único ciclo da bomba. Dentro de nossa pesquisa este valor-determinado durante a calibração-é aproximadamente igual a 1%, indicando que um único ciclo da bomba descoloca aproximadamente 1% do volume do reator (aproximadamente 0,1 nL). Como tal, deslocar 30% do volume do reator exige a execução de 30 ciclos da bomba, com 23 ciclos da bomba da solução da reação de ivtt que está sendo adicionado, e somente 7 ciclos da bomba do ADN ou da água ultrapura que estão sendo adicionados. Embora seja suficiente para nossa pesquisa, protocolos experimentais alternativos podem encontrar problemas ao tentar adicionar um número maior de reagentes exclusivos, usar uma fraçãode atualização mais baixa ou adicionar volumes menores de um único reagente a um reator. Em tais casos, o design do dispositivo microfluídico pode ser adaptado para fornecer reatores com um volume maior. Um exemplo de tal é relatado em Niederholtmeyer et al.36.

Crucialmente, o dispositivo delineado dentro deste manuscrito permite que as reações sejam sustentadas por durações prolongadas, resultando em taxas de transcrição e tradução de estado estacionário. Ao injetar periodicamente novos reagentes nos reatores-e removendo os produtos de reação (por)-as reações são sustentadas e comportamentos dinâmicos complexos podem ser monitorados. Desta forma, uma plataforma foi criada que-até certo ponto-imita o ambiente celular. Além disso, esta plataforma possibilita a exploração da dinâmica do sistema, adaptando o período entre as injeções e a composição específica das injeções. Como resultado, esses dispositivos microfluílicos multicamadas são uma ferramenta poderosa para a caracterização e otimização de novas redes sintéticas que exibem um comportamento dinâmico complexo.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pelo Conselho Europeu de investigação, ERC (projecto n. 677313 BioCircuit) uma subvenção NWO-VIDI da organização neerlandesa de investigação científica (NWO, 723.016.003), financiamento do Ministério da educação, cultura e ciência (Gravity programas, 024.001.035 & 024.003.013), o programa de ciência da fronteira humana Grant RGP0032/2015, o Conselho Europeu de investigação no âmbito da União Europeia Horizonte 2020 programa de investigação e inovação Grant 723106, e um Swiss National Science Foundation Grant 200021_182019.

Materials

Reagents
Acetone VWR 20063.365
AZ 40 XT Merck KGaA (Darmstadt, Germany) – Positive Photoresist
AZ 726 MIF Developer Merck KGaA (Darmstadt, Germany) – Developer Positive Photoresist
Isopropanol Merck KGaA (Darmstadt, Germany) 109634
Microscope slides VWR ECN 631-1550
mr Dev 600 Microresist Technology GmbH (Berlin, Germany) – Developer Negative Photoresist
Silicon Free Heat Sink Grease Circuit Works CW7270 Thermal Compound
Silicon wafers Silicon Materials – <1-0-0> orientation, 100 mm diameter, 525 µm thickness
SU-8 3050 Microchem Corp. (Newton, MA) – Negative Photoresist
Sylgard 184 Elastomer Kit (PDMS) The Dow Chemical Company 01317318
trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane Sigma-Aldrich 448931-10G
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
4 channel digital input/output module WAGO Kontakttechnik GmbH 750-504 8x
Camera lens The Imaging Source –
Compression fitting Koolance, Inc. FIT-V06X10 Fitting for tubing with 6mm ID and 10mm OD. 4x
Controller end module WAGO Kontakttechnik GmbH 750-600
Device connecting tubing Saint-Gobain Performance Plastics AAD04103 0.02" ID, 0.06" OD, Tygon Tubing (ND-100-80)
Device connector pins Unimed SA (Lausanne, Switserland) 200.010-A AISI 304 tubing, 0.35mm ID, 0.65mm OD, 8mm L
Ethernet Controller WAGO Kontakttechnik GmbH 750-881
Female bus connector Encitech DTCK15-DBS-K 15 pole female bus connector
Fluid reservoirs Fluigent Fluiwell-4C
Fluigent pressure system Fluigent MFCS-EZ 0 – 345 mbar
Hg short arc lamp Advanced Radiation Corporation – 350W
Hot plate Torrey Pines Scientific HP61
Inverted microscope Nikon Instruments Eclipse Ti-E
LabVIEW Software de Greef Lab, Eindhoven University of Technology https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software
Liquid coolant Koolance, Inc. LIQ-705CL-B
Luer stubs Instech Laboratories, Inc. LS23
Male Luer to barb connectors Cole Parmer 45505-32 3/32" ID
Matlab Software de Greef Lab, Eindhoven University of Technology https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software
Microcamera The Imaging Source DMK 42AUC03
Microscope camera Hamamatsu Photonics OrcaFlash4.0 V2 (C11440-22CU)
Orbital shaker Cole Parmer EW-513000-05
Oven Thermo Scientific Heraeus T6P 50045757
Oxygen plasma asher Quorum Technologies K1050X
PDMS puncher SYNEO Accu-Pucnh MP10
PEEK tubing Trajan 1301005001-5F 0.005" ID, 1/32" OD, Red
Peltier element European Thermodynamics APH-127-10-25-S
Peltier temperature controller Warner Instruments CL-100
Photomask CAD/Art Services, Inc. –
Photomask Design Maerkl Lab, EPFL https://zenodo.org/record/886937#.XBzpA8-2nOQ
Pneumatic valve array FESTO – 1x 22 valve array and 1x 8 valve array, Normally closed valves.
Power adapter Koolance, Inc. ADT-EX004S 110/220V AC Power Adapter
PTFE tubing Cole Parmer 06417-21 #24 AWG Thin Wall PTFE
Punching pin SYNEO CR0320245N21R4 OD: 0.032" (0.8128 mm), ID: 0.024" (0.6090 mm)
PVC Tubing Koolance, Inc. HOS-06CL 6 mm ID, 10 mm OD
Single edge blades GEM Scientific –
Soft tubing Fluigent – Supplied with fluid reservoirs. (1 mm ID, 3mm OD)
Spin coater Laurell Technologies Corporation WS-650MZ-23NPPB
Stereo microscope Olympus Corporation SZ61
Thermistor cable Warner Instruments TA-29 Cable with bead thermistor
UV exposure system ABM, USA – Near UV Exposure System, 350W
Vacuum pump Vacuumbrand GmbH MD1C
Water cooled cold plate block Koolance, Inc. PLT-UN40F
Water cooler Koolance, Inc. EX2-755
Weighing scales Sartorius M-prove
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van der Linden, A. J., Yelleswarapu, M., Pieters, P. A., Swank, Z., Huck, W. T. S., Maerkl, S. J., de Greef, T. F. A. A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression. J. Vis. Exp. (152), e59655, doi:10.3791/59655 (2019).
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