JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

פלטפורמת מיקרופלואידיג רב שכבתית לצורך הובלה של ביטוי גנים ממושך ללא תא

Published: October 06, 2019
doi:
10.3791/59655
, , , , , ,
1Institute for Complex Molecular Systems, Department of Biomedical Engineering, Computational Biology Group,Eindhoven University of Technology, 2Institute for Molecules and Materials,Radboud University, 3Institute of Bioengineering,School of Engineering École Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL)

Summary

תהליך הייצור של מכשיר מבוסס PDMS, רב שכבתי, microfluidic המאפשר שעתוק ותרגום מבחנה (IVTT) התגובות להתבצע על פני תקופות ממושכות מתוארת. יתרה מזאת, סקירה מקיפה של החומרה והתוכנה הדרושה להפיכת תגובות אלה לאוטומטיות ולשמירה על המשך ממושך מסופקת.

Abstract

המגבלות של ביולוגיה סינתטי מבוסס תא נעשים יותר ויותר ברור כמו החוקרים מטרתו לפתח מעגלים סינתטיים גדול יותר ומורכב יותר הרגולציה הגנטית. הניתוח של רשתות הרגולציה הגנטית הסינתטי בvivo הוא זמן רב וסובל מחוסר שליטה סביבתית, עם רכיבים סינתטיים אקסוגני אינטראקציה עם תהליכים מארחים וכתוצאה מכך התנהגות בלתי רצויה. כדי להתגבר על בעיות אלה, אפיון ללא תא של המעגלים החדשניים הופך נפוץ יותר. בתמלול ובתרגום הפריה חוץ גופית מאפשרים התקנה של הסביבה הניסיונית והיא יכולה להיות ממוטבת לכל מערכת ייחודית. הפרוטוקולים המוצגים כאן פירוט הייצור של התקן microflu, מיקרו שכבה רב שניתן לשימוש כדי לקיים תגובות IVTT עבור משכי זמן ממושך. בניגוד לתגובות אצווה, שבו משאבים מרוקנים לאורך זמן ו (by-) מוצרים להצטבר, השימוש במכשירים microflu, מאפשר את חידוש המשאבים, כמו גם הסרת מוצרי התגובה. באופן זה, הסביבה התאית מועלת על-ידי שמירה על סביבה מחוץ לשיווי משקל שבה ההתנהגות הדינמית של מעגלי הגנים יכולה להיחקר בפרקי זמן ארוכים. כדי לנצל באופן מלא את התקן microflu, החומרה והתוכנה המרובים, שולבו כדי להפוך את תגובות ה-IVTT לאוטומטיות. על ידי שילוב תגובות IVTT עם פלטפורמת microflu, מיקרופלואידים המוצגת כאן, ניתן לנתח באופן מקיף התנהגויות רשת מורכבות, לקדם את הבנתנו את המנגנונים המסדירים תהליכים סלולריים.

Introduction

תאים מסוגלים לחוש ולהגיב לסביבתם באמצעות רשתות רגולטוריות דינאמיותמורכבות 1,2. תחום הביולוגיה הסינתטית מנצל את הידע שלנו על המרכיבים האנושיים המרכיבים את הרשתות הללו למהנדס מערכות ביולוגיות שיכולות להרחיב את הפונקציונליות של תאים3,4. לעומת זאת, ניתן גם להמשיך ולהבין את הרשתות הטבעיות השולטות על החיים על-ידי עיצוב מעגלים סינתטיים מפושטת של המעגלים הקיימים או על-ידי מערכות ביולוגיות הנדסיות מראש, אשר מציגים התנהגויות טבעיות. דה נובו הנדסה של מערכות ביולוגיות כאלה מבוצעת בצורה מלמטה למעלה שבו מעגלים גנטיים הרומן או מסלולים איתות מהונדסים באופן רציונלי, באמצעות חלקים מוגדרים היטב5,6. שילוב העיצוב הרציונלי של רשתות עם תכנון מערכות רלוונטיות ביולוגית מאפשר אפיון מעמיק וחקר מערכות רגולטוריות ביולוגיות עם רמות שונות של הפשטה7.

העבודות החלוציות של אלביץ ‘ ולייבלר8 וגרדנר ואח ‘9 היו הראשונים להדגים את המבוא המוצלח של רשתות גנטיות סינטתיים למארחים סלולריים. בעשור הבא, חוקרים רבים המשיכו לבנות על הצלחות ראשוניות אלה למרות הופעתה של מספר מגבלות לגבי המבוא של מעגלים סינתטיים לתוך תאים7,10,11 ,12. באופן אידיאלי, המבוא של מעגלים סינתטיים למחשבים מארחים סלולריים צריך להופיע בצורה מודולרית. למרבה הצער, המורכבות של הסביבה הסלולרית הופכת את זה למאתגר במיוחד, עם הפונקציה של חלקים רבים ורשתות להיות הקשר מאוד התלוי12,13,14. כתוצאה מכך, רשתות לעתים קרובות חווים אינטראקציות בלתי רצויות עם ערך רכיב מארח מקורי אשר יכול להשפיע על הפונקציה של המעגל הסינתטי. באופן דומה, הרכיבים של רשת אקסוגני יכולים לעכב תהליכים מארחים, להתחרות על משאבים משותפים בתוך המחשב המארח, ולהשפיע על קינטיקה הצמיחה15,16,17. כתוצאה מכך, כדי לעצב ולנבא באופן רציונלי את ההתנהגות של רשתות סינטתיים בסביבה vivo, מודל מקיף של כל הדינמיקה המארחת ומעגל נדרש18.

חלופה ממשית לשימוש במארחים סלולריים לאפיון של רשתות סינטתיים היא יישום של שעתוק ותרגום מחוץ לרשת (IVTT). מתפקד כ-גנט עבור רשתות סינטתיים, התגובות מתבצעות בפתרונות המרכיבים את כל הרכיבים הדרושים כדי לאפשר ביטוי גנים19,20,21. באופן זה, הסביבה הרלוונטית ביולוגית, אם כי מלאכותית, נוצרת בתוכה רשתות סינטתיים ניתן לבדוק22,23,24,25,26, 27,28. היתרון העיקרי של שימוש בפתרונות IVTT הוא היכולת לבצע תגובות תחת תנאים מוגדרים על-ידי המשתמש, עם החוקרים מסוגלים לכוונן את ההרכב המדויק של כל תגובה2. יתר על כן, הגישה ללא תא מאפשרת בדיקות תפוקה גבוהה של רשתות סינטתיים, כיוון שהיא מסירה את הצורך לבצע שלבי שיבוט סלולריים זמן רב. כתוצאה מכך, משך הזמן של מחזורי הבנייה-בדיקה רצופים מופחת באופן משמעותי29,30,31,32. מחזור העיצוב יכול להיות מואץ עוד יותר על-ידי ניצול שיטות שיבוט של תא חינם כגון מכלול הגיבסון להנדסה במהירות ברשתות הרומן, ועל ידי בניית רשתות מתבניות DNA ליניארי אשר-בניגוד הפלמידים הדרושים ב vivo בדיקות- יכול להיות מוגברבאמצעות תגובות שרשרתפולימראז (PCR)33,34.

תגובות אצווה הן השיטה הפשוטה ביותר שבה תגובות IVTT ניתן לבצע, המחייב ספינת תגובה אחת שבה כל רכיבי התגובה משולבים35. תגובות כאלה מספיקות לביטוי חלבון ובדיקות מעגל בסיסי עדיין להוכיח מספיק כאשר מנסים ללמוד את ההתנהגות הדינמית ארוכת טווח של רשת. במהלך תגובת האצווה, הריאגנטים מרוקן או עובר השפלה וכתוצאה מכך ירידה רציפה של שיעורי תמלול ותרגום. יתר על כן, כמו התקדמות התגובות על ידי-מוצרים להצטבר כי יכול להפריע-או לחלוטין לעכב-את התפקוד הנכון של הרשת. בסופו של דבר, השימוש כורים אצווה מגביל את ההתנהגות הדינמית אשר ניתן לצפות, עם רגולציה שלילית להיות מאתגרת במיוחד כדי ליישם5,36.

רב-תכליתיות מערכות ivtt מאפשרת שיטות חלופיות מרובות שבהן ניתן לבצע תגובות ממושכות של ivtt, החל מזרימה רציפה לשיטות מבוססות droplet, כמו גם גישות דיאליזה פשוטות יותר2,30, 37,38,39,40. היישום של התקנים microflu, מציע למשתמשים להגדיל את השליטה על התגובות שלהם תוך הגדלת התפוקה ומזעור עלויות35,41,42, עם כל גישה ספציפית שיש לה יתרונות משלו. השימוש בזרימה רציפה יכול להיות ממוטב בקלות עבור הגדלת תשואות ביטוי עם זאת, חוסר יכולת להסיר ביעילות מוצרי תגובה ספציפיים הופך את המחקר של התנהגות דינמית לא טריוויאלי39. בעוד העסקת droplet מבוססי microfluidic מערכות מאפשר הקרנת תפוקה גבוהה של רשתות הרומן, את הקושי של הספקת ריאגנטים טרי לתוצאות התגובה טיפות הדומה לאצווה קטנה בכמות התגובות43. כורים דיאליזה מבוסס לאפשר את המבוא של ריאגנטים טרי, כמו גם הסרת מוצרים מסוימים התגובה עם זאת, מולקולות RNA וחלבונים גדולים להצטבר בתוך הכור, להיות גדול מדי כדי לפזר דרך נקבוביות הקרום. יתר על כן, כמויות גדולות של ריאגנטים נדרשים לקיים את התגובות הללו לתקופות ממושכות30,44. בשנת 2013, maerkl et al. הציג מכשיר מיקרופלואידיג רב שכבתי שתוכנן במיוחד לניהול תגובות ivttממושכות 36,45. השימוש במכשירים מיקרופלואידים רב שכבתית מאפשר שליטה ישירה על זרימת הנוזלים, המאפשר ניתוב מחדש של זרימה, כמו גם בידוד של נוזלים באזורים ספציפיים של המכשיר46,47. אזורים מבודדים אלה יכולים לתפקד כתאי תגובה בקנה מידה של nanoliter עצמאית שבה תגובות IVTT ניתן לבצע. במהלך תגובת IVTT יחידה, זריקות תקופתיות של ריאגנטים טרי לתוך הכור משמשים לחדש רכיבי IVTT ו-DNA תבניות. במקביל, נפח שווה של פתרון התגובה הישנה הוא נעקרו, הסרת מוצרי התגובה. באופן זה, סביבה מחוץ לשיווי משקל מתוחזק היכן שיעור התמלול והתרגום הבזליים נשארים במצב יציב, מאריך את חיי התגובות של IVTT ומאפשר להתנהגויות דינמיות עשירות להתרחש. על ידי יישום גישה זו, החוקרים מסוגלים לחקור את שיעורי קינטי של תהליכים בודדים המתרחשים בתוך מעגל ספציפי, לסייע הנדסה קדימה של רשתות גנטיות הרומן. למשל, ניזלהולטמאייר ואח ‘ מיישמת גישה זו לאפיון אלמנטים שונים של מתנד טבעתי גנטי, הקובע את התעריפים הקינטית שלהם36. במחקרים נוספים, ילסווראפו et al הראה כי שיעורי קינטי של מקדם סיגמא 28 (σ28) נקבע תחת תנאי אצווה לא היו מספיק כדי לתאר את ההתנהגות של מתנד σ28, וכי התוספת של נתונים מבוססי זרימה תחזיות מודל משופר של התנהגות הרשת22.

מטרתו של כתב יד זה היא להציג פרוטוקול מלא לייצור התקנים מיקרופלואידים רב שכבתית המסוגלים לבצע תגובות לטווח ארוך של IVTT. בנוסף, כתב יד זה יתאר את כל החומרה והתוכנה הדרושים לביצוע תגובות ממושכות של IVTT. האקטואציה של התקן microflu, c הכרחי כדי לשלוט בזרימת הנוזלים בו-מושגת באמצעות סדרה של שסתומים פנאומטיים המתחברים ישירות למכשירים microflu, מיקרופלואידים באמצעות אורכי אבובים. בתורו, השסתומים הפנאומטיים נשלטים באמצעות ממשק בקרה וירטואלי בנוי בהתאמה אישית. זרימת הנוזלים בתוך המכשירים המיקרופלואידים מושגת באמצעות לחץ מתמשך אשר מסופק על ידי מערכת הלחץ הזמין מסחרית תקנה. תגובות IVTT מתבצעות בדרך כלל בין 29 ° צ’ ו 37 ° c ואינקובטור מיקרוסקופ משמש כדי לווסת את הטמפרטורה במהלך התגובות. עם זאת, הפונקציונליות של תערובת ה-IVTT מדרדרת בהדרגה כאשר היא מאוחסנת מעל 4 ° c. ככזה, כתב יד זה יהיה להרחיב על מערכת קירור מחוץ שבב המשמש לצנן את תערובת ה-IVTT לפני הזרקה לתוך המכשיר microfluidic. לסיכום, כתב יד זה מספק סקירה מקיפה של ההליכים הנדרשים לבצע בהצלחה תגובות IVTT ממושכות באמצעות הכור זרם microflu, כך שחוקרים אחרים יוכלו לשכפל את הטכנולוגיה הזאת באופן יחסי קלות.

Protocol

1. הכנת וופל הערה: הפרוטוקולים שלנו הם ספציפיים עבור 40 XT חיובי photoresist ו SU8 3050 שלילי photoresist שימוש במהלך מחקר זה. ניתן להשתמש בפוטטוריסיסטים חלופיים, אולם מהירויות הסחרור הספציפיות, טמפרטורות האפייה וזמני האפייה ישתנו. עיצוב המכשיר המיקרופלואידיג המסופק על ידי ניניהולטמאייר ואח ’36 מקושר בטבלת החומרים. מניחים שני וופלים הסיליקון נקי (100 מ”מ קוטר, אוריינטציה, 525 יקרומטר עובי) בתנור מחומם להגדיר כדי 250 ° c ולהשאיר את וופלים כדי תתייבש ימה לילה (~ 16 h).הערה: ניתן גם לשים מראש את הוופלים באמצעות התצהיר של אדי הווMDS; עם זאת, אין צורך בכך אם הקונדיטוריה מיובשת מספיק. להסיר וופל סיליקון אחד מן התנור ולתת לו להתקרר לטמפרטורת החדר לפני שתמשיך עם ציפוי ספין. החל 3-4 mL של 40 XT photoresist למרכז של וופל. כדי לקבל גובה תכונה של 25 יקרומטר להחיל את פרוטוקול הספין הבא: ספין עבור 20 s ב 500 rpm (110 rpm/s), להגדיל את מהירות ספין כדי 3100 rpm (300 rpm/s) ולהחזיק כאן 30 s, ו להאט את וופל 0 סל ד עם האטה של 200 rpm/s. שימוש ב רקמת מיקרופייבר להסיר בזהירות כל קצוות ואגלי אשר ייתכן שהתרחשו במהלך ציפוי ספין. אופים רכים באמצעות שני צלחות חמות נפרדות שנקבעו כ-70 ° c ו-120 ° c באופן הבא: אפשר לשבת בתוך 70 ° c עבור 30. לאחר מכן העבירו את הרקיק לפלטה של 120 ° c והניחו לו לנוח כאן במשך 3.5 דקות לפני שהחזירו את הפרוסת לפלטת הפלטה 70 לשנת שלושים וחצי. הסירו את הפרוסת מפלטת הפלטה והימנעות מזעזועים פתאומית בטמפרטורה – מאפשרים לצנן את טמפרטורת החדר. מניחים את שכבת הזרימה פושאל (אמולסיה בצד למטה) אל הסרט photoresist ולחשוף את וופל באמצעות מנורת UV עד חשיפה מלאה של 200 mJ/cm2 מושגת. אופים לאחר חשיפה באמצעות שני צלחות חמות (70 ° צ’ צלזיוס ו 105 ° c) באופן הבא: לאפשר וופל לשבת בשעה 70 ° c עבור 20 לפני העברת הפרוסת וופל לפלטת מעלות צלזיוס ה105 ומשאיר אותו כאן עבור 40 s. לבסוף להחזיר את וופל לפלטה 70 ° c עבור 20 נוספים כדי להשלים את האופים לאחר החשיפה. הניחו לפרוסת הסיליקון להתקרר לטמפרטורת החדר על ערימת רקמות מיקרופייבר. לפתח את הפרוסת וופל על ידי העברתו לצלחת פטרי מלא 726 MIF photoresist מפתח כדי להתחיל את תהליך הפיתוח. פיתוח מואץ כאשר מבוצע על שייקר שחקן הספסל ואת הופל כולו הוא שקוע במפתח. לשטוף את וופל עם מים מינרלים ולהשתמש במיקרוסקופ סטריאו לבדוק את משטח וופל עבור כל שאריות photoresist. אם ניתן לראות שאריות photoresist, ואז להחזיר את הפרוסת וופל למפתח. הזרמת הphotoresist חיובית על-ידי הצבת וופל על צלחת חם להגדיר ב 110 ° c עבור 25 דקות. תהליך זה יגרום לתכונות מעוגלות, כמו גם לריפוי סדקים שייתכן שהופיעו במהלך תהליך הייצור. המשך לsilanize הופל כפי שמתואר בשלב 1.17. מסירים את וופל הסיליקון השני מהתנור, ומאפשרים לו להתקרר לטמפרטורת החדר לפני שממשיכים עם ציפוי הסחרור. החל 5 מ ל של SU8 3050 photoresist למרכז הפרוסת. כדי לקבל גובה תכונה של 30 יקרומטר להחיל את פרוטוקול הספין הבא: ספין עבור 20 s ב 500 rpm (110 rpm/s), להגדיל את מהירות ספין כדי 4,000 rpm (330 rpm/s) ולהחזיק כאן עבור 42 s, ו להאט את וופל 0 סל ד עם האטה של 200 rpm/s. שימוש ב רקמת מיקרופייבר להסיר בזהירות כל קצוות ואגלי אשר ייתכן שהתרחשו במהלך ציפוי ספין. אופים רכים באמצעות שני צלחות חמות נפרדות (65 ° c ו-95 ° c) באופן הבא: לאפשר לפרוסת וופל לשבת ב-65 ° c לשלושים. לאחר מכן העבירו את הפרוסת לפלטה של 95 ° c והניחו לו לנוח כאן במשך 14 דקות לפני שהחזירו את הפרוסת לפלטה של 65 ° c במשך 30 שנות נוספות. הסירו את הפרוסת מפלטת הפלטה והניחו לו להתקרר לטמפרטורת החדר. למדוד את עוצמת המנורה UV לפני החשיפה ולהשתמש בזה כדי לקבוע את משך החשיפה הנדרש כדי להשיג מינון החשיפה הכולל של 260 mJ/cm2. מניחים את הפושאול (אמולסיה בצד כלפי מטה) אל הסרט photoresist ומניחים את הופל מתחת למקור אור UV. לחשוף את וופל באמצעות מנורת UV עד חשיפה מוחלטת של 260 mJ/cm2 מושגת. אופים לאחר חשיפה באמצעות שני צלחות חמות (65 ° צ’ צלזיוס ו 95 ° c) באופן הבא: לאפשר וופל לשבת ב 65 ° c עבור 60 לפני העברת וופל על הפלטה בשנת המאה ° c ולהשאיר אותו כאן במשך שלושים דקות. החזר את הפרוסת וופל 95 לפלטה של מעלות צלזיוס ל -30 ° c כדי להשלים את האופים לאחר החשיפה. הניחו לפרוסת הסיליקון להתקרר לטמפרטורת החדר על ערימת רקמות מיקרופייבר. לפתח את הפרוסת וופל על ידי העברתו לצלחת פטרי מלא mrDev-600 photodeveloper פתח כדי להתחיל את תהליך הפיתוח. פיתוח מואץ כאשר מבוצע על שייקר שחקן הספסל ואת הופל כולו הוא שקוע במפתח. שטפו את הפרוסת וופל בעזרת איזופנול והשתמשו במיקרוסקופ סטריאו לבדיקת משטח הסיליקון לכל שאריות photoresist. אם ניתן לראות שאריות photoresist, ואז להחזיר את הפרוסת וופל למפתח. לאחר פיתוח מלא, קשה לאפות את הphotoresist על ידי הצבת וופל על צלחת חם להגדיר ב 150 ° c עבור 1 h. Silanize הן ופלים כדי למנוע הדבקה של PDMS במהלך תהליכי ליתוגרפיה רכה. כדי לבצע את silanization, pipet 2-3 טיפות (לכל פרוסת) של silane לתוך בקבוקון זכוכית קטן. מניחים את המבחנה הזאת, יחד עם וופלים לתוך desiccator ואקום למשוך עבור 5-10 דקות. לאטום את הdesiccator ולהשאיר את וופלים תחת ואקום לתקופה של 12 – 16 h.התראה: silane הוא רעיל לא צריך להיות שאפה. שמור על עצמך לעבוד בתוך מכסה המנוע וללבוש כפפות מניטריל בעת טיפול silane. זה כולל הצבת משאבת ואקום בתוך מכסה המנוע כאשר מושך ואקום על desiccator. שחררו את הוואקום מdesiccator והסירו את הsilanized וופלים. לשטוף עם מים ולהשתמש באדים של N2 כדי לייבש את וופלים. בשלב זה ניתן למקם את הקונדיטוריה באחסון עד הצורך. 2. ייצור מכשירים מיקרופלואידיג הערה: תהליך הליטוגרפיה הרך המשמש להרכיבו PDMS בהתבסס על התקני microflu, מבוססי המיקרו-שכבתי, ניתן להפריד לשלושה שלבים נפרדים: 1) ההכנה של PDMS של שכבות הזרימה והבקרה, 2) היישור וההתחברות של שתי שכבות PDMS, 3) השלמת ההתקן. הכנת PDMS הכינו שני פתרונות מקודשי PDMS על ידי שילוב הבסיס וריפוי סוכני בגביע פלסטיק באמצעות מוט ערבוב כדי לערבב את שני הרכיבים עד מלא מעורב. שכבת השליטה דורש 20 גרם של סוכן בסיס ו 1 גרם של ריפוי סוכן (20:1 יחס). שכבת הזרימה דורשת 40 גרם של סוכן הבסיס ו-8 גר’ הסוכן המרפא (יחס 5:1). . דגה את הפתרונות בdesiccator מניחים את שכבת הזרימה וופל בצלחת פטרי ויוצקים את התערובת 5:1 PDMS על הפרוסת. לדגה את PDMS עבור 30 דקות כדי להסיר בועות אוויר. מעיל ספין שכבת שליטה וופל (מוכן באמצעות SU8 3050photoresist שלילי) עם יחס 20:1 PDMS. יוצקים 5-10 mL של PDMS אל מרכז וופל ולהפעיל את פרוטוקול הספין הבא (לשמור על שמאל מעל PDMS לשימוש מאוחר יותר): ספין ב 500 סל ד עבור 15 s (100rpm/s), להגדיל את מהירות ספין כדי 1450 rpm (300 rpm/s) עבור 45 s , ולאחר מכן להאט את וופל 0 rpm (200 rpm/s). כדי להבטיח עובי של הסרט הומוגנית PDMS, המקום וופל מצופה PDMS על משטח רמה בצלחת פטרי סגורה (כדי למנוע זיהום אבק). . תן לרקיק לשבת 30 דקות הסירו את שכבת הזרימה מdesiccator והניחו את שכבות הזרימה והבקרה בתנור (80 ° c). לרפא את שתי השכבות עבור 28-30 דקות ולהסיר כאשר PDMS הוא הנזיל מספיק כדי לתמרן, תוך שנותר דביק מעט. המשך מיד עם תהליך היישור. יישור ומליטה באמצעות אזמל, הסר את כל אחד מארבעת המכשירים מ-PDMS על-גבי שכבת הזרימה. עם הסרת שכבת PDMS מתוך וופל סיליקון, מיד לכסות את הצד התכונה עם קלטת וויסקי כדי למנוע זיהום חלקיקי אבק. ליישר בערך את גושי שכבת הזרימה על שכבת השליטה על ידי עין, הצבת צד התכונה של המכשיר במגע עם שכבת הבקרה PDMS. לאחר מכן, בצע כוונונים עדינים למיקום של כל אחת מאבני שכבת הזרימה כדי ליישר את הערוצים של שכבת הזרימה עם ערוצי שכבת הבקרה, תוך שימוש במיקרוסקופ סטריאו כדי לסייע בהדמיה של ההתאמות. להפעיל לחץ כדי להסיר כיסים אוויר בין שתי שכבות PDMS. יוצקים את הנותרים 20:1 היחס PDMS שנשמר מוקדם יותר סביב שכבת הזרימה המיושרת בלוקים. מניחים 100 גרם משקולות בכל אחד מההתקנים כדי להבטיח מגע מספיק במהלך תהליך המליטה. החזר את המכשירים המיושרים (כולל המשקולות) לתנור של 80 ° c והשאר אותם בקשר לפחות 1.5 h ולא יותר מ-6 h. סיום ההתקן הסר את הפרוסת וופל מהתנור וחלץ כל אחד מההתקנים הבודדים שבשכבת הבקרה, המכסה את צד התכונה של כל התקן בנייר דבק. בסדר מחודש, ניקוב חור אחד עבור כל אחת מתוך 9 שכבת הזרימה, 24 שכבות בקרה של ערוץ השכבות ומשקע הזרימה היחיד של כל התקן. הכה את המכשיר כאשר הצד הפונה כלפי מעלה, באמצעות מצלמה כדי להבטיח חורים מנוקבים בתוך גבולות התכונה. עבור כל התקן, נקה שקופית מיקרוסקופ אחת עם איזופנול ואצטון וייבש את השקופיות תחת זרם N2. לאחר מכן, הניחו את שקופיות המיקרוסקופ על צלחת חמה שנקבעה ל-150 ° c עבור 15 דקות. השתמש פלזמה חמצן לקשור את המכשירים PDMS אל שקופיות זכוכית, החלת כוח ashing ינג של 50 W עבור 45 s. ודא כי הצד של ההתקן פונה כלפי מעלה בעת ההדבקה. לאחר השלמת, המקום התכונה המכשיר בצד למטה על שקופית הזכוכית, הפעלת לחץ כדי להסיר גז לכוד בין המשטחים. מניחים את המכשירים הקשורים על צלחת חם להגדיר 110 ° c עבור 1 h. ניתן להניח את המשקולות על גבי המכשירים כדי לשפר את הדבקה של המכשיר. 3. התקנת חומרה הערה: כדי להשיג שליטה על השבבים המיקרופלואידים, מספר רב של חומרה צריך להיות מותקן ומחובר זה לזה. שלוש קבוצות חומרה מסוימות נדרשות: 1) מערכת בקרה פניאומטית עבור ערוצי הבקרה, 2) וסת הלחץ הפניאומטי לשלוט בזרימת ריאגנטים התגובה בתוך המכשיר, ו 3) מערכת קירור לצנן את פתרון התגובה IVTT לפני הזרקה לתוך המכשיר המיקרופלואידיג. סקירה של התקנת החומרה מסופקת באיור 1. יש לציין כי הפרוטוקולים המסופקים כאן לנסות להיות כללי ככל האפשר, עם זאת חלקים ספציפיים של ציוד מסוים בשימוש בכל המחקר שלנו מוזכרים. כל החומרה יכולה להיות מוחלפת בחלופות היכולות לבצע את אותה פונקציה. במקרים כאלה, ניתן להשתמש בפרוטוקולים כדי לחלק את השלבים הכלליים הדרושים להגדרת המערכת והדרישות של כל אחד מהרכיבים. כיוונוני חומרה חלופיים מוצגים על ידי בראור ואח ‘.48 ולבנים ורחובות49. מערכת בקרה פניאומטית (ראה איור 2) באמצעות פרוטוקול היצרנים, צור חיבור TCP בין בקר אפיק השדות ותחנת העבודה של המשתמש. השתמש בתוכנת בקרה (בתנאי כקבצים משלימים) כדי להלחין פקודות MODBUS אשר נשלחים באמצעות חיבור TCP לבקר, ולהפעיל את שסתומי סולנואיד. הרחיבו את בקר השדה עם שמונה מודולי פלט דיגיטליים בעלי ארבעה ערוצים, אחד עבור כל שסתום חשמלי שנעשה בו שימוש. כל שסתום חשמלי. משתלט על סיכת חיבור חבר את החוט החיובי לאחד מארבעת התפוקות החיוביות באחד ממודולי הפלט הדיגיטליים תוך חיבור התיל השלילי לאחת מיציאות הקרקע של מודולי הפלט הדיגיטליים.הערה: כדי לקבל את המערכת לפעול כראוי, סולונואידים צריך להיות מחובר בשיטתיות, עם הסולנואיד הראשון מחובר ליציאת הפלט הראשונה, הסולנואיד השני ליציאת פלט השני וכן הלאה. במערכת שלנו, שני מערכי שסתומים משמשים עם 8 ו -22 שסתומים סולנואיד בהתאמה. יציאות הפלט 1-8 מתחברות למערך של 8 שסתומים, ויציאות הפלט 9-30 מתחברות למערך של 22 שסתומים. חיבור שני מערכי שסתומים למקור אוויר דחוס באמצעות 1/4 “אבובים. השתמש ברגולטורים לחץ כדי לקבוע את הלחץ של מערך 22-שסתום ל 3 בר, ואת מערך 8 שסתומים ל 1 בר. תקנות לחץ זרימה (ראה איור 3)הערה: כדי להזרים נוזלים דרך שכבת הזרימה של התקן microflu, c, מסחרית זמין 4-הנמל מווסת משמש. לחץ הפלט של כל יציאה מוסדר באמצעות תוכנה המסופקת עם בקר הלחץ. חבר את וסת הלחץ למחשב באמצעות מחבר ה-USB שסופק. חבר את וסת הלחץ למקור אוויר דחוס, להבטיח כי הלחץ המסופק אינו עולה על הלחץ המקסימלי המותר על ידי הרגולטור. לחבר לורר זכר 3/32 “בארב מחבר לכל אחת מארבע הנשים יציאות לנעול הפלט של וסת הלחץ. לחבר אורך של אבובים רך (OD: 3 מ”מ, מזהה: 1 מ”מ, L: 10 ס מ) לבארב. לחבר את השני זכר Luer כדי 3/32 “בארב מחבר לקצה הפתוח של אבובים רכים ולצרף את זה ליציאות מחבר מאגר נוזלים. השתמש בתוכנה שסופקו כדי להגדיר את הלחץ הרצוי של כל משקע של הרגולטור זרם, pressurising של ריאגנטים מאוחסן בתוך המאגרים כדי לגרום לזרימת הריאגנטים לתוך המכשיר microfluidic. החיבור של המאגרים למכשיר מיקרופלואידיג יידונו בסעיף 4.2. התקנת צינון מחוץ לשבב (ראה איור 4) השתמש אבובים PVC (OD: 10 מ”מ, מזהה: 6 מ”מ) כדי לחבר את מערכת קירור המים לבלוק המים הקרים באמצעות אביזרי דחיסה. ממלאים את מאגר הנוזלים של מערכת קירור המים עם קירור בעדינות להטות את היחידה כדי לתפוס את האוויר לכוד, ברציפות הוספת קירור למאגר כדי להבטיח שהוא נשאר מלא. כאשר כל הגז מוסר מן המערכת, למלא את המאגר כ 90-95% של הנפח המקסימלי שלה. מצופפי סליל (OD: 0.042 “, מזהה: 0.022”) על הפנים הקרות של האלמנט פלוייה ולאבטח את זה עם קלטת. ודאו שקצה אחד של צינורות המים מחובר למאגרים של מערכת בקרת הלחץ בשכבת הזרימה (כמתואר בסעיף 4.3). הקצה השני של הצינורות צריך לבלוט לא יותר מאשר 1 ס מ מפני השטח של פלטייר. הכנס אורך של 5 – 10 ס מ צינורות הצצה (OD: 0.794 מ”מ, ID: 0.127 מ”מ) לקצה הבולט של הצינורות. מילוי הצינורות והחיבור למכשיר המיקרו-פלואידיג מוסבר עוד בסעיף 4.3. הניחו את הפנים החמות של אלמנט פלטייר על הצלחת הקרה של בלוק המים, והחלה תרכובת תרמית מספיקה לשני הפרצופים. ודא שהאבובים, האלמנט הפלטייר ובלוק הקירור נמצאים במגע ישיר אחד עם השני בכל עת. חבר את הרכיב Peltier לבקר הטמפרטורה (באמצעות מחבר אפיק טורי), כך שמתח החשמלי המסופק לפלטייר יכול להיות מוסדר. במקום בטוח תרמיסטור על המשטח פלוייה, חיבור הפלט בקר הטמפרטורה. לאחר שהדליק את מצנן המים, התאם את המתח המסופק לפלטייר עד שטמפרטורת הטמפרטורה תהיה יציבה ב -4 ° c.הערה: באמצעות התקנה זו, טמפרטורת הפלטייר נשלטת באופן ידני על-ידי התאמת המתח המסופק, בעוד שהתרמוסטור משמש רק לניטור הטמפרטורה. 4. הכנת ניסוי הערה: לפני תחילת הניסוי, המכשיר מיקרופלואידיג חייב להיות מוכן, ואת ריאגנטים התגובה חייב להיות מוכנס צינורות הנכון להזרקה לתוך המכשיר. סעיף זה ידון: 1) הקשר של צינורות ערוץ הבקרה למכשיר, 2. הקשר של ריאגנטים הזרימה הבלתי מקורר למכשיר, ו-3) החיבור של מקורר הריאגנטים הצינור הפנימי למכשיר. חיבור צינורות ערוץ הבקרה עבור כל אחד מערוצי הבקרה של התקן microflu, לחתוך אורך של אבובים (OD: 0.06 “, מזהה: 0.02”). בקצה אחד, הכנס את הסיכה של 23 G, 1/2 “לוייר stub ובנוסף להוסיף את הפין חיבור נירוסטה (OD: 0.65 מ”מ, מזהה: 0.35 מ”מ, L: 8 מ”מ). לחבר את stub Luer לזכר לואר כדי 3/32 “בארב מחבר ניילון. הכנס את בארב של המחבר לאורך של צינורות פוליאוריטן (OD: 4 מ”מ, מזהה: 2.5 מ”מ). הכנס את צינורות הפוליאורתן האלה ישירות לתוך אחד משסתומים הסולנואיד. צרף a 23 G, 1/2 “Luer stub למזרק ולהכניס את זה לתוך קצר (3-4 ס מ) פיסת אבובים (OD: 0.06”, מזהה: 0.02 “). מניחים את הקצה הפתוח של אבובים זה לתוך מאגר של מים באולטרטהורים ולמלא את המזרק עם מים באולטרטהורים. מספר כל ערוץ בקרה של התקן microflu, c כמוצג באיור 5. עבור כל ערוץ (למעט ערוצי בקרה 1 עד 3, אשר אינם מלאים מים), למצוא את הצינורות המתאימים (מחובר לשסתומים הסולנואיד) ולהכניס סיכת מתכת לתוך הקצה הפתוח של הצינורות המחוברים המזרק. הכנס מים לתוך צינור תעלת הבקרה עד שמחצית האורך התמלא. לנתק את אבובים מן המזרק ולהכניס את הפין מחבר פלדת אל-חלד לתוך החור המתאים של המכשיר microfluidic. חזור על הפעולה עבור כל ערוצי הבקרה. השתמש בממשק הבקרה כדי לפתוח את כל שסתומים סולנואיד. זה יהיה ללחץ על הנוזל בתוך אבובים ערוץ הבקרה, לאלץ אותו לתוך המכשיר microflu, ולסגור את כל שסתומים מבוסס קרום בתוך המכשיר. דוגמה לקרומים פתוחים וסגורים בתוך המכשיר מקבלים באיור 6. חיבור ריאגנטים לא מקורר למכשיר עבור כל אחד מהריאגנטים הבלתי מקורר, חותכים אורך של אבובים (OD: 0.06 “, ID: 0.02”) כדי לחבר את שקע המאגר להתקן microfluidic. קח קצה אחד של אבובים ולהכניס את זה לתוך המאגר, להבטיח כי אבובים מגיע לבסיס של המאגר. לשקע צינור מאגר צריך להיות הידק כגון כי חותם האוויר הדוק מושגת. הכנס סיכת חיבור נירוסטה (OD: 0.65 מ”מ, מזהה: 0.35 מ”מ, L: 8 מ”מ) לקצה הפתוח של אבובים. הצמד 23 G, 1/2 “Luer stub לסוף מזרק קטן (1 מ ל). הוסף אורך קצר של אבובים (OD: 0.06 “, מזהה: 0.02”) ל-stub של Luer. הצבת הקצה של צינורות לתוך התמיסה הכימית הרצויה, למלא את המזרק עם הכימית. הכנס את הסיכה מחבר פלדת אל-חלד לתוך אבובים פוליאוריטן מחובר המזרק ולמלא את אבובים עם הכימית. כאשר משתמשים באמצעי התגובה הקטנים, הריאקציה לא תיכנס למאגר, והאבובים עצמו יפעלו כמאגר. נתק את המזרק והכנס את סיכת המחבר לאחד מחורי הזרם של התקן המיקרו-פלואידיג. לחץ על כל המאגרים באמצעות תוכנת וסת הלחץ כדי לכפות את הריאגנטים לתוך המכשיר microfluidic. חיבור נוזלים מקורר למכשיר המיקרופלואידיג ודא שרכיב מצנן המים ופלטייר הופעל, כאשר טמפרטורת פני השטח של הפלטייר מוגדרת ל-4 ° c. הר את ההתקנה קירור קרוב למכשיר מיקרופלואידיג ככל האפשר, ממזער את אמצעי האחסון הבלתי מקורר בין הפלטייר לבין כניסת המכשיר. חברו את הקצה הפתוח של צינורות המים לאבובים המחוברים לאחד מאגרי הנוזלים (כמתואר בסעיף 4.2) באמצעות סיכת מחבר פלדת אל-חלד (OD: 0.65 מ”מ, מזהה: 0.35 מ”מ, L: 8 מ”מ). לחבר מזרק קטן (1 מ ל) ל stub Luer (23 G, 1/2 “) עם אורך קצר של אבובים (OD: 0.06”, מזהה: 0.02 “) מצורף לסוף. מלא את המזרק עם התגובה להיות מקורר (כאן, פתרון תגובות IVTT). לחבר את אבובים להציץ למזרק דרך אבובים החיבור להחיל לחץ תמידי על המזרק, לאלץ את הכימית דרך אבובים להציץ לתוך צינורות מצופפי. נתקו את צינורות ההצצה מהמזרק והכניסו אותו ישירות לתוך אחד מערוצי הזרימה של המכשיר המיקרו-פלואידיג. כאשר הלחץ מוחל באמצעות תוכנת וסת הלחץ מגיב מקורר ייאלץ לתוך המכשיר microflu, c. 5. ניסויים הערה: לפני ביצוע ניסויים כל החיבורים חומרה ואבובים מפורט בסעיפים 3 ו 4 יש להשלים, ואת כל הריאגנטים צריך להיות מחובר למכשיר. לאחר מכן ניתן לחלק את ההליך הניסיוני לארבעה חלקים נפרדים: 1. העמסת מכשיר המיקרו-פלואידיג, 2) הכנת המיקרוסקופ, 3) הכיול של המכשיר, ו-4. ביצוע הניסוי. ממשק הבקרה הווירטואלי המותאם אישית (ראה איור 7) שנעשה בו שימוש במהלך מחקר זה מסופק כמשאב משלים דרך הרשימה חומרים) טעינת התקן המיקרו-פלואידיג מניחים את המכשיר microflu, עם כל השליטה ושכבת הזרימה אבובים המצורפת לשלב המיקרוסקופ ולסגור כל הפתחים על החממה. הגדר את טמפרטורת הסביבה של החממה ל -29 ° c. ודא שמערכת הקירור הופעלה והיא מוגדרת ל-4 ° צ’ לפני התחלת הניסוי. ודא שכל ערוצי הזרימה והבקרה מוזרמים מלחץ. הגדר את הלחץ של ערוצי שליטה 1-3 ב 1 בר, ו לחץ על ערוצי בקרה 9-29 ב 3 בר. ריאגנטים דורשים לחץ של בין 20 ו 100 mbar להיות מיושם על מאגרי הנוזלים באמצעות תוכנת וסת הלחץ. להסיר את האוויר מהמכשיר microfluidic באמצעות אחד הריאגנטים. סגור את השקע של המכשיר (לחץ לחשמל בערוץ 29) ובמקביל להפחית את הלחץ על ערוצי שליטה 1-3, ו 15-28. לאחר מכן באופן סלקטיבי להפחית את הלחץ על ערוצי הבקרה של ריבוב כדי לאפשר הכימית שנבחר לזרום לתוך המכשיר. השתמש במיקרוסקופ כדי לפקח על הסרת האוויר.הערה: במקרה זה ריאגנטים לא טוען לתוך המכשיר כראוי, או כי בועות האוויר אינם מוסרים, הלחץ יכול להיות גדל עד 350 mbar. ודא שכל הריאגנטים זורם כראוי, מבלי להציג אוויר-באמצעות הפונקציה סומק בתוכנת הבקרה. ניטור של זרימת הנוזלים יכול להיות פשוט יותר על ידי הטעינה הראשון fluorophore וניטור העקירה שלה על ידי ריאגנטים בודדים. הכנת המיקרוסקופ באמצעות המיקרוסקופ, לאתר את כל נקודות עניין (נקודה אחת בתוך כל הכור הוא מספיק) בתוך המכשיר microflu, ולאחסן את נקודות הציון שלהם. נקודות אלה יושבו במהלך הכיול והתהליכים הניסיוניים.הערה: במהלך הכיול וההליכים הניסיוניים הכלולים בתוכנת הבקרה, המיקרוסקופ מורה מדי פעם ללכוד תמונות בקואורדינטות שאוחסנו בעבר. כדי להשיג זאת, תוכנת הבקרה מתקשרת עם תוכנת המיקרוסקופ, ליידע אותו להקליט תמונות חדשות. תקשורת זו היא ייחודית לכל הגדרת מיקרוסקופ, וככזה פונקציונליות זו שונתה בתוך ממשק התוכנה שסופקו. בתנאי הוא קובץ הפעלה דמה, אשר ניתן לשנות על ידי משתמש הקצה עבור תאימות עם מערכת המיקרוסקופ שלהם. מכייל את המכשיר המיקרו-פלואידיג לקבוע את כמות הנוזלים שנעקרו מכל כור במהלך צעד אחד של זרימה רציפה (רצף משאבה המסופק על ידי ערוצי הבקרה הפריסטסטי בקרה 15-17, הכולל 6 פקודות MODBUS שבוצעו ברצף), על-ידי ביצוע פרוטוקול הכיול שסופקו בחבילת התוכנה. הגדר את שדות הנתונים הבאים בתוך תוכנת הבקרה: ערוץ מאגרמידע, ערוץ Fluorophore, מספר מחזורי דילול (ברירת המחדל היא 10 מדלל), מספר שלבי הזרימה הנכנס (ברירת המחדל הוא 15 שלבים), מספר מחזורי ערבוב (ברירת המחדל היא 4 מחזורי), והזמן בין ערבוב מחזורי (ברירת המחדל הוא 0 שניות). הפעל את הכיול על-ידי לחיצה על בצע ניסוי כיול.הערה: במהלך תהליך הכיול, כל הכורים מלאים בצבעי פלואורוופפור ותמונות מוקלטות. לאחר מכן, סדרה של מדלל מבוצעים כאשר הגבלה מונה לתוך הכורים (מבוסס על מספר קבוע של שלבי זרימה), ובכך לחלק את fluorophore. לאחר ערבוב יסודי, תמונות חדשות נלקחים. תהליך זה חוזר למספר הקבוע של מחזורי הדילול. עם סיום הכיול, בצע את השלבים שהוצגו על-ידי תוכנת הבקרה, וסיים את ניתוח ניסוי הכיול.הערה: הניתוח יספק למשתמשים את יחס הרענון עבור כל כור המבוסס על ירידת הזריחה שנרשמה במהלך כל מחזור דילול . ערך זה מציין את החלק של אמצעי האחסון של המגיב שנעקרו על-ידי המספר הקבוע של צעדיזרימה. בתורו, יהיה להשתמש בערך זה במהלך ניסויים כדי לקבוע כמה שלבי זרימה נדרשים לצורך הזחה של אמצעי אחסון מסוים של המגיב. ביצוע הניסוי הגדר את הערכים הדרושים עבור הניסוי הרצוי בממשק הבקרה הווירטואלית. ‘ קריטי ‘ הוא שבר הרענון [%] הקובע את כמות אמצעי האחסון של המגיב לכל מחזור ניסיוני ויש לקבוע בין 15 ל-40%.הערה: הפרוטוקול הניסיוני הספציפי יקבע אילו שדות של ממשק הפקד יש להגדיר לפני התחלת הניסוי. כמה קידוד קטין יידרש להתאים את ממשק הבקרה עבור ניסויים חדשניים. הפעל את הפרוטוקול הנסיוני על-ידי לחיצה על לחצן בצע ניסוי בממשק הבקרה.הערה: התוכנה המסופקת מאתחלת ביטוי חלבון פשוט. כורים 1 ו 8 מנוצלים כפקדים, בעוד הכורים 2-7 הבית ניסויים זהים. כאן, 75% של נפח הכור כולל פתרון ivtt, ו -25% הוא או המים אלקטרופורזה או 2.5 ליניארי לינארי של פתרון DNA. דילול מתרחשים כל 15 דקות, עם 30% של נפח הכור העקורים לדילול. תמונות נרשמות בסוף כל מחזור דילול. 6. ניתוח נתונים הערה: קבצי script סופקו לניתוח התמונות (עיין בקבצים משלימים או בטבלת החומרים), תוך שימוש בחבילת הניתוח ‘ bfopen ‘ , הדרושה לסקירה של קבצי ‘. nd2’ (שסופקו על-ידי ה הגדרת מיקרוסקופ). הפעל את קובץ ה-script של הניתוח “Calibrationscript. m” ובבקשה לבחור באחד הקבצים הרצויים ‘. nd2’. תמונת כור אחת תוצג בהתאם לעוצמת התמונה הנכונה. השתמשו במחוון כדי למטב את עוצמת התמונה, כך שקצות הערוץ המיקרופלואידיג גלויים בבירור. . תמונה של הכור יוצג בתוך התמונה הזאת, בחר אזור בתוך תעלת המגיב שבה יש לקבוע את עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית.הערה: עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית של כל המחולל, עבור כל תמונה מוקלטת ייקבע עם התוצאות המוצגות בעלילה פשוטה, המאפשר ויזוליזציה של התוצאות.

Representative Results

כדי להדגים את האפקטיביות של פלטפורמת microfluidic רובת שכבות עבור הולכה של ניסויים ivtt, ההתקנה המתוארת שימש כדי לבטא את החלבון מנטרול. הניסוי נערך באופן מסחרי זמין30 ivtt התגובה תערובת-הכוללת את כל הצורך שעתוק מרכיב תרגום הערך-שיושלם עם מצעים התגובה ותבניות DNA. הניסויים נערכו בטמפרטורה של 29 ° c; הטמפרטורה שנמצאה אופטימלית עבור ביטוי ה-IVTT של חלבונים. המכשיר מיקרופלואידיג בעלי תשעה אינשופונים ייחודיים, שמהם השתמשו בארבעה במהלך ניסוי זה. הראשון הכיל את התערובת מסחרית IVTT התגובה. תערובת התגובה IVTT להכיל את כל הרכיבים הדרושים כדי לבטא חלבונים בהצלחה עם זאת, התאים מטוהרים התווסף לתערובת התגובה-בריכוז הסופי של 1.3 μM-לפני הטעינה לתוך המכשיר microfluidic. התוספת של החלבון משמש למזער את השפלה של מינים DNA ליניארי בעת ביצוע הניסויים. באופן מכריע, תערובת ה-IVTT הוזרקה לתוך צינור פוליטאואתילן (מצופה) על רכיב פלטייר עם טמפרטורת פני השטח של 4 ° c כדי לצנן את הפתרון לפני ההזרקה לתוך המכשיר מיקרופלואידיג; מניעת השפלה של פתרון התגובה לפני השימוש בו. מיקרו-נשא פוליאטר אתר קטון (להציץ) אבובים שימש כדי לחבר את אבובים מצוייףעוזב את השטח אלמנט Peltier עם המכשיר microflu, הפחתת הנפח של תערובת התגובה IVTT לא להיות מקורר. הפתרון השני הוכנס לתוך המכשיר הכיל את הקידוד ליניארי של תבנית ה-DNA עבור המגנטיות-מומס במים באולטרה-טהורות-בריכוז של 10 ננומטר. הפתרון השלישי, מים באולטרטהורים, שימש מספר מטרות במהלך ההליכים הניסיוניים. בעיקר, המים באולטרסאונד שימשו כדי להבטיח כי נפח העקורים לדילול היה שווה עבור כל הכורים, מתנהג כתחליף ל-DNA בתגובות הבקרה. בנוסף, מים באולטרסאונד היה שימש גם כדי לדלל את fluorophore במהלך כיול המכשיר לשטוף את נפח מת של המכשיר בעת מעבר בין ריאגנטים. הפתרון הסופי שהוכנס למכשיר היה פתרון FITC-dextran מטוהר (25 μM) נדרש לבצע את כיול המכשיר הראשוני. ה-DNA, המים, ו fluorophore פתרונות הוזרקו לתוך אבובים (0.02 “ID, 0.06” OD) אשר ניתן להוסיף לאחר מכן לתוך אחד הערוצים הנכנסים של המכשיר microfluidic לפי סעיף 4.2 של הפרוטוקולים. בתור שכאלה, הפתרונות הללו אוחסנו ב -29 ° c לכל הניסויים. הגשמה של ערוצי הבקרה של המכשיר microflu, מושגת באמצעות תוכנת בקרה מותאמת אישית שבה כל אחד מערוצי הבקרה יכול להיות מותאם באופן אינדיבידואלי. ההוצאה להורג של תגובות IVTT ממושכות לא ניתן להשיג באמצעות תהליך ידני זה ודורש שימוש בפרוטוקולים אוטומטיים משולבים בתוך תוכנת הבקרה. בעת הכנת מכשיר מיקרופלואידיג לניסויים, פרוטוקולים אוטומטיים דומים יכולים להיות מנוצל כדי לבצע מספר תהליכים שימושיים: שטיפה של נפח המכשיר מת עם מגיב חדש, ערבוב של ריאגנטים בתוך הכור הטבעת, ואת הטעינה של מגיב חדש לכור תוך הנמכת נפח שווה של הפתרון הנוכחי. בנוסף, קיימים שני תהליכים מורכבים: הולכה של כיול התקן, והוצאה להורג של ביטוי ממושך של חלבון ללא תא. כל התהליכים הנ ל ניתן לבצע בקלות מתוך הממשק הראשי, לצד היכולת להגדיר פרמטרים מרובים כדי לשנות את הגדרות התהליך הספציפי, כגון ערוץ הזרימה הנכנס, עוצמת הזרימה הנכנס, ומשך ערבוב. עקב תנודות בלחץ ופגמים במהלך ייצור המכשיר microflu, הנפח של עקורים נוזלים במהלך מחזור הזרקה אחת יכול להשתנות בין התקנים. ככזה, לפני ביצוע ניסויים IVTT, נפח המגיב העקורים לכל מחזור הזרקה (רענון שבר) נקבע. כיול זה דורש מילוי של כל שמונת הכורים עם פתרון התייחסות פלורסנט. במקרה זה, השתמשו בפתרון FITC-dextran מטוהר (25 μM). לאחר מכן, הכורים מדולל 10 פעמים עם מים באולטרטהורים. על ידי מדידת הירידה של הזריחה לכל מחזור דילול עבור כל כור, הנפח של עקורים נוזלים במהלך מחזור הזרקה אחת נקבע. בתוך תוכנת הבקרה, ערך זה ( יחס הרענון) הוקלט לשימוש במהלך הניסוי ivtt. באופן מכריע, כדי להסביר וריאציות בקצב הזרימה על פני המכשיר, כמו גם אי-התאמות באמצעי האחסון הבודדים, יחס הרענון נקבע ומאוחסן עבור כל כור בודד. הרצף של מילוי ודילול הכורים נערך באופן אוטומטי באמצעות תוכנית כיול לבצע המהווה חלק של תוכנת הבקרה. תוצאות ניסוי הכיול מוצגות באיור 8. התהליך המורכב ביותר שתוכנן מראש מבצע ניסוי IVTT במשך זמן ארוך ומאפשר למשתמשים ליזום את הניסוי ולאחר מכן לאפשר לו לפעול ללא השגחה עד להשלמתה. לאורך הניסוי, כורים 1 ו-5 שימשו כחללים ריקים, כאשר רק מים נוספים לכורים במהלך הדילול. כורים 2 ו-6 היו מנוצלים כפקדים שליליים והכיל רק פתרון התגובה IVTT ו מים באולטרטהור. הכורים הנותרים (3, 4, 7, ו 8) הכיל את פתרונות התגובה IVTT ו 2.5 ננומטר של קידוד DNA ליניארי עבור הגן מנטרול. מאתחלים של הכורים מושגת על ידי מילוי מלא של כל הכורים (למעט 1 ו -5) עם פתרון התגובה IVTT, לפני 25% של נפח הכור נעקרו באמצעות מים באולטרטהורים. להלן, ההזרקה המחזורית של הריאגנטים לתוך הכורים הופעלה. הניסוי נערך כזה ריאגנטים חדש הוזרק לתוך הכורים כל 14.7 דקות, עם 30% של נפח הכור העקורים במהלך כל מחזור דילול. הרכב של כל זריקה היה כזה 75% של נוזל מוזרק מורכב הפתרון IVTT טריים, בעוד 25% הנותרים מורכב או DNA או מים באולטרסאונד. בעקבות כל הזרקה של ריאגנטים חדש הכורים היו מעורבים ברציפות, לאחר שדמות הקרינה של כל כור הוקלט באמצעות המיקרוסקופ. התגובה הותר לאחר מכן לרוץ ברציפות עבור 68 מחזורים, וכתוצאה מכך משך ניסיוני של 16.5 h. תוצאות ניסוי זה ניתנות באיור 9. בעת ביצוע ניסויים ממושכים של IVTT, קיימות שתי סיבות עיקריות לכישלון התגובה; מבוא האוויר לתוך המכשיר microflu, או השפלה של פתרון התגובה IVTT. התרחשות של אוויר בתוך המכשיר microflu, הוא בדרך כלל התוצאה הישירה של בועות אוויר קטן קיים בפתרונות זרימה, אשר מוזרק לאחר מכן לתוך המכשיר microfluidic. עם הזנת המכשיר, הנוכחות של האוויר מעכב את הזרימה הנכונה של נוזלים, לפיה התגובות הם כבר לא רענון תקופתי מוביל היווצרות תגובות אצווה בתוך טבעות הכור. במקרים מסוימים, האוויר מוסר באיטיות מן המכשיר על ידי שטיפה חוזרת של ריאגנטים, ולאחר מכן התגובה ממשיכה כאמור (כפי שמוצג באיור 9). במקרים אחרים האוויר נשאר לכוד, וניתן להסירו רק על-ידי ביטול הניסוי ולאחר מכן החלת לחץ רציף (גבוה) על שכבת הזרימה של התקן microflu, מקביל לתהליך המילוי המתואר בסעיף 5.1 של הפרוטוקולים. במהלך הניסויים שלנו התאים מאוחסנים בצינורות המוצוקיים על אלמנט פלטייר המוהקורר ל -4 ° c. שני האמצעים לסייע להגביל את השפלה של פתרון התגובה IVTT לאורך זמן, עם צינורות מצוטיים להבטיח אינטראקציה מוגבלת בין הצינורות ואת פתרון התגובה ואת הטמפרטורות הקרות שמירה על פונקציונלי (ביו) מולקולרי ערך רכיב הנדרש לביצוע IVTT. השפלה של פתרון התגובה מתרחשת-כתוצאה של חוסר הדדיות מספיק קירור או בלתי רצוי בין פתרון התגובה וסביבת האחסון-אז זה יהיה מוצג בפועל כהפחתה הדרגתית של חלבון יטוי לאורך זמן. לאחר השפל, פתרון תגובה IVTT לא ניתן לשחזר וניסוי חדש צריך להיות מוכן. איור 1. התקנת החומרה הדרושה לביצוע תגובות IVTT רציפות. A) סכמטי של התקנת החומרה. ב) צילום של הכיוונון המשמש לאורך כל כתב היד. היישום של מכשיר מיקרופלואידיג רב שכבתי לתגובות IVTT רציפה דורש הגדרת חומרה נרחבת כדי לווסת את לחץ הזרימה, להפעיל ערוצי בקרה, החום ותגובות מגניב ריאגנטים, לאחסן נוזלים, ואת התמונה המכשיר במהלך ניסויים. הניסויים מתבצעים בטמפרטורות של 30 ° c, אשר מושגת על ידי הצבת המיקרוסקופ בתוך חממה שנקבעה לטמפרטורה זו. כדי למנוע הידרדרות בפתרון תגובת ה-IVTT, הוא מאוחסן בתוך שכבות הגוף המתפתל מעל פני הקור של אלמנט פלטייר. הטמפרטורה של אלמנט פלאטייר מוגדרת ל-4 ° c, עם מצנן מים ובלוק מים המשמשים לשמירה על טמפרטורה זו. ריאגנטים אשר אינם דורשים קירור, מאוחסנים מאגרי נוזלים מחוץ לחממה המיקרוסקופ. לחץ קבוע מוחל על מאגרים אלה על ידי וסת הלחץ במחשב מבוקרת. בדרך זו, הנוזלים נאלצים דרך אבובים לשקע של המאגרים, אשר מתחברים ישירות לערוצי הזרימה הנכנס של המכשיר microfluidic. כל אחד מערוצי הבקרה של המכשיר המיקרופלואידיג מחובר לשסתום פניאומטי. כל מערך השסתומים נמצא. תחת לחץ תמידי פתיחת השסתום, מאפשר הלחץ של הנוזל בתוך אבובים המחבר את השסתום הפניאומטי לערוץ הבקרה של המכשיר microflu, ובכך פותח וסוגר את ממברנות PDMS שנמצאו בתוך המכשיר microfluidic. השסתומים הפניאומטיים נפתחים וסגורים באמצעות ממשק משתמש אשר מפקד על בקר באפיק (לא מוצג) כדי לפתוח ולסגור שסתומים פנאומטיים ספציפיים. דמות הותאמה מילורסואפו ואח ’22. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 2. מבט כולל על התקשרות השסתום הפניאומטית וערוץ הבקרה. מערך של 8 שסתומים מוצג עם שלושה חיבורי ערוץ בקרה המצוידים בשסתומים 1, 2 ו-3. אוויר דחוס ניתן לספק מערך שסתומים באמצעות 1/4 “אבובים. עבור הגשמה של ערוצי בקרה שני לחצים משמשים: 1 בר עבור ערוצי בקרת לחץ נמוך (1, 2, ו 3) ו 3 בר עבור ערוצי בקרת לחץ גבוה (9 עד 30, לא הראו כאן). אבובים יכול להיות מלא במים אלקטרופורזה והוכנס לתוך אחד מתוך ערוץ הבקרה מאפשר באמצעות סיכת נירוסטה מחבר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 3. סקירה של וסת הלחץ המסחרי ומערכת האגירה. וסת לחץ מסחרית זמין משמש כדי להזריק נוזלים לתוך שכבת הזרימה של התקן microfluidic רובת שכבות. חיבור בקר הלחץ למחשב מאפשר אפנון של הלחץ המשמש לביצוע זריקות הנוזלים. ריאגנטים ניתן לאחסן במאגר נוזל, אשר מחובר ישירות לוסת הלחץ. היישום של לחץ על המאגר מאלץ את הנוזל מתוך המאגר דרך אבובים לשקע. אבובים לשקע זה יכול להיות מחובר ישירות אחד האינלטס נוזלים של המכשיר microfluidic באמצעות סיכת נירוסטה מחבר. במקרה שנפח הכימית אינו מסוגל להגיע למאגר הנוזלים, אבובים השקע משמש כמאגר לצורך הצטברות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 4. סקירה של מערכת הקירור המשמש ריאגנטים תגובה מגניב. (משמאל) התקנת קירור מבודדת (מימין) הגדרת צינון בתוך המיקרוסקופ ומחובר למכשיר microfluidic. אלמנט פלטייר משמש כדי לצנן את פתרון התגובה IVTT לפני הזרקה לתוך המכשיר microfluidic. המנה הכימית מאוחסנת בתוך שפני הקור של אלמנט הפלטייר. אורך של אבובים הצצה משמש כדי להעביר את הנוזל מקורר למכשיר microflu, עם הקוטר הפנימי הקטן (0.005 “) למזער את נפח הכימית כבר לא להיות מקורר. לצד האבובים מתפתל, מוצב תרמיסטור, המאפשר ניטור טמפרטורה בזמן אמת על פני השטח של אלמנט פלטייר. המתח המוחל על הפלטייר מוגדר כך שטמפרטורת פני השטח של הפלטייר נותרת בין 0 ° צ’ לבין 4 ° c. כדי להסיר את החום העודף המופק על-ידי אלמנט פלטייר, הפנים החמות של הפלטייר ממוקמות נגד בלוק מקורר מים, עם תוספת סיליקון לכיור חום חינם המבטיח העברת חום אופטימלית בין שני הפרצופים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 5. מבט כולל על עיצוב המכשיר מיקרופלואידיג. הכור זרם מיקרופלואידיג לתגובות IVTT רציפה מורכב משמונה טבעות הכור, כל אחד עם נפח של 10.7 nL. תשעה מאפשרים לאפשר את הזרימה של תשעה פתרונות תגובה ייחודיים לתוך המכשיר. 24 ערוצי בקרה מווסת את זרימת הנוזלים בתוך המכשיר. בקרת ערוצים 9 עד 14 הטופס מרבב. ערוצי שליטה אלה צריך להיות בלחץ בכל עת כדי לעכב את זרימת הנוזלים לתוך המכשיר. ביטול הלחץ של שני ערוצי בקרה מאפשר בו זמנית את הזרימה השנייה של מגיב אחד. בקרת ערוצי 15, 16, ו -17 משמשים הפריסטלטית משאבה הריאגנטים לתוך המכשיר באופן מבוקר. בקרת ערוצים 18 עד 25 כל שליטה על הפרץ של אחד משמונת הכורים שנמצאו בתוך המכשיר. בקרת ערוץ 26 יכול לסגור את הערוץ סומק, ובכך לאלץ נוזל לתוך הכורים. בקרת ערוץ 27 מסייע במילוי הומוגנית של הכורים. בקרת ערוצים 28 ו -29 לווסת את שקעי הכור הטבעת ואת שקע ההתקן היחיד בהתאמה. לבסוף, בקרת ערוצים 1, 2, ו 3 משמשים הפריסטסטי משאבה הנוזל בתוך הכורים הטבעת, וכתוצאה מכך ערבוב של ריאגנטים. העיצוב של המכשיר מיקרופלואידיג הזה והדמות מותאמים מניידרהולטמאייר ואח ’29. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 6. שסתום מבוסס קרום בתוך המכשיר microfluidic. A) ערוץ זרימה בתוך המכשיר המיקרופלואידיג. ברקע ניתן לראות שני ערוצי בקרה. הערוצים הללו אינם מוזרמים וככאלה השסתומים פתוחים (נוזל יכול לזרום). ב) שני ערוצי הבקרה המצטלבים עם שכבת הזרימה בלחץ הדם, סוגרים את השסתומים (כלומר, זרימת הנוזלים מופרעת). עם הלחץ של ערוצי הבקרה, קרום PDMS דק המפריד בין הזרימה ושכבת השליטה של הערוצים הוא הסיט כלפי מעלה (שכבת השליטה נמצאת מתחת לשכבת הזרימה) אשר סוגרת את ערוץ שכבת הזרימה. עיגול שכבת הזרימה הוא קריטי בכדי להבטיח שהקרום המוזרם יסגור במלואו את ערוץ הזרימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 7. ממשק משתמש המשמש לשליטה בהתקן microfluidic. במהלך מחקר זה, ממשק בקרה מותאם אישית שימש כדי לשלוט בזרימת הנוזלים בתוך התקנים microfluidic. הממשק מאפשר למשתמשים להפעיל באופן אינדיבידואלי כל אחד מערוצי הבקרה (ממוספרים 1-3 ו 9-29), או לבצע פרוטוקולים מורכבים וכתוצאה מכך שטיפה וטעינה של ריאגנטים, כיול של המכשיר microflu, והוצאה להורג של ניסויים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 8. תוצאות של ניסוי כיול. במהלך ניסוי כיול, הכורים מלאים בפלואורופפור (25 μM FITC-Dextran) שאחריה מתועד עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית. לאחר מכן, סדרה של מדלל לעקוב, שם מספר מוגדר של צעדים תזרים (15) משמשים להזריק מים באולטרטהורים לתוך הכורים. אחרי כל דילול, הריאגנטים מעורבבים והזריחה נמדדת. הירידה בעוצמת הקרינה הפלואורסצנטית לדילול חושפת את נפח העקורים של טבעת המגיב למספר הקבוע של צעדי זרימה. ערך הנקרא יחס הרענון. A) העוצמה הממוצעת וסטיית התקן של כל שמונת הכורים מוצגים באדום, כאשר העקבות הבודדות מופיעות באפור. ב) יחס הרענון הממוצע וסטיית התקן מוצגים עבור כל שלב דילול באדום. יחסי רענון בודדים של כל כור בודד מוצגים באפור. ניתן לראות כי שבעה מתוך שמונת הכורים מראים התנהגות דומה מאוד, אך כור אחד מראה תנודות ביחס הרענון לאחר מחזור הדילול השביעי. זה מדגיש את הצורך יחסי רענון ייחודי עבור כל אחד הכורים, בניגוד לשימוש ביחס רענון ממוצע להזרקה של ריאגנטים לתוך הכורים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 9. תוצאות של ניסוי ה-IVTT המבטא את החלבון נטרול. תגובת IVTT ממושכת הופעלה כך 30% של נפח הכור העקורים כל 14.6 דקות. התגובה הותר לרוץ מעל 16 שעות לפני שהסתיים. שני כורים של המכשיר מיקרופלואידיג שימשו כחללים ריקים, עם מים באולטרסאונד בלבד להיות מוטס דרך הכורים לאורך הניסוי (כורים 1 ו -5). כל הכורים האחרים מורכבים 75% הפתרון התגובה IVTT ו 25% של המים באולטרסאונד (כורים 2 ו 6) או 2.5 ננומטר ליניארי תבניות DNA קידוד עבור הביטוי של נטרול (כורים 3, 4, 7, ו 8). בכל ארבעת הכורים שבו ה-DNA נוספה, יש הבעה ברורה ברור. שלושה מארבעת הכורים מספקים עוצמת קרינה דומה, עם כור אחד המציג אות זריחה נמוכה יותר. זה יכול להיגרם על ידי פער בזרימה וכתוצאה מכך פחות DNA הזנת הכור, או בשל וריאציות בממדי הכור. לאחר 14 שעות, העלייה פתאומית נתפסת באות של הכורים המכילים דנ א. הדבר נגרם על-ידי בועת אוויר הנכנסת לשכבת הזרימה של המכשיר המיקרו-פלואידיסי, ככל הנראה שמקורם באחד מפתרונות הזרימה הנכנס. השמנה של אוויר במכשיר microflu, מגביל באופן משמעותי את זרימת הנוזלים דרך הערוצים, לפיה לא ניתן להוסיף מכשירים טריים או להסיר מהכורים עד שהאוויר עבר. עם חידוש הזרימה, הניסוי חוזר לעוצמתו הקודמת של הקרינה הפלואורסצנטית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. קבצים משלימים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קבצים אלה. 

Discussion

מכשיר מיקרופלואידיג מבוססי PDMS מבוסס מרובת שכבות, ויכולתה לקיים תגובות IVTT לפרקי זמן ממושכים. למרות שמתאים ביותר לדוגמה ספציפית זו, ניתן להשתמש בטכנולוגיה זו עבור יישומים רבים אחרים. שליטה נוספת על זרימת נוזלים-לזווג עם היכולת לחדש ברציפות ריאגנטים תגובה תוך הסרת (על ידי) מוצרים-הוא אידיאלי עבור תגובות סינתזה רציפה, החקירה של התנהגויות דינמיות שונים, ו הסימולטני הולכה של וריאציות מרובות של תגובה אחת.

למרות תהליך הייצור הפשוט יחסית של התקנים מבוססי PDMS, השימוש בו דורש התקנה חומרה נרחבת. מערכי שסתומים, מווסתים לחץ, משאבות לחץ, אינקובטורים ויחידות קירור, המעבר מייצור לשימוש אינו אלמנטרי, ודורש השקעה ראשונית משמעותית. בנוסף, היכולת להגדיר בעקביות ולבצע ניסויים מוצלחים עם התקנים אלה דורש השקעה משמעותית בזמן; נקודה שכתב היד הזה מטרתו להתייחס אליה. עם זאת, במקום כלשהו, ניתן לשנות את ההתקנה כולה למגוון מטרות. יתר על כן, ההתקנה חומרה כוללת אלמנטים מודולריים רבים, אשר כל אחד מהם ניתן להרחיב כדי לאפשר מורכבים יותר עיצובים התקן microfluidic להיות מועסק. בנוסף, העיצוב המודולרי מאפשר להחליף רכיבי חומרה על-ידי חלופות מתפקדות באופן דומה, כך שמשתמשים אינם מוגבלים להתקנה הספציפית המתוארת כאן48,49.

שינויים בין התקנים נפרדים ובתנאים החיצוניים (כגון תנודות בלחץ) עלולים לגרום לאי בזמן ביצוע ניסויים באמצעות התקנים אלה. כדי לטפל בבעיה זו, יש לבצע כיול של המערכת לפני כל ניסוי, ולספק יחס רענון ייחודי לכל אחד מהכורים. בזמן שכיול מטפל בווריאציות התקן להתקן וניסוי-לניסוי, זהו תהליך הארוך בזמן ולא מושלם. נוזלים עם עוצמות שונות של ויסקוזה לא יזרום עם אותו קצב כאשר נחשף ללחץ זהה, וככזה ביצוע כיול עם מספר ריאגנטים לא יכול להניב יחסי רענוןזהים. אפקט זה הוא החליש על-ידי ניצול שלושה ערוצי שליטה למשאבת הפריסטסטי הריאגנטים לתוך המכשיר microflu, בניגוד לוויסות הזרימה על ידי שינוי הלחץ המסופק בלבד. כמוצא אחרון במקרים שבהם הפער בצמיגות גדול מאוד, יחס רענון ייחודי יכול להיות מיושם עבור כל מגיב בודד על ידי ביצוע ניסויים כיול מרובים.

השימוש של המשאבה הפריסטלטית כדי להזריק ריאגנטים לתוך המכשיר microflu, מחליש את ההשפעות של שימוש בפתרונות עם עוצמות משתנות, אולם הוא גם יוצר בעיה משנית. שימוש בצעדים נפרדים כדי לשאוב נוזלים לתוך המכשיר microflu, פירושו כי הרזולוציה של זריקות לתוך הכור בודד, מוגבל על ידי עוצמת הקול מוזרק בעת ביצוע מחזור משאבת יחיד. בתוך המחקר שלנו ערך זה נקבע במהלך הכיול-הוא שווה כ %1, המציין כי מחזור משאבה אחת מהווה כ 1% של נפח המגיב (על 0.1 nL). ככזה, הוספת 30% של נפח המגיב דורש ביצוע של 30 מחזורי משאבה, עם 23 מחזורי משאבה של פתרון התגובה IVTT להתווסף, ורק 7 מחזורי משאבה של דנ א או מים באולטרסאונד להתווסף. למרות מספיק עבור המחקר שלנו, פרוטוקולים ניסיוניים אלטרנטיביים עלול להיתקל בבעיות כאשר מנסים להוסיף מספר גדול יותר של ריאגנטים ייחודי, להשתמש בשבר רענון נמוך יותר, או להוסיף כמויות קטנות יותר של מגיב אחד לכור. במקרים כאלה, עיצוב המכשיר microfluidic ניתן להתאים כדי לספק כורים עם נפח גדול יותר. דוגמה לכך מדווחת בניניהולטמאייר ואח ‘36.

באופן מכריע, המכשיר המתואר בכתב יד זה מאפשר לתגובות להיות מתמשך עבור משכים ממושכים וכתוצאה מכך המצב הקבוע שעתוק ושיעורי תרגום. על ידי הזרקת מדי פעם ריאגנטים חדש לתוך הכורים-והסרת התגובה (על ידי) מוצרים-התגובות הן מתמשכת התנהגויות דינמיות מורכבות ניתן לפקח. בדרך זו, פלטפורמה נוצרה כי במידה מסוימת-מחקה את הסביבה הסלולרית. יתר על כן, פלטפורמה זו מאפשרת את המחקר של הדינמיקה המערכת, על ידי התאמת התקופה בין זריקות לבין הרכב ספציפי של הזריקות. כתוצאה מכך, התקנים מיקרופלואידים מרובי שכבות אלה הם כלי רב עוצמה עבור המאפיינים והאופטימיזציה של רשתות סינטתיים הרומן אשר מציגים התנהגות דינמית מורכבת.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכת על ידי מועצת המחקר האירופית, ERC (פרויקט n. 677313 BioCircuit) NWO-VIDI מענק מארגון הולנד למחקר מדעי (NWO, 723.016.003), מימון של משרד החינוך, תרבות ומדע (כבידה תוכניות, 024.001.035 & 024.003.013), התוכנית מדעי הגבול האנושי הענק RGP0032/2015, מועצת המחקר האירופית תחת אופק של האיחוד האירופי 2020 מחקר וחדשנות תוכנית גרנט 723106, ו השוויצרי הלאומי המדע הקרן גרנט 200021_182019.

Materials

Reagents
Acetone VWR 20063.365
AZ 40 XT Merck KGaA (Darmstadt, Germany) – Positive Photoresist
AZ 726 MIF Developer Merck KGaA (Darmstadt, Germany) – Developer Positive Photoresist
Isopropanol Merck KGaA (Darmstadt, Germany) 109634
Microscope slides VWR ECN 631-1550
mr Dev 600 Microresist Technology GmbH (Berlin, Germany) – Developer Negative Photoresist
Silicon Free Heat Sink Grease Circuit Works CW7270 Thermal Compound
Silicon wafers Silicon Materials – <1-0-0> orientation, 100 mm diameter, 525 µm thickness
SU-8 3050 Microchem Corp. (Newton, MA) – Negative Photoresist
Sylgard 184 Elastomer Kit (PDMS) The Dow Chemical Company 01317318
trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane Sigma-Aldrich 448931-10G
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
4 channel digital input/output module WAGO Kontakttechnik GmbH 750-504 8x
Camera lens The Imaging Source –
Compression fitting Koolance, Inc. FIT-V06X10 Fitting for tubing with 6mm ID and 10mm OD. 4x
Controller end module WAGO Kontakttechnik GmbH 750-600
Device connecting tubing Saint-Gobain Performance Plastics AAD04103 0.02" ID, 0.06" OD, Tygon Tubing (ND-100-80)
Device connector pins Unimed SA (Lausanne, Switserland) 200.010-A AISI 304 tubing, 0.35mm ID, 0.65mm OD, 8mm L
Ethernet Controller WAGO Kontakttechnik GmbH 750-881
Female bus connector Encitech DTCK15-DBS-K 15 pole female bus connector
Fluid reservoirs Fluigent Fluiwell-4C
Fluigent pressure system Fluigent MFCS-EZ 0 – 345 mbar
Hg short arc lamp Advanced Radiation Corporation – 350W
Hot plate Torrey Pines Scientific HP61
Inverted microscope Nikon Instruments Eclipse Ti-E
LabVIEW Software de Greef Lab, Eindhoven University of Technology https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software
Liquid coolant Koolance, Inc. LIQ-705CL-B
Luer stubs Instech Laboratories, Inc. LS23
Male Luer to barb connectors Cole Parmer 45505-32 3/32" ID
Matlab Software de Greef Lab, Eindhoven University of Technology https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software
Microcamera The Imaging Source DMK 42AUC03
Microscope camera Hamamatsu Photonics OrcaFlash4.0 V2 (C11440-22CU)
Orbital shaker Cole Parmer EW-513000-05
Oven Thermo Scientific Heraeus T6P 50045757
Oxygen plasma asher Quorum Technologies K1050X
PDMS puncher SYNEO Accu-Pucnh MP10
PEEK tubing Trajan 1301005001-5F 0.005" ID, 1/32" OD, Red
Peltier element European Thermodynamics APH-127-10-25-S
Peltier temperature controller Warner Instruments CL-100
Photomask CAD/Art Services, Inc. –
Photomask Design Maerkl Lab, EPFL https://zenodo.org/record/886937#.XBzpA8-2nOQ
Pneumatic valve array FESTO – 1x 22 valve array and 1x 8 valve array, Normally closed valves.
Power adapter Koolance, Inc. ADT-EX004S 110/220V AC Power Adapter
PTFE tubing Cole Parmer 06417-21 #24 AWG Thin Wall PTFE
Punching pin SYNEO CR0320245N21R4 OD: 0.032" (0.8128 mm), ID: 0.024" (0.6090 mm)
PVC Tubing Koolance, Inc. HOS-06CL 6 mm ID, 10 mm OD
Single edge blades GEM Scientific –
Soft tubing Fluigent – Supplied with fluid reservoirs. (1 mm ID, 3mm OD)
Spin coater Laurell Technologies Corporation WS-650MZ-23NPPB
Stereo microscope Olympus Corporation SZ61
Thermistor cable Warner Instruments TA-29 Cable with bead thermistor
UV exposure system ABM, USA – Near UV Exposure System, 350W
Vacuum pump Vacuumbrand GmbH MD1C
Water cooled cold plate block Koolance, Inc. PLT-UN40F
Water cooler Koolance, Inc. EX2-755
Weighing scales Sartorius M-prove
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. van Roekel, H. W. H., et al. Programmable chemical reaction networks: emulating regulatory functions in living cells using a bottom-up approach. Chemical Society Reviews. 44, 7465-7483 (2015).
  2. Hori, Y., Kantak, C., Murray, R. M., Abate, A. R. Cell-free extract based optimization of biomolecular circuits with droplet microfluidics. Lab on a Chip. , (2017).
  3. Del Vecchio, D., Sontag, E. D. Dynamics and control of synthetic bio-molecular networks. Proceedings of the American Control Conference. , 1577-1588 (2007).
  4. Purnick, P. E. M., Weiss, R. The second wave of synthetic biology: from modules to systems. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 410-422 (2009).
  5. Padirac, A., Fujii, T., Rondelez, Y. Bottom-up construction of in vitro switchable memories. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, E3212-E3220 (2012).
  6. Guido, N. J., et al. A bottom-up approach to gene regulation. Nature. 439, 856-860 (2006).
  7. Genot, A. J., Fujii, T., Rondelez, Y. In vitro regulatory models for systems biology. Biotechnology Advances. 31, 789-796 (2013).
  8. Elowitz, M. B., Leibler, S. A synthetic oscillatory network of transcriptional regulators. Nature. 403, 335-338 (2000).
  9. Gardner, T. S., Cantor, C. R., Collins, J. J. Construction of a genetic toggle switch in Escherichia coli. Nature. 403, 339-342 (2000).
  10. Montagne, K., Plasson, R., Sakai, Y., Fujii, T., Rondelez, Y. Programming an in vitro DNA oscillator using a molecular networking strategy. Molecular Systems Biology. 7, 466-466 (2014).
  11. Khalil, A. S., Collins, J. J. Synthetic biology: applications come of age. Nature Reviews Genetics. 11, 367-379 (2010).
  12. Hockenberry, A. J., Jewett, M. C. Synthetic in vitro circuits. Current Opinion in Chemical Biology. 16, 253-259 (2012).
  13. Del Vecchio, D. Modularity, context-dependence, and insulation in engineered biological circuits. Trends in Biotechnology. 33, 111-119 (2015).
  14. Cardinale, S., Arkin, A. P. Contextualizing context for synthetic biology – identifying causes of failure of synthetic biological systems. Biotechnology Journal. 7, 856-866 (2012).
  15. Venturelli, O. S., et al. Programming mRNA decay to modulate synthetic circuit resource allocation. Nature Communications. 8, 1-11 (2017).
  16. Scott, M., Mateescu, E. M., Zhang, Z., Hwa, T. Interdependence of cell growth and gene expression: origins and consequences. Science. 330, 1099-1103 (2010).
  17. Borkowski, O., Ceroni, F., Stan, G. B., Ellis, T. Overloaded and stressed: whole-cell considerations for bacterial synthetic biology. Current Opinion in Microbiology. 33, 123-130 (2016).
  18. Liao, C., Blanchard, A. E., Lu, T. An integrative circuit-host modelling framework for predicting synthetic gene network behaviours. Nature Microbiology. , (2017).
  19. Noireaux, V., Bar-Ziv, R., Libchaber, A. Principles of cell-free genetic circuit assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 12672-12677 (2003).
  20. Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nature Biotechnology. 19, 751-755 (2001).
  21. Oberholzer, T., Nierhaus, K. H., Luisi, P. L. Protein expression in liposomes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 261, 238-241 (1999).
  22. Yelleswarapu, M., et al. Sigma factor-mediated tuning of bacterial cell-free synthetic genetic oscillators. ACS Synthetic Biology. 7, (2018).
  23. Karig, D. K., Iyer, S., Simpson, M. L., Doktycz, M. J. Expression optimization and synthetic gene networks in cell-free systems. Nucleic Acids Research. 40, 3763-3774 (2012).
  24. Dunlop, M. J., et al. Distinct timescales of RNA regulators enable the construction of a genetic pulse generator. Biotechnology and Bioengineering. , (2019).
  25. Yoshiyama, T., Ichii, T., Yomo, T., Ichihashi, N. Automated in vitro evolution of a translation-coupled RNA replication system in a droplet flow reactor. Scientific Reports. 8, 1-8 (2018).
  26. Iyer, S., Karig, D. K., Norred, S. E., Simpson, M. L., Doktycz, M. J. Multi-input regulation and logic with T7 promoters in cells and cell-free systems. PLoS ONE. 8, 1-12 (2013).
  27. de los Santos, E. L. C., Meyerowitz, J. T., Mayo, S. L., Murray, R. M. Engineering Transcriptional Regulator Effector Specificity Using Computational Design and In vitro Rapid Prototyping: Developing a Vanillin Sensor. ACS Synthetic Biology. 5, 287-295 (2016).
  28. Guo, S., Murray, R. M. Construct functional feedforward loop biological circuits in a cell-free system and in cells. ACS Synthetic Biology. , (2019).
  29. Hughes, R. A., Ellington, A. D. Synthetic DNA synthesis and assembly: putting the synthetic in synthetic biology. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9, (2017).
  30. Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. The all E. coli TX-TL toolbox 2.0: A platform for cell-free synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5, 344-355 (2016).
  31. Takahashi, M. K., et al. Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions. Methods. 86, 60-72 (2015).
  32. Lee, J. W., et al. Creating single-copy genetic circuits. Molecular Cell. 63, 329-336 (2016).
  33. Gibson, D. G., et al. Complete chemical synthesis, assembly, and cloning of a mycoplasma genitalium genome. Science. 319, 1215-1220 (2008).
  34. Sun, Z. Z., Yeung, E., Hayes, C. A., Noireaux, V., Murray, R. M. Linear DNA for rapid prototyping of synthetic biological circuits in an Escherichia coli based TX-TL cell-free system. ACS Synthetic Biology. 3, 387-397 (2014).
  35. Georgi, V., et al. On-chip automation of cell-free protein synthesis: new opportunities due to a novel reaction mode. Lab on a Chip. 16, 269-281 (2016).
  36. Niederholtmeyer, H., Stepanova, V., Maerkl, S. J. Implementation of cell-free biological networks at steady state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15985-15990 (2013).
  37. Spirin, A. S., Baranov, V. I., Ryabova, L. A., Ovodov, S. Y., Alakhov, Y. B. A continuous cell-free translation system capable of producing polypeptides in high yield. Science. 242, 1162-1164 (1988).
  38. Karzbrun, E., Tayar, A. M., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. Programmable on-chip DNA compartments as artificial cells. Science. 345, 829-832 (2014).
  39. Timm, A. C., Shankles, P. G., Foster, C. M., Doktycz, M. J., Retterer, S. T. Toward microfluidic reactors for cell-free protein synthesis at the point-of-care. Small. 12, 810-817 (2016).
  40. Doktycz, M. J., Foster, C. M., Retterer, S. T., Timm, A. C., Shankles, P. G. Characterization of extended channel bioreactors for continuous-flow protein production. Journal of Vacuum Science & Technology B, Nanotechnology and Microelectronics: Materials, Processing, Measurement, and Phenomena. 33, 06FM02 (2015).
  41. Khnouf, R., Beebe, D. J., Fan, Z. H. Cell-free protein expression in a microchannel array with passive pumping. Lab on a chip. 9, 56-61 (2009).
  42. Siuti, P., Retterer, S. T., Doktycz, M. J. Continuous protein production in nanoporous, picolitre volume containers. Lab on a Chip. 11, 3523-3529 (2011).
  43. Kaminski, T. S., Scheler, O., Garstecki, P. Droplet microfluidics for microbiology: techniques, applications and challenges. Lab on a Chip. 16, 2168-2187 (2016).
  44. Shin, J., Noireaux, V. An E. coli cell-free expression toolbox: Application to synthetic gene circuits and artificial cells. ACS Synthetic Biology. 1, 29-41 (2012).
  45. Niederholtmeyer, H., et al. Rapid cell-free forward engineering of novel genetic ring oscillators. eLife. 4, 1-18 (2015).
  46. Galas, J., Haghiri-Gosnet, A. -. M., Estévez-Torres, A. A nanoliter-scale open chemical reactor. Lab on a Chip. 13, 415-423 (2013).
  47. Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. Monolithic Microfabricated Valves and Pumps by Multilayer Soft Lithography. Science. 288, 113-116 (2004).
  48. Brower, K., et al. An open-source, programmable pneumatic setup for operation and automated control of single- and multi-layer microfluidic devices. HardwareX. 3, 117-134 (2018).
  49. White, J. A., Streets, A. M. Controller for microfluidic large-scale integration. HardwareX. 3, 135-145 (2018).

Tags

Microfluidic PlatformCell-free Gene ExpressionSynthetic Gene NetworksPrototypingGFPBiochemical ReactionsFlow ReactorPneumatic ControlPeltier CoolingPTFE TubingPEEK TubingTemperature Control

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
van der Linden, A. J., Yelleswarapu, M., Pieters, P. A., Swank, Z., Huck, W. T. S., Maerkl, S. J., de Greef, T. F. A. A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression. J. Vis. Exp. (152), e59655, doi:10.3791/59655 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image