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Bioengineering

Eine multilayer mikrofluidische Plattform für die Leitung einer längeren zellfreien Genexpression

Published: October 06, 2019
doi:
10.3791/59655
, , , , , ,
1Institute for Complex Molecular Systems, Department of Biomedical Engineering, Computational Biology Group,Eindhoven University of Technology, 2Institute for Molecules and Materials,Radboud University, 3Institute of Bioengineering,School of Engineering École Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL)

Summary

Der Herstellungsprozess eines PDMS-basierten, mehrschichtigen, mikrofluidischen Geräts, das in vitro Transkription und Translation (IVTT) Reaktionen über längere Zeiträume durchführen kann, wird beschrieben. Darüber hinaus erhalten Sie einen umfassenden Überblick über die Hard- und Software, die zur Automatisierung und Aufrechterhaltung dieser Reaktionen über einen längeren Zeitraum erforderlich ist.

Abstract

Die Grenzen der zellbasierten synthetischen Biologie werden immer offensichtlicher, da Forscher größere und komplexere synthetische genetische Regulierungskreise entwickeln wollen. Die Analyse synthetischer genetischer Regulierungsnetzwerke in vivo ist zeitaufwändig und leidet unter einem Mangel an Umweltkontrolle, wobei exogene synthetische Komponenten mit Wirtsprozessen interagieren, was zu unerwünschtem Verhalten führt. Um diese Probleme zu überwinden, wird die zellfreie Charakterisierung neuartiger Schaltkreise immer häufiger. In-vitro-Transkriptions- und -translationsgemische (IVTT)-Mischungen ermöglichen die Regulierung der experimentellen Umgebung und können für jedes einzelne System optimiert werden. Die hier vorgestellten Protokolle beschreiben die Herstellung eines mehrschichtigen mikrofluidischen Geräts, das verwendet werden kann, um IVTT-Reaktionen über längere Dauer aufrecht zu erhalten. Im Gegensatz zu Chargenreaktionen, bei denen Ressourcen im Laufe der Zeit erschöpft sind und sich (by-) Produkte ansammeln, ermöglicht der Einsatz mikrofluidischer Geräte die Auffüllung von Ressourcen sowie die Entfernung von Reaktionsprodukten. Auf diese Weise wird die zelluläre Umgebung emuliert, indem eine a-out-of-Balance-Umgebung beibehalten wird, in der das dynamische Verhalten von Genkreisen über einen längeren Zeitraum untersucht werden kann. Um das mehrschichtige mikrofluidische Gerät voll auszuschöpfen, wurden Hard- und Software integriert, um die IVTT-Reaktionen zu automatisieren. Durch die Kombination von IVTT-Reaktionen mit der hier vorgestellten mikrofluidischen Plattform wird es möglich, komplexe Netzwerkverhalten umfassend zu analysieren und so unser Verständnis der Mechanismen zu fördern, die zelluläre Prozesse regulieren.

Introduction

Zellen sind in der Lage, ihre Umgebung mithilfe komplexer dynamischer Regulierungsnetzwerke zu erkennen und darauf zu reagieren1,2. Der Bereich der Synthetischen Biologie nutzt unser Wissen über die natürlich vorkommenden Komponenten, die diese Netzwerke umfassen, um biologische Systeme zu entwickeln, die die Funktionalität von Zellen erweitern können3,4. Umgekehrt ist es auch möglich, unser Verständnis der natürlichen Netzwerke, die das Leben bestimmen, durch die Entwicklung vereinfachter, synthetischer Analoga bestehender Schaltkreise oder durch vorwärtsgerichtete biologische Systeme, die natürlich vorkommende Verhaltensweisen aufweisen, zu fördern. Die De-novo-Engineering solcher biologischen Systeme wird in einer Bottom-up-Manier durchgeführt, wo neuartige genetische Schaltkreise oder Signalwege auf rationale Weise mit den genau definierten Teilen5,6entwickelt werden. Die Kombination der rationellen Gestaltung von Netzwerken mit der Entwicklung biologisch relevanter Systeme ermöglicht die tiefgehende Charakterisierung und Untersuchung biologischer Regulierungssysteme mit verschiedenen Abstraktionsebenen7.

Die Pionierarbeiten von Elowitz und Leibler8 und Gardner et al.9 waren die ersten, die die erfolgreiche Einführung synthetischer genetischer Netzwerke in zelluläre Wirte demonstrierten. In den folgenden zehn Jahren haben zahlreiche Forscher weiter auf diesen anfänglichen Erfolgen aufgebaut, trotz der Entstehung mehrerer Einschränkungen in Bezug auf die Einführung synthetischer Schaltkreise in Die Zellen7,10,11 ,12. Idealerweise sollte die Einführung synthetischer Schaltungen in zelluläre Wirte modular erfolgen. Leider macht die Komplexität der zellulären Umgebung dies besonders schwierig, wobei die Funktion vieler Teile und Netzwerke stark kontextabhängig ist12,13,14. Infolgedessen treten in Netzwerken häufig unerwünschte Interaktionen mit nativen Hostkomponenten auf, die die Funktion der synthetischen Schaltung beeinträchtigen können. Ebenso können Komponenten des exogenen Netzwerks Hostprozesse hemmen, um gemeinsam genutzte Ressourcen innerhalb des Hosts konkurrieren und die Wachstumskinetik15,16,17beeinflussen. Um das Verhalten synthetischer Netzwerke in einer In-vivo-Umgebung rational zu gestalten und vorherzusagen, ist daher ein umfassendes Modell aller host- und schaltungsspezifischen Dynamiken erforderlich18.

Eine praktikable Alternative zur Verwendung von Zellhosts zur Charakterisierung synthetischer Netzwerke ist die Anwendung von In-vitro-Transkriptions- und -übersetzungstechnologien (IVTT). Als Teststand für synthetische Netzwerke werden Reaktionen in Lösungen durchgeführt, die alle Komponenten umfassen, die erforderlich sind, um die Genexpression19,20,21zu ermöglichen. Auf diese Weise entsteht eine biologisch relevante, wenn auch künstliche Umgebung, in der synthetische Netzwerke getestet werden können22,23,24,25,26, 27,28. Ein großer Vorteil der Verwendung von IVTT-Lösungen ist die Fähigkeit, Reaktionen unter benutzerdefinierten Bedingungen durchzuführen, wobei Forscher in der Lage sind, die genaue Zusammensetzung jederReaktion2 zu optimieren. Darüber hinaus ermöglicht der zellfreie Ansatz Tests synthetischer Netzwerke mit hohem Durchsatz, da zeitaufwändige Zellklonschritte überflüssig werden. Als Ergebnis wird die Dauer der aufeinanderfolgenden Konstruktion – Build – Testzyklen deutlich reduziert29,30,31,32. Der Entwurfszyklus kann weiter beschleunigt werden, indem zellfreie Klontechniken wie die Gibson-Baugruppe verwendet werden, um schnell neuartige Netzwerke zu entwickeln, und indem Netzwerke aus linearen DNA-Vorlagen aufgebaut werden, die – im Gegensatz zu den Plasmiden, die für In-vivo-Tests erforderlich sind – kann über Polymerase-Kettenreaktionen (PCR)33,34verstärkt werden.

Batch-Reaktionen sind die einfachste Methode, mit der IVTT-Reaktionen durchgeführt werden können, wobei ein einziges Reaktionsgefäß erforderlich ist, wobei alle Reaktionskomponenten35kombiniert werden. Solche Reaktionen reichen für die Proteinexpression und grundlegende Schaltungstests aus, erweisen sich jedoch als unzureichend, wenn man versucht, das langfristige dynamische Verhalten eines Netzwerks zu untersuchen. Im Laufe einer Chargenreaktion werden Reagenzien entweder erschöpft oder werden abgebaut, was zu einer kontinuierlichen Abnahme der Transkriptions- und Übersetzungsraten führt. Darüber hinaus akkumulieren sich mit fortschreitenden Reaktionen Nebenprodukte, die das korrekte Funktionieren des Netzes stören oder ganz hemmen können. Letztlich begrenzt der Einsatz von Batchreaktoren das beobachtete dynamische Verhalten, wobei die Durchführung von Negativregulierungen besonders schwierig ist,5,36zu implementieren.

Die Vielseitigkeit von IVTT-Systemen ermöglicht mehrere alternative Methoden, mit denen längere IVTT-Reaktionen durchgeführt werden können, von kontinuierlichen Strömungs- bis hin zu Tröpfchen-basierten Methoden sowie einfacheren Dialyseansätzen2,30, 37,38,39,40. Die Anwendung von mikrofluidischen Geräten bietet Benutzern eine erhöhte Kontrolle über ihre Reaktionen bei gleichzeitiger Erhöhung des Durchsatzes und der Minimierung der Kosten35,41,42, wobei jeder spezifische Ansatz seine eigene Vorteile. Die Verwendung von kontinuierlichen Durchfluss kann leicht für die Erhöhung der Expressionsausbeute optimiert werden, jedoch macht die Unfähigkeit, bestimmte Reaktionsprodukte effektiv zu entfernen, die Untersuchung des dynamischen Verhaltens nicht trivial39. Während der Einsatz von mikrofluidischen Tröpfchensystemen ein Hochdurchsatz-Screening neuartiger Netzwerke ermöglicht, führt die Schwierigkeit, der Reaktion frische Reagenzien zu liefern, dazu, dass die Tröpfchen kleinen Volumenbatchreaktionen ähneln43. Dialyse-basierte Reaktoren ermöglichen die Einführung von frischen Reagenzien sowie die Entfernung einiger Reaktionsprodukte, jedoch sammeln sich RNA-Moleküle und größere Proteine im Reaktor an, da sie zu groß sind, um sie durch die Membranporen zu diffundieren. Darüber hinaus sind große Mengen von Reagenzien erforderlich, um diese Reaktionen über einen längeren Zeitraum30,44aufrecht zu erhalten. Im Jahr 2013 präsentierten Maerkl et al. ein mehrschichtiges mikrofluidisches Gerät, das speziell für die Durchführung längerer IVTT-Reaktionen36,45entwickelt wurde. Der Einsatz von mehrschichtigen mikrofluidischen Geräten ermöglicht eine direkte Kontrolle des Flüssigkeitsflusses, was die Umleitung des Durchflusses sowie die Isolierung von Flüssigkeit in bestimmten Bereichen des Geräts46,47ermöglicht. Diese isolierten Regionen können als unabhängige Nanoliter-Skala-Reaktionskammern fungieren, in denen IVTT-Reaktionen durchgeführt werden können. Im Laufe einer einzigen IVTT-Reaktion werden periodische Injektionen frischer Reagenzien in den Reaktor verwendet, um IVTT-Komponenten und DNA-Vorlagen aufzufüllen. Gleichzeitig wird ein gleiches Volumen der alten Reaktionslösung verdrängt, wodurch Reaktionsprodukte entfernt werden. Auf diese Weise wird eine a-out-of-balance Umgebung beibehalten, in der die Basaltranskriptions- und Übersetzungsraten im stationären Zustand bleiben, was die Lebensdauer von IVTT-Reaktionen verlängert und ein reiches dynamisches Verhalten ermöglicht. Durch die Anwendung dieses Ansatzes sind die Forscher in der Lage, die kinetischen Raten der einzelnen Prozesse zu untersuchen, die innerhalb eines bestimmten Kreislaufs auftreten, und dabei die Weiterentwicklung neuartiger genetischer Netzwerke zu unterstützen. So implementierten Niederholtmeyer et al. diesen Ansatz, um verschiedene Elemente eines genetischen Ringoszillators zu charakterisieren und die kinetischen Raten davon zu bestimmen36. In weiteren Studien zeigten Yelleswarapu et al., dass die kinetischen Raten des Sigma-Faktors 28(28), die unter Chargenbedingungen bestimmt wurden, nicht ausreichten, um das Verhalten eines28-basiertenOszillators zu beschreiben, und dass die Zugabe von strömungsbasierten verbesserte Modellvorhersagen des Netzwerkverhaltens22.

Ziel dieses Manuskripts ist es, ein vollständiges Protokoll für die Herstellung von mehrschichtigen mikrofluidischen Geräten zu präsentieren, die in der Lage sind, langfristige IVTT-Reaktionen durchzuführen. Darüber hinaus wird dieses Manuskript die gesamte Hardware und Software beschreiben, die erforderlich ist, um längere IVTT-Reaktionen durchzuführen. Die Betätigung der mikrofluidischen Vorrichtung – notwendig, um den Flüssigkeitsfluss darin zu steuern – wird durch eine Reihe von pneumatischen Ventilen erreicht, die sich über Rohrlängen direkt mit den mikrofluidischen Geräten verbinden. Die Steuerung der pneumatischen Ventile erfolgt wiederum über eine kundenspezifische virtuelle Steuerschnittstelle. Der Flüssigkeitsfluss innerhalb der mikrofluidischen Geräte wird durch kontinuierlichen Druck erreicht, der durch ein handelsübliches Druckregelungssystem gewährleistet wird. IVTT-Reaktionen werden in der Regel zwischen 29 °C und 37 °C durchgeführt und ein Mikroskop-Inkubator wird verwendet, um die Temperatur während der Reaktionen zu regulieren. Die Funktionalität des IVTT-Gemischs nimmt jedoch allmählich ab, wenn es über 4 °C gelagert wird. Daher wird dieses Manuskript das Off-Chip-Kühlsystem erweitern, mit dem das IVTT-Gemisch vor der Injektion in das mikrofluidische Gerät gekühlt wird. Zusammenfassend bietet dieses Manuskript einen umfassenden Überblick über die Verfahren, die erforderlich sind, um längere IVTT-Reaktionen mit einem mikrofluidischen Durchflussreaktor erfolgreich durchzuführen, so dass andere Forscher in der Lage sein werden, diese Technologie mit relativen bequemlichkeit.

Protocol

1. Wafer-Vorbereitung HINWEIS: Unsere Protokolle sind spezifisch für den 40 XT positiven Photoresist und SU8 3050 negativen Photoresist, der während dieser Forschung verwendet wird. Alternative Photoresists können verwendet werden, jedoch variieren die spezifischen Spingeschwindigkeiten, Backtemperaturen und Backzeiten. Das mikrofluidische Gerätedesign von Niederholtmeyer et al.36 ist im Materialtischverknüpft. Legen Sie zwei saubere Siliziumwafer (100 mm Durchmesser, orientiert, 525 m Dicke) in einen auf 250 °C eingestellten vorgeheizten Ofen und lassen Sie die Wafer über Nacht dehydrieren (ca. 16 h).HINWEIS: Es ist auch möglich, die Wafer mit HMDS-Dampfabscheidung zu grundieren; Dies ist jedoch nicht erforderlich, wenn die Wafer ausreichend dehydriert sind. Entfernen Sie einen Siliziumwafer aus dem Ofen und lassen Sie ihn auf Raumtemperatur abkühlen, bevor Sie mit der Spin-Beschichtung fortfahren. Tragen Sie 3-4 ml des 40 XT Photoresist auf die Mitte des Wafers auf. Um eine Feature-Höhe von 25 m zu erhalten, wenden Sie das folgende Spin-Protokoll an: Drehen Sie 20 s bei 500 U/min (110 U/min/s), erhöhen Sie die Drehgeschwindigkeit auf 3100 U/min (300 U/min) und halten Sie hier 30 s, und verlangsamen Sie den Wafer auf 0 U/min mit einer Verzögerung von 200 U/min/s. Mikrofasergewebe entfernt sorgfältig alle Kantenperlen, die während der Spin-Beschichtung aufgetreten sein können. Weich backen mit zwei separaten Kochplatten, die auf 70 °C und 120 °C eingestellt sind, auf folgende Weise: Lassen Sie den Wafer 30 s bei 70 °C sitzen. Dann den Wafer auf die 120 °C-Kochplatte geben und hier 3,5 min ruhen lassen, bevor er den Wafer für weitere 30 s auf die 70 °C-Kochplatte zurückgibt. Entfernen Sie den Wafer aus der Kochplatte und lassen Sie ihn – um plötzliche Temperaturschocks zu vermeiden – auf Raumtemperatur abkühlen. Legen Sie die Fließschicht-Photomaske (Emulsionsseite nach unten) auf den Photoresist-Film und setzen Sie den Wafer mit einer UV-Lampe aus, bis eine Gesamtbelichtung von 200 mJ/cm2 erreicht ist. Nach der Belichtung mit zwei Kochplatten (70 °C und 105 °C) auf folgende Weise backen: Lassen Sie den Wafer bei 70 °C für 20 s sitzen, bevor er den Wafer auf die 105 °C-Kochplatte überträgt und ihn hier für 40 s belassen. Geben Sie den Wafer schließlich für weitere 20 s auf die 70 °C-Kochplatte zurück, um den Nachbelichtungsbacken abzuschließen. Lassen Sie den Wafer auf raumtemperatur auf einem Stapel von Mikrofasergewebeabkühlung abkühlen. Entwickeln Sie den Wafer, indem Sie ihn auf eine Petrischale übertragen, die mit 726 MIF Photoresist Entwickler gefüllt ist, um den Entwicklungsprozess zu starten. Die Entwicklung wird beschleunigt, wenn sie auf einem Tischschüttler durchgeführt wird und der gesamte Wafer in den Entwickler eingetaucht ist. Spülen Sie den Wafer mit demineralisiertem Wasser und verwenden Sie ein Stereomikroskop, um die Waferoberfläche auf photoresist-Rückstände zu überprüfen. Wenn Photoresist-Rückstände zu sehen sind, dann geben Sie den Wafer an den Entwickler zurück. Reflow der positiven Photoresist durch Stellen sie den Wafer auf einer heißen Platte auf 110 °C für 25 min. Dieser Prozess führt zu abgerundeten Features sowie zum Glühen von Rissen, die während des Herstellungsprozesses aufgetreten sein könnten. Fahren Sie fort, den Wafer wie in Schritt 1.17 beschrieben zu silanisieren. Entfernen Sie den zweiten Siliziumwafer aus dem Ofen, so dass er auf Raumtemperatur abkühlen kann, bevor Sie mit der Spin-Beschichtung fortfahren. Tragen Sie 5 ml SU8 3050 photoresist auf die Mitte des Wafers auf. Um eine Feature-Höhe von 30 m zu erhalten, wenden Sie das folgende Spin-Protokoll an: Drehen Sie 20 s bei 500 U/min (110 U/min/s), erhöhen Sie die Drehgeschwindigkeit auf 4.000 U/min (330 U/min) und halten Sie hier 42 s und verlangsamen Sie den Wafer auf 0 U/min mit einer Verzögerung von 200 U/min/s. Mikrofasergewebe entfernt sorgfältig alle Kantenperlen, die während der Spin-Beschichtung aufgetreten sein können. Weich backen mit zwei separaten Kochplatten (65 °C und 95 °C) auf folgende Weise: Lassen Sie den Wafer bei 65 °C für 30 s sitzen. Dann den Wafer auf die 95 °C-Kochplatte übertragen und hier 14 min ruhen lassen, bevor er den Wafer für weitere 30 s auf die 65 °C-Kochplatte zurückgibt. Entfernen Sie den Wafer von der Kochplatte und lassen Sie ihn auf Raumtemperatur abkühlen. Messen Sie die Intensität der UV-Lampe vor der Exposition und verwenden Sie diese, um die Expositionsdauer zu bestimmen, die erforderlich ist, um eine Gesamtexpositionsdosis von 260 mJ/cm2zu erreichen. Legen Sie die Fotomaske (Emulsionsseite nach unten) auf den Photoresist-Film und legen Sie den Wafer unter die UV-Lichtquelle. Setzen Sie den Wafer mit einer UV-Lampe aus, bis eine Gesamtbelichtung von 260 mJ/cm2 erreicht ist. Nach der Belichtung mit zwei Kochplatten (65 °C und 95 °C) auf folgende Weise backen: Lassen Sie den Wafer bei 65 °C für 60 s sitzen, bevor Er den Wafer auf die 95 °C-Kochplatte übertragen und hier für 4,5 min gelassen wird. Geben Sie den Wafer für weitere 30 s auf die 65 °C-Kochplatte zurück. , um den Nachbelichtungsbacken abzuschließen. Lassen Sie den Wafer auf raumtemperatur auf einem Stapel von Mikrofasergewebeabkühlung abkühlen. Entwickeln Sie den Wafer, indem Sie ihn auf eine Petrischale übertragen, die mit mrDev-600 Photodeveloper gefüllt ist, um den Entwicklungsprozess zu starten. Die Entwicklung wird beschleunigt, wenn sie auf einem Tischschüttler durchgeführt wird und der gesamte Wafer in den Entwickler eingetaucht ist. Spülen Sie den Wafer mit Isopropanol und verwenden Sie ein Stereomikroskop, um die Waferoberfläche auf photoresist-Rückstände zu überprüfen. Wenn Photoresist-Rückstände zu sehen sind, dann geben Sie den Wafer an den Entwickler zurück. Nach der Ausgereiften backen Sie den Photoresist hart, indem Sie den Wafer auf eine Heiße Platte legen, die bei 150 °C für 1 h eingestellt ist. Silanisieren Sie beide Wafer, um die Haftung von PDMS während der Soft-Lithographie-Prozesse zu verhindern. Um die Silanisierung durchzuführen, Pipetten 2-3 Tröpfchen (pro Wafer) des Silans in eine kleine Glasdurchstechflasche. Legen Sie diese Durchstechflasche zusammen mit den Wafern in einen Trockentrockner und ziehen Sie Vakuum für 5-10 min. Versiegeln Sie den Austrocknungspunkt und lassen Sie die Wafer für einen Zeitraum von 12 – 16 h unter Vakuum.VORSICHT: Das Silan ist giftig und sollte nicht eingeatmet werden. Achten Sie darauf, in einer Dunstabzugshaube zu arbeiten und Nitrilhandschuhe zu tragen, wenn Sie mit dem Silan umgehen. Dazu gehört auch, die Vakuumpumpe beim Ziehen von Vakuum am Trockenkörper in die Dunstabzugshaube zu legen. Lassen Sie das Vakuum aus dem Trockenheitor und entfernen Sie die silanisierten Wafer. Mit Wasser abspülen und mit einem Dampf von N2 die Wafer trocknen. An dieser Stelle können die Wafer bis zum Bedarf eingelagert werden. 2. Mikrofluidische Gerätefertigung ANMERKUNG: Das Soft-Lithographie-Verfahren zur Herstellung von MEHRschicht-Mikrofluidgeräten auf PDMS-Basis kann in drei verschiedene Schritte unterteilt werden: 1) Die PDMS-Vorbereitung sowohl der Strömungs- als auch der Steuerungsschichten, 2) Die Ausrichtung und Bindung der beiden PDMS-Schichten, 3) Fertigstellung des Geräts. PDMS-Vorbereitung Bereiten Sie zwei PDMS-Vorläuferlösungen vor, indem Sie die Basis- und Härtungsmittel in einem Kunststoffbecher kombinieren und die beiden Komponenten bis zum vollständigen Mischen mit einem Mischstab rühren. Die Kontrollschicht benötigt 20 g Basismittel und 1 g Aushärtungsmittel (20:1-Verhältnis). Die Strömungsschicht benötigt 40 g des Basismittels und 8 g des Härtungsmittels (Verhältnis 5:1). Entgasen Sie die Lösungen in einem Trockenmittel. Legen Sie den Fließschichtwafer in eine Petrischale und gießen Sie das 5:1-Verhältnis PDMS-Mischung über den Wafer. Entgasen Sie das PDMS für 30 min, um Luftblasen zu entfernen. Spin beschichten Sie den Kontrollschichtwafer (vorbereitet mit dem negativen SU8 3050photoresist) mit 20:1 Verhältnis PDMS. 5-10 ml des PDMS auf die Mitte des Wafers gießen und das folgende Spin-Protokoll ausführen (die übrig gebliebene PDMS für die spätere Verwendung behalten): Drehen Sie bei 500 U/min für 15 s (100 U/min/s), erhöhen Sie die Spin-Geschwindigkeit auf 1450 U/min (300 U/min/s) für 45 s und dann den Wafer auf 0 Rpm (200 Rpm/s) abbremsen. Um eine homogene PDMS-Foliendicke zu gewährleisten, legen Sie den PDMS-beschichteten Wafer auf einer ebenen Oberfläche in eine geschlossene Petrischale (um Staubkontaminationen zu vermeiden). Lassen Sie den Wafer 30 min sitzen. Entfernen Sie die Strömungsschicht aus dem Trockenschrank und legen Sie sowohl die Strömungs- als auch die Steuerungsschichten in einen Ofen (80 °C). Härten Sie beide Schichten für 28-30 min und entfernen Sie, wenn das PDMS formbar genug ist, um zu manipulieren, während sie leicht klebrig bleiben. Fahren Sie sofort mit dem Ausrichtungsprozess fort. Ausrichtung und Verklebung Entfernen Sie mit einem Skalpell jedes der vier Geräte aus dem PDMS auf dem Flow Layer-Wafer. Nach dem Entfernen der PDMS-Schicht aus dem Siliziumwafer sollten Sie die Funktionsseite sofort mit Scotch Tape bedecken, um Staubpartikelkontaminationen zu vermeiden. Richten Sie die Flussschichtblöcke auf der Steuerschicht grob per Auge aus, indem Sie die Feature-Seite des Geräts mit der Steuerungsschicht PDMS in Kontakt bringen. Nehmen Sie anschließend fein an der Position der einzelnen Strömungsschichtblöcke fest, um die Kanäle der Strömungsschicht mit den Steuerschichtkanälen auszurichten, indem Sie ein Stereomikroskop verwenden, um die Visualisierung der Anpassungen zu unterstützen. Tragen Sie Druck auf, um Lufttaschen zwischen den beiden PDMS-Schichten zu entfernen. Gießen Sie das verbleibende 20:1-Verhältnis PDMS, das zuvor um die ausgerichteten Flussschichtblöcke gespeichert wurde. Legen Sie 100 g Gewichte auf jedes der Geräte, um ausreichend Kontakt während des Klebevorgangs zu gewährleisten. Geben Sie die ausgerichteten Geräte (einschließlich der Gewichte) in den 80 °C-Ofen zurück und lassen Sie sie für mindestens 1,5 h und nicht länger als 6 h kleben. Beenden des Geräts Entfernen Sie den Wafer aus dem Ofen und extrahieren Sie jedes der einzelnen Geräte aus dem Steuerschichtwafer, wobei die Funktionsseite jedes Geräts mit Scotch Tape abgedeckt wird. Es wird ein einzelnes Loch für jeden der 9 Durchflussschichteinlässe, 24 Steuerschichtkanaleinlässen und der einzelne Durchflussschichtauslass jedes Geräts ausstanzen. Stanzen Sie das Gerät mit der Feature-Seite nach oben, indem Sie eine Kamera verwenden, um sicherzustellen, dass Löcher innerhalb der Feature-Grenzen gestanzt werden. Reinigen Sie für jedes Gerät ein einzelnes Mikroskopschlitten mit Isopropanol und Aceton und trocknen Sie die Dias unter einem Strom von N2. Anschließend die Mikroskop-Dias auf eine Auf150 °C-Platte für 15 min setzen. Verwenden Sie Sauerstoffplasma-Asche, um die PDMS-Geräte an die Glasgleiter zu binden, indem Sie eine Ascheleistung von 50 W für 45 s anwenden. Stellen Sie sicher, dass die Funktionsseite des Geräts beim Ashing nach oben zeigt. Legen Sie das Gerät nach dem Abschluss seitlich auf den Glasschlitten und setzen Sie Druck, um eingeschlossenes Gas zwischen den Oberflächen zu entfernen. Legen Sie die verklebenden Geräte auf eine Aufschlagplatte von 110 °C für 1 h. Gewichte können auf die Geräte gelegt werden, um die Haftung des Geräts zu verbessern. 3. Hardware-Setup HINWEIS: Um die Kontrolle über die mikrofluidischen Chips zu erreichen, müssen zahlreiche Hardwareteile installiert und miteinander verbunden werden. Es werden drei verschiedene Hardwaregruppen benötigt: 1) Pneumatische Steuerung für die Steuerkanäle, 2) Ein pneumatischer Druckregler zur Steuerung des Durchflusses der Reaktionsreagenzien innerhalb des Gerätes und 3) Ein Kühlsystem zur Kühlung der IVTT-Reaktionslösung vor Injektion in das mikrofluidische Gerät. Eine Übersicht über die Hardware-Einrichtung finden Sie in Abbildung 1. Es sei darauf hingewiesen, dass die hier vorgelegten Protokolle versuchen, so allgemein wie möglich zu sein, aber bestimmte spezifische Geräte, die während unserer Forschung verwendet werden, werden referenziert. Alle Hardware kann durch Alternativen ersetzt werden, die die gleiche Funktion ausführen können. In solchen Fällen können die Protokolle hier verwendet werden, um die allgemeinen Schritte zu skizzieren, die zum Einrichten des Systems erforderlich sind, sowie die Anforderungen der einzelnen Komponenten. Alternative Hardware-Setups werden von Brower et al.48 und White and Streets49vorgestellt. Pneumatische Steuerung (siehe Abbildung 2) Stellen Sie mithilfe des Herstellerprotokolls eine TCP-Verbindung zwischen dem Feldbuscontroller und der Benutzerarbeitsstation her. Verwenden Sie Steuerungssoftware (als Zusatzdateien zur Verfügung gestellt), um MODBUS-Befehle zu verfassen, die über die TCP-Verbindung an den Controller gesendet werden, und die Magnetventile zu betätigen. Erweitern Sie die Feldbussteuerung um acht 4-Kanal-Digitalausgangsmodule, eines für jedes verwendete Magnetventil. Jedes Magnetventil präsidiert über einem Anschlussstift. Schließen Sie den positiven Draht an einen der vier positiven Ausgänge eines der digitalen Ausgangsmodule an, während Sie den negativen Draht an einen der Masseanschlüsse der digitalen Ausgangsmodule anschließen.ANMERKUNG: Damit das System richtig funktioniert, sollten die Magnete systematisch angeschlossen werden, wobei der erste Magnet mit dem ersten Ausgangsanschluss, dem zweiten Magneten mit dem zweiten Ausgangsanschluss und so weiter verbunden ist. In unserem System werden zwei Ventilanordnungen mit 8 bzw. 22 Magnetventilen eingesetzt. Die Ausgangsanschlüsse 1-8 verbinden sich mit dem 8-Ventil-Array und die Ausgangsanschlüsse 9-30 mit dem 22-Ventil-Array. Verbinden Sie beide Ventilarrays mit 1/4″-Schläuchen an eine Druckluftquelle. Verwenden Sie Druckregler, um den Druck des 22-Ventil-Arrays auf 3 bar und das 8-Ventil-Array auf 1 bar einzustellen. Durchflussdruckregelung (siehe Abbildung 3)HINWEIS: Um Flüssigkeiten durch die Durchflussschicht des mikrofluidischen Geräts zu fließen, wird ein handelsüblicher 4-Port-Druckregler verwendet. Der Ausgangsdruck jedes Ports wird über eine softwarerandierte Software geregelt, die mit dem Druckregler geliefert wird. Schließen Sie den Druckregler über den mitgelieferten USB-Anschluss an einen Computer an. Schließen Sie den Druckregler an eine Druckluftquelle an, um sicherzustellen, dass der zugeführte Druck den vom Regler zulässigen Höchstdruck nicht überschreitet. Schließen Sie einen männlichen Luer an einen 3/32″ Widerhakenstecker an jeden der vier weiblichen Luer-Verriegelungsausgänge des Druckreglers an. Verbinden Sie eine Länge von weichen Schläuchen (OD: 3 mm, ID: 1 mm, L: 10 cm) mit dem Widerhaken. Schließen Sie einen zweiten männlichen Luer an einen 3/32″ Barb-Stecker an das offene Ende des weichen Schlauches an und befestigen Sie diesen an den Flüssigkeitsbehälter-Anschlussanschlüssen. Verwenden Sie die mitgelieferte Software, um den gewünschten Druck jedes Auslasses des Durchflussreglers einzustellen und die in den Reservoirs gelagerten Reagenzien unter Druck zu setzen, um den Fluss der Reagenzien in das mikrofluidische Gerät zu erzielen. Der Anschluss der Reservoirs an das mikrofluidische Gerät wird im Abschnitt 4.2 erörtert. Off-Chip-Kühlung (siehe Abbildung 4) Verwenden Sie PVC-Schläuche (OD: 10 mm, ID: 6 mm), um das Wasserkühlsystem mit Kompressionsarmaturen an den Kaltplatten-Wasserblock anzuschließen. Füllen Sie das Flüssigkeitsreservoir des Wasserkühlsystems mit einem Kühlmittel und neigen Sie das Gerät sanft, um die eingeschlossene Luft zu verdrängen, indem Sie dem Reservoir kontinuierlich Kühlmittel hinzufügen, um sicherzustellen, dass es voll bleibt. Wenn das gesamte Gas aus dem System entfernt wird, füllen Sie das Reservoir auf etwa 90-95% seines maximalen Volumens. Coil PTFE Rohre (OD: 0.042, ID: 0.022″) auf die kalte Fläche des Peltier-Elements und sichern Sie diese mit Klebeband. Stellen Sie sicher, dass ein Ende des PTFE-Schlauchs mit den Reservoirs des Durchflussschichtdruckregelsystems verbunden ist (wie in Abschnitt 4.3 beschrieben). Das andere Ende des PTFE-Schlauches sollte nicht mehr als 1 cm von der Peltier-Oberfläche herausragen. Legen Sie einen PEEK-Schlauch (OD: 0,794 mm, ID: 0,127 mm) 5 – 10 cm Länge in das hervorstehende Ende des PTFE-Schlauchs ein. Die Befüllung des Schlauches und der Anschluss an das mikrofluidische Gerät wird in Abschnitt 4.3 näher erläutert. Legen Sie die heiße Fläche des Peltier-Elements auf die Kaltplatte des Wasserblocks und tragen Sie ausreichend thermische Verbindung auf die beiden Flächen auf. Stellen Sie sicher, dass der Schlauch, das Peltier-Element und der Kühlblock jederzeit in direktem Kontakt miteinander stehen. Schließen Sie das Peltier-Element an den Temperaturregler (über einen seriellen Busstecker) an, so dass die dem Peltier zugeführte Spannung reguliert werden kann. Legen Sie einen Thermistor sicher auf die Peltier-Oberfläche und verbinden Sie den Ausgang mit dem Temperaturregler. Passen Sie nach dem Einschalten des Wasserkühlers die an das Peltier zugeführte Spannung an, bis die Temperatur bei 4 °C stabil ist.HINWEIS: Bei diesem Setup wird die Peltier-Temperatur manuell durch Anpassung der zugeführten Spannung gesteuert, während der Thermistor nur zur Überwachung der Temperatur dient. 4. Vorbereitung eines Experiments HINWEIS: Vor Beginn eines Experiments muss das mikrofluidische Gerät vorbereitet und die Reaktionsreagenzien in den richtigen Schlauch für die Injektion in das Gerät eingeführt werden. In diesem Abschnitt wird erläutert: 1) Der Anschluss von Steuerkanalschläuchen an das Gerät, 2) Der Anschluss von ungekühlten Zuflussreagenzien an das Gerät und 3) Der Anschluss von gekühlten Zuflussreagenzien an das Gerät. Anschließen des Steuerkanalschlauchs Schneiden Sie für jeden der Steuerkanäle des mikrofluidischen Geräts eine Schlauchlänge (OD: 0,06″, ID: 0,02″). Legen Sie an einem Ende den Stift eines 23 G, 1/2″ Luer-Stummels und am anderen Ende einen Edelstahl-Anschlussstift (OD: 0,65 mm, ID: 0,35 mm, L: 8 mm) ein. Verbinden Sie den Luer-Stub mit einem männlichen Luer an einem 3/32″ Barb Nylon-Stecker. Legen Sie den Widerhaken des Steckers in eine Länge von Polyurethanschläuchen ein (OD: 4 mm, ID: 2,5 mm). Setzen Sie diese Polyurethanschläuche direkt in eines der Magnetventile ein. Befestigen Sie einen 23 G, 1/2″ Luer-Stummel an einer Spritze und legen Sie ihn in ein kurzes (3-4 cm) Schlauchstück (OD: 0,06″, ID: 0,02″ ein”). Legen Sie das offene Ende dieser Schläuche in ein Reservoir mit Reinstwasser und füllen Sie die Spritze mit Reinstwasser. Nummeren Sie jeden Steuerkanal des mikrofluidischen Geräts, wie in Abbildung 5dargestellt. Für jeden Kanal (ausgenommen Steuerkanäle 1 bis 3, die nicht mit Wasser gefüllt sind) finden Sie die entsprechenden Schläuche (verbunden mit den Magnetventilen) und setzen Sie einen Metallstift in das offene Ende des Rohres, der an der Spritze befestigt ist. Injizieren Sie Wasser in den Steuerkanalschlauch, bis die Hälfte der Länge gefüllt ist. Trennen Sie den Schlauch von der Spritze und setzen Sie den Edelstahl-Steckverbinderstift in das entsprechende Loch des mikrofluidischen Geräts ein. Wiederholen Sie dies für alle Steuerkanäle. Verwenden Sie die Steuerschnittstelle, um alle Magnetventile zu öffnen. Dadurch wird die Flüssigkeit innerhalb des Steuerkanalschlauchs unter Druck gesetzt, sie in das mikrofluidische Gerät gezwungen und alle membranbasierten Ventile innerhalb des Geräts geschlossen. Ein Beispiel für offene und geschlossene Membranen innerhalb des Geräts sind in Abbildung 6angegeben. Anschließen ungekühlter Reagenzien an das Gerät Schneiden Sie für jedes der ungekühlten Reagenzien eine Schlauchlänge (OD: 0,06″, ID: 0,02″) ab, um den Behälterauslass mit den einlässen mikrofluidischen Geräten zu verbinden. Nehmen Sie ein Ende des Schlauches und legen Sie diese in das Reservoir ein, um sicherzustellen, dass der Schlauch die Basis des Reservoirs erreicht. Der Behälterrohrauslass sollte so angezogen werden, dass eine luftdichte Abdichtung erreicht wird. Setzen Sie einen Edelstahl-Anschlussstift (OD: 0,65 mm, ID: 0,35 mm, L: 8 mm) in das offene Ende des Rohres ein. Befestigen Sie einen 23 G, 1/2″ Luer-Stummel am Ende einer kleinen (1 ml) Spritze. Fügen Sie dem Luer-Stub eine kurze Schlauchlänge (OD: 0,06″, ID: 0,02″) hinzu. Legen Sie das Ende des Schlauches in die gewünschte Reagenzlösung, füllen Sie die Spritze mit dem Reagenz. Setzen Sie den Edelstahl-Steckverbinderstift in den mit der Spritze verbundenen Polyurethanschlauch ein und füllen Sie den Schlauch mit dem Reagenz. Bei Verwendung kleiner Reaktionsvolumina gelangt das Reagenz nicht in das Reservoir, und der Schlauch selbst fungiert als Reservoir. Trennen Sie die Spritze, und stecken Sie den Steckerstift in eine der Einlasslöcher der Mikrofluidanlage. Wenden Sie Druck auf jedes der Reservoirs mit der Druckregler-Software an, um die Reagenzien in das mikrofluidische Gerät zu zwingen. Anschließen von gekühlten Flüssigkeiten an das mikrofluidische Gerät Stellen Sie sicher, dass der Wasserkühler und das Peltier-Element eingeschaltet sind und die Oberflächentemperatur des Peltier auf 4 °C eingestellt ist. Montieren Sie das Kühlsystem so nah wie möglich am mikrofluidischen Gerät, wodurch das ungekühlte Volumen zwischen dem Peltier und dem Geräteeinlass minimiert wird. Schließen Sie das offene Ende des PTFE-Schlauchs mit einem der Flüssigkeitsbehälter (wie in Abschnitt 4.2 beschrieben) mit einem Edelstahl-Steckverbinderstift (OD: 0,65 mm, ID: 0,35 mm, L: 8 mm) an. Schließen Sie eine kleine Spritze (1 ml) an einen Luer-Stub (23 G, 1/2″) mit einer kurzen Schlauchlänge (OD: 0,06″, ID: 0,02″) an das Ende an. Füllen Sie die Spritze mit dem zu kühlenden Reagenz (hier die IVTT-Reaktionslösung). Schließen Sie den PEEK-Schlauch über den Bindeschlauch an die Spritze an und drücken Sie die Spritze konstant unter Druck, wodurch das Reagenz durch den PEEK-Schlauch und in den PTFE-Schlauch gezwungen wird. Trennen Sie den PEEK-Schlauch von der Spritze und legen Sie ihn direkt in einen der Durchflusskanaleinlässe des mikrofluidischen Geräts ein. Wenn der Druck über die Druckreglersoftware ausgeübt wird, wird das gekühlte Reagenz in das mikrofluidische Gerät gedrückt. 5. Experimentieren HINWEIS: Vor der Durchführung von Experimenten sollten alle Hardware- und Schlauchverbindungen, die in den Protokollabschnitten 3 und 4 aufgeführt sind, abgeschlossen sein, und alle Reagenzien sollten mit dem Gerät verbunden sein. Das experimentelle Verfahren kann dann in vier verschiedene Teile unterteilt werden: 1) Die Belastung des mikrofluidischen Geräts, 2) Vorbereitung des Mikroskops, 3) Die Kalibrierung des Geräts und 4) Durchführung des Experiments. Die benutzerdefinierte virtuelle Steuerungsschnittstelle (siehe Abbildung 7), die während dieser Forschung verwendet wird, wird als zusätzliche Ressource über die Materialliste bereitgestellt) Laden des mikrofluidischen Geräts Platzieren Sie das mikrofluidische Gerät, wobei alle Kontroll- und Durchflussschichtschläuche in der Mikroskopstufe befestigt sind, und schließen Sie alle Öffnungen am Inkubator. Stellen Sie die Umgebungstemperatur des Inkubators auf 29 °C ein. Stellen Sie sicher, dass das Kühlsystem eingeschaltet und vor dem Beginn des Experiments auf 4 °C eingestellt ist. Stellen Sie sicher, dass alle Durchfluss- und Steuerkanäle unter Druck stehen. Stellen Sie den Druck der Steuerkanäle 1-3 auf 1 bar ein und drücken Sie die Steuerkanäle 9-29 auf 3 bar. Die Reagenzien erfordern einen Druck zwischen 20 und 100 mbar, um mit der Druckreglersoftware auf die Flüssigkeitsbehälter aufgebracht zu werden. Entfernen Sie Luft aus dem mikrofluidischen Gerät mit einem der Reagenzien. Schließen Sie den Auslass des Geräts (Drucksteuerkanal 29) und drücken Sie gleichzeitig die Steuerkanäle 1-3 und 15-28. Drücken Sie dann selektiv die Steuerkanäle des Multiplexers, damit das ausgewählte Reagenz in das Gerät fließen kann. Verwenden Sie das Mikroskop, um die Entfernung von Luft zu überwachen.HINWEIS: Wenn Reagenzien nicht richtig in das Gerät geladen werden oder die Luftblasen nicht entfernt werden, kann der Druck auf bis zu 350 mbar erhöht werden. Stellen Sie sicher, dass alle Reagenzien korrekt fließen, ohne Luft einzuschleusen – mit der Flush-Funktion in der Steuerungssoftware. Die Überwachung des Flüssigkeitsflusses kann vereinfacht werden, indem zunächst ein Fluorophor geladen und seine Verdrängung durch einzelne Reagenzien überwacht wird. Vorbereitung des Mikroskops Mit dem Mikroskop alle Sehenswürdigkeiten (ein einzelner Punkt in jedem Reaktor ist ausreichend) innerhalb des mikrofluidischen Geräts zu lokalisieren und die Koordinaten davon zu speichern. Diese Punkte werden während der Kalibrierung und der experimentellen Prozesse abgebildet.HINWEIS: Während der Kalibrierungs- und Versuchsverfahren, die in der Steuerungssoftware enthalten sind, wird das Mikroskop angewiesen, regelmäßig Bilder an den zuvor gespeicherten Koordinaten zu erfassen. Um dies zu erreichen, kommuniziert die Steuerungssoftware mit der Mikroskopsoftware und informiert sie, neue Bilder aufzunehmen. Diese Kommunikation ist für jedes Mikroskop-Setup einzigartig, und als solche wurde diese Funktionalität innerhalb der bereitgestellten Software-Schnittstelle geändert. Zur Verfügung gestellt wird eine Dummy-Ausführbare Datei, die vom Endnutzer aus Kompatibilität mit ihrem eigenen Mikroskopsystem modifiziert werden kann. Kalibrieren des mikrofluidischen Geräts Bestimmen Sie das von jedem Reaktor während eines einzigen Zulaufschritts verdrängte Flüssigkeitsvolumen (Pumpensequenz durch peristaltisch betätigte Steuerkanäle 15-17, bestehend aus 6 nacheinander ausgeführten MODBUS-Befehlen), indem Sie das Kalibrierprotokoll ausführen. im Softwarepaket bereitgestellt werden. Legen Sie die folgenden Datenfelder innerhalb der Steuerungssoftware fest: Elution Buffer Channel, Fluorophore Channel, Number of Dilution Cycles (Standard ist 10 Verdünnungen), Anzahl der Zuflussschritte (Standard ist 15 Schritte), Anzahl der Mischzyklen (Standard wert ist 4 Zyklen) und Zeit zwischen Mischzyklen (Standard ist 0 Sekunden). Starten Sie die Kalibrierung, indem Sie Kalibrierungsexperiment durchführen.HINWEIS: Während des Kalibrierungsprozesses werden alle Reaktoren mit einem Fluorophor gefüllt und Bilder aufgezeichnet. Anschließend wird eine Reihe von Verdünnungen durchgeführt, bei denen ein Eluent in die Reaktoren dosiert wird (basierend auf der eingestellten Anzahl von Zuflussschritten), wodurch das Fluorophor verdrängt wird. Nach gründlicher Vermischung werden neue Bilder aufgenommen. Dieser Vorgang wiederholt sich für die eingestellte Anzahl der Verdünnungszyklen. Führen Sie nach Abschluss der Kalibrierung die von der Steuerungssoftware vorgestellten Schritte aus und führen Sie die Analyse des Kalibrierungsexperiments durch.HINWEIS: Die Analyse wird den Benutzern das Aktualisierungsverhältnis für jeden Reaktor auf der Grundlage der Fluoreszenzabnahme erhalten, die während jedes Verdünnungszyklus aufgezeichnet wurde. Dieser Wert gibt den Bruchteil des Reaktorvolumens an, der durch die eingestellte Anzahl der Zuflussschritte verschoben wird. Dieser Wert wird wiederum bei Experimenten verwendet, um zu bestimmen, wie viele Zulaufschritte erforderlich sind, um ein bestimmtes Reaktorvolumen zu verdrängen. Durchführen des Experiments Legen Sie die erforderlichen Werte für das gewünschte Experiment innerhalb der virtuellen Steuerungsschnittstelle fest. Kritisch ist die Refresh Fraction [%], die das pro Versuchszyklus verschobene Reaktorvolumen bestimmt und zwischen 15 und 40 % eingestellt werden sollte.HINWEIS: Das spezifische experimentelle Protokoll bestimmt, welche Felder der Steuerschnittstelle vor dem Versuch sende. Einige kleinere Codierungen werden erforderlich sein, um die Steuerungsschnittstelle für neuartige Experimente anzupassen. Initiieren Sie das experimentelle Protokoll, indem Sie die Schaltfläche Experiment ausführen in der Steuerschnittstelle drücken.HINWEIS: Unverändert initiiert die mitgelieferte Software eine einfache Proteinexpression. Die Reaktoren 1 und 8 werden als Steuerungen eingesetzt, während die Reaktoren 2-7 identische Experimente beherbergen. Hier besteht 75% des Reaktorvolumens aus IVTT-Lösung, und 25% ist entweder Reinstwasser oder eine 2,5 nM lineare DNA-Lösung. Verdünnungen treten alle 15 Minuten auf, wobei 30 % des Reaktorvolumens durch Verdünnung verschoben werden. Die Bilder werden am Ende jedes Verdünnungszyklus aufgezeichnet. 6. Datenanalyse ANMERKUNG: Es wurden Skripte für die Analyse der Bilder bereitgestellt (siehe Zusatzdateien oder die Tabelle der Materialien), unter Verwendung des Analysepakets “bfopen”, das für die Überprüfung von”nd2″-Dateienerforderlich ist (von uns bereitgestellt). Mikroskop-Setup). Führen Sie das Analyseskript ‘calibrationScript.m’ aus und wählen Sie einmal die gewünschte Datei’nd2’aus. Es wird ein einzelnes Reaktorbild angezeigt, mit dem die richtige Bildintensität bestimmt werden kann. Verwenden Sie den Schieberegler, um die Bildintensität so zu optimieren, dass die Kanten des mikrofluidischen Kanals deutlich sichtbar sind. Ein Bild des Reaktors wird gezeigt. Wählen Sie in diesem Bild einen Bereich innerhalb des Reaktorkanals aus, dessen Fluoreszenzintensität bestimmt werden soll.ANMERKUNG: Die Fluoreszenzintensität jedes Reaktors für jedes aufgenommene Bild wird mit den in einem einfachen Diagramm dargestellten Ergebnissen bestimmt, was die Visualisierung der Ergebnisse ermöglicht.

Representative Results

Um die Wirksamkeit der mehrschichtigen mikrofluidischen Plattform für die Durchführung von IVTT-Experimenten zu demonstrieren, wurde das beschriebene Setup verwendet, um das DeGFP-Protein auszudrücken. Das Experiment wurde in einem kommerziell erhältlichen30 IVTT-Reaktionsgemisch durchgeführt, das alle notwendigen Transkriptions- und Übersetzungskomponenten umfasst und mit Reaktionssubstraten und DNA-Vorlagen ergänzt wird. Die Experimente wurden bei einer Temperatur von 29 °C durchgeführt; eine Temperatur, die für die IVTT-Expression von Proteinen optimal ist. Das mikrofluidische Gerät besitzt neun einzigartige Einlässe, von denen vier während dieses Experiments eingesetzt wurden. Die erste enthielt das kommerziell erhaltene IVTT-Reaktionsgemisch. Das IVTT-Reaktionsgemisch nimmt alle Komponenten auf, die für die erfolgreiche Ausdrücke von Proteinen erforderlich sind, jedoch wurde dem Reaktionsgemisch – in einer Endkonzentration von 1,3 m – vor dem Einladen in die mikrofluidische Vorrichtung gereinigtes GamS zugesetzt. Die Zugabe des GamS-Proteins dient dazu, den Abbau linearer DNA-Arten bei der Durchführung der Experimente zu minimieren. Entscheidend ist, dass das IVTT-Gemisch in Polytetrafluorethylen-Schläuche (PTFE) in ein Peltier-Element mit einer Oberflächentemperatur von 4 °C gespritzt wurde, um die Lösung vor ihrer Injektion in die mikrofluidische Vorrichtung zu kühlen; die Verschlechterung der Reaktionslösung vor ihrer Anwendung zu verhindern. Mikrobohrung Polyether-Keton (PEEK) Rohre wurde verwendet, um die PTFE-Schläuche verlassen die Peltier-Elementoberfläche mit dem mikrofluidischen Gerät zu verbinden, wodurch das Volumen der IVTT-Reaktionsmischung nicht gekühlt. Die zweite in das Gerät eingesetzte Lösung enthielt die lineare DNA-Schablonenkodierung für das deGFP – gelöst in Reinstwasser – in einer Konzentration von 10 nM. Die dritte Lösung, das Reinstwasser, diente während der experimentellen Verfahren mehreren Zwecken. In erster Linie wurde das Reinstwasser verwendet, um sicherzustellen, dass das verdrängte Volumen pro Verdünnung für alle Reaktoren gleich war, was als Ersatz für DNA in den Kontrollreaktionen fungierte. Darüber hinaus wurde reines Reinstwasser auch verwendet, um das Fluorophor während der Gerätekalibrierung zu verdünnen und das totes Volumen des Geräts beim Umschalten zwischen Reagenzien zu spülen. Die endgültige Lösung, die in das Gerät eingeführt wurde, war eine gereinigte FITC-Dextran-Lösung (25 m), die für die erstmalige Gerätekalibrierung erforderlich war. Die DNA-, Wasser- und Fluorophorlösungen wurden in Schläuche (0,02″-ID, 0,06″ OD) injiziert, die anschließend gemäß Abschnitt 4.2 der Protokolle in einen der Zuflusskanäle des mikrofluidischen Geräts eingeführt werden konnten. Als solche wurden diese Lösungen bei 29 °C für die Gesamtheit der Experimente gelagert. Die Betätigung der Steuerkanäle des mikrofluidischen Gerätes erfolgt über eine kundenspezifische Steuerungssoftware, bei der jeder der Steuerkanäle einzeln betätigt werden kann. Die Ausführung längerer IVTT-Reaktionen kann nicht über diesen manuellen Prozess erreicht werden und erfordert die Verwendung automatisierter Protokolle, die in die Steuerungssoftware integriert sind. Bei der Vorbereitung eines mikrofluidischen Geräts für Experimente können ähnliche automatisierte Protokolle verwendet werden, um eine Reihe nützlicher Prozesse auszuführen: die Spülung des Abtotvolumens des Geräts mit einem neuen Reagenz, die Vermischung der Reagenzien innerhalb des Ringreaktors und die ein neues Reagenz in den Reaktor, während ein gleiches Volumen der aktuellen Lösung verdrängt wird. Darüber hinaus stehen zwei komplexe Verfahren zur Verfügung: die Durchführung einer Gerätekalibrierung und die Ausführung einer längeren zellfreien Proteinexpression. Alle oben genannten Prozesse können einfach von der Hauptschnittstelle aus ausgeführt werden, zusammen mit der Möglichkeit, mehrere Parameter zu konfigurieren, um bestimmte Prozesseinstellungen wie Denflusskanal, Zuflussvolumen und Mischdauer zu variieren. Aufgrund von Druckschwankungen und Unvollkommenheiten bei der Herstellung mikrofluidischer Geräte kann das Volumen der während eines einzigen Injektionszyklus verschobenen Flüssigkeitsmenge zwischen den Geräten variieren. Daher wurde vor der Durchführung von IVTT-Experimenten das verschobene Reaktorvolumen pro Injektionszyklus (Refresh Fraction) bestimmt. Diese Kalibrierung erfordert die Befüllung aller acht Reaktoren mit einer fluoreszierenden Referenzlösung. In diesem Fall wurde eine gereinigte FITC-Dextran-Lösung (25 m) verwendet. Anschließend werden die Reaktoren zehnmal mit Reinstwasser verdünnt. Durch Messung der Abnahme der Fluoreszenz pro Verdünnungszyklus für jeden Reaktor wurde das Volumen der während eines einzigen Injektionszyklus verdrängten Flüssigkeit bestimmt. Innerhalb der Steuerungssoftware wurde dieser Wert (das Aktualisierungsverhältnis) für die Verwendung während des IVTT-Experiments aufgezeichnet. Entscheidend ist, dass die Schwankungen der Durchflussmenge über das Gerät sowie Die Abweichungen in den einzelnen Reaktorvolumina berücksichtigt und für jeden einzelnen Reaktor gespeichert werden. Die Abfolge des Befüllens und Verdünnens der Reaktoren wurde automatisch mit dem Programm “Kalibrierung durchführen” durchgeführt, das Teil der Steuerungssoftware ist. Die Ergebnisse des Kalibrierexperiments sind in Abbildung 8dargestellt. Der komplexeste vorprogrammierte Prozess führt ein langzeit-IVTT-Experiment durch, das es benutzern ermöglicht, das Experiment zu initiieren und anschließend unbeaufsichtigt bis zum Abschluss zu betreiben. Während des gesamten Experiments wurden die Reaktoren 1 und 5 als Rohlinge verwendet, wobei den Reaktoren während der Verdünnungen nur Wasser zugesetzt wurde. Die Reaktoren 2 und 6 wurden als Negativkontrollen eingesetzt und enthielten nur IVTT-Reaktionslösung und Reinstwasser. Die übrigen Reaktoren (3, 4, 7 und 8) enthielten die IVTT-Reaktionslösungen und 2,5 nM lineare DNA-Codierung für das DeGFP-Gen. Die Initialisierung der Reaktoren erfolgt durch vollständige Befüllung aller Reaktoren (ohne 1 und 5) mit der IVTT-Reaktionslösung, bevor 25 % des Reaktorvolumens mit Reinstwasser verdrängt wurden. Danach wurde die periodische Injektion von Reagenzien in die Reaktoren eingeleitet. Das Experiment wurde so durchgeführt, dass alle 14,7 Minuten neue Reagenzien in die Reaktoren injiziert wurden, wobei 30 % des Reaktorvolumens während jedes Verdünnungszyklus verschoben wurden. Die Zusammensetzung jeder Injektion war so, dass 75% der injizierten Flüssigkeit eine frische IVTT-Lösung enthielten, während die restlichen 25% entweder aus DNA oder Reinstwasser bestanden. Nach jeder Injektion neuer Reagenzien wurden die Reaktoren kontinuierlich gemischt, woraufdurch mit dem Mikroskop ein Fluoreszenzbild jedes Reaktors aufgezeichnet wurde. Die Reaktion konnte anschließend für 68 Zyklen kontinuierlich laufen, was zu einer experimentellen Dauer von 16,5 h führte. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Abbildung 9dargestellt. Bei längeren IVTT-Experimenten gibt es zwei Hauptursachen für das Versagen einer Reaktion; die Einbringung von Luft in das mikrofluidische Gerät oder den Abbau der IVTT-Reaktionslösung. Das Auftreten von Luft innerhalb des mikrofluidischen Geräts ist meist das direkte Ergebnis kleiner Luftblasen, die in den Zuflusslösungen vorhanden sind und anschließend in das mikrofluidische Gerät injiziert werden. Beim Betreten des Gerätes hemmt das Vorhandensein von Luft den richtigen Flüssigkeitsfluss, wodurch die Reaktionen nicht mehr periodisch aufgefrischt werden, was zur Bildung von Chargenreaktionen innerhalb der Reaktorringe führt. In einigen Fällen wird die Luft durch wiederholteSpülung von Reagenzien langsam aus dem Gerät entfernt, danach setzt sich die Reaktion wie beabsichtigt fort (siehe Abbildung 9). In anderen Fällen bleibt die Luft gefangen und kann nur entfernt werden, indem das Experiment abgebrochen und anschließend kontinuierlicher (hoher) Druck auf die Strömungsschicht der mikrofluidischen Vorrichtung ausgeübt wird, analog zum in Abschnitt 5.1 der Protokolle beschriebenen Abfüllvorgang. Während unserer Experimente wird das Zelllysat in PTFE-Schläuchen auf einem Auf 4 °C gekühlten Peltier-Element gelagert. Beide Maßnahmen helfen, den Abbau der IVTT-Reaktionslösung im Laufe der Zeit zu begrenzen, wobei die inerten PTFE-Schläuche eine begrenzte Wechselwirkung zwischen dem Schlauch und der Reaktionslösung und die kalten Temperaturen gewährleisten, die die funktionelle (bio-)molekulare Komponenten, die für die Durchführung von IVTT erforderlich sind. Sollte es zu einer Verschlechterung der Reaktionslösung kommen – als Folge unzureichender Kühlung oder unerwünschter Wechselwirkungen zwischen der Reaktionslösung und der Speicherumgebung – dann wird sich dies experimentell als eine allmähliche Reduktion des Proteins Ausdruck im Laufe der Zeit. Nach der Degradierung kann die IVTT-Reaktionslösung nicht mehr zurückgewonnen werden, und es sollte ein neues Experiment vorbereitet werden. Abbildung 1. Die Hardware-Einrichtung, die erforderlich ist, um kontinuierliche IVTT-Reaktionen durchzuführen. A) Schema der Hardware-Einrichtung. B) Foto des Setups, das in diesem Manuskript verwendet wird. Die Implementierung eines mehrschichtigen mikrofluidischen Geräts für kontinuierliche IVTT-Reaktionen erfordert ein umfangreiches Hardware-Setup, um den Durchflussdruck zu regulieren, Steuerkanäle zu betätigen, Wärme- und Kühlreaktionen und Reagenzien zu verwenden, Flüssigkeiten zu speichern und das Gerät während der Experimente. Experimente werden bei Temperaturen von 30 °C durchgeführt, was durch die Platzierung des Mikroskops in einem Inkubator auf diese Temperatur erreicht wird. Um eine Verschlechterung der IVTT-Reaktionslösung zu verhindern, wird sie in PTFE-Schläuchen gelagert, die über die kaltwandige Fläche eines Peltier-Elements gewickelt sind. Die Temperatur des Peltier-Elements wird auf 4 °C eingestellt, wobei ein Wasserkühler und ein Wasserblock verwendet werden, um diese Temperatur aufrechtzuerhalten. Reagenzien, die nicht gekühlt werden müssen, werden in Flüssigkeitsreservoirs außerhalb des Mikroskop-Inkubators gelagert. Ein computergesteuerter Druckregler wird konstanter Druck auf diese Reservoirs ausgeübt. Auf diese Weise werden die Flüssigkeiten durch die Auslassschläuche der Reservoirs gedrückt, die sich direkt mit den Zuflusskanälen des mikrofluidischen Geräts verbinden. Jeder der Steuerkanäle des mikrofluidischen Geräts ist mit einem pneumatischen Ventil verbunden. Das gesamte Ventil-Array steht unter konstantem Druck. Das Öffnen des Ventils ermöglicht das Drücken der Flüssigkeit innerhalb des Schlauches, die das pneumatische Ventil mit dem Steuerkanal des mikrofluidischen Geräts verbindet, wodurch die PDMS-Membranen, die sich in der mikrofluidischen Vorrichtung befinden, geöffnet und geschlossen werden. Die pneumatischen Ventile werden über eine Benutzeroberfläche geöffnet und geschlossen, die einen (nicht gezeigten) Feldbusregler zum Öffnen und Schließen bestimmter pneumatischer Ventile befiehlt. Figur angepasst von Yelleswarapu et al.22. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 2. Übersicht über den pneumatischen Ventilaufbau und steuerkanalgebundenen Anschluss. Ein 8-Ventil-Array wird mit drei Steuerkanalanschlüssen an ventiliert 1, 2 und 3 angezeigt. Druckluft kann über 1/4″ Schläuche in das Ventilarray zugeführt werden. Für die Betätigung der Steuerkanäle werden zwei Drücke verwendet: 1 bar für die unteren Druckregelkanäle (1, 2 und 3) und 3 bar für die höheren Druckregelkanäle (9 bis 30, hier nicht dargestellt). Die Schläuche können mit Reinstwasser gefüllt und mit einem Edelstahl-Steckverbinderstift in einen der Steuerkanaleinlässe eingelassen werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 3. Überblick über den handelsüblichen Durchflussdruckregler und das Reservoirsystem. Ein handelsüblicher Druckregler wird verwendet, um Flüssigkeiten in die Durchflussschicht des mehrschichtigen mikrofluidischen Geräts zu injizieren. Das Anschließen des Druckreglers an einen Computer ermöglicht die Modulation des Drucks, der für die Durchführung der Flüssigkeitsinjektionen verwendet wird. Reagenzien können in einem Flüssigkeitsreservoir gelagert werden, das direkt mit dem Druckregler verbunden ist. Die Anwendung des Drucks auf das Reservoir zwingt die Flüssigkeit über den Auslassschlauch aus dem Reservoir. Dieser Auslassschlauch kann mit einem Edelstahl-Steckverbinderstift direkt an einen der Flüssigkeitseinlässe des mikrofluidischen Geräts angeschlossen werden. Für den Fall, dass das Reagenzvolumen nicht in das Flüssigkeitsreservoir gelangen kann, fungiert der Auslassschlauch als Reservoir für das Reagenz. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 4. Überblick über das Kühlsystem zur Kühlung von Reaktionsreagenzien. (links) Isolierte Kühlung und (rechts) Kühleinrichtung innerhalb des Mikroskops platziert und mit dem mikrofluidischen Gerät verbunden. Ein Peltier-Element wird verwendet, um die IVTT-Reaktionslösung vor der Injektion in das mikrofluidische Gerät zu kühlen. Das Reagenz wird in PTFE-Schläuchen gelagert, die über die Kaltfläche des Peltier-Elements gewickelt sind. Eine Länge von PEEK-Schläuchen wird verwendet, um die gekühlte Flüssigkeit auf das mikrofluidische Gerät zu übertragen, wobei der kleine Innendurchmesser (0,005″) das Reagenzvolumen nicht mehr gekühlt wird. Neben den gewickelten PTFE-Schläuchen wird ein Thermistor platziert, der eine Echtzeit-Temperaturüberwachung auf der Oberfläche des Peltier-Elements ermöglicht. Die auf das Peltier aufgebrachte Spannung ist so eingestellt, dass die Oberflächentemperatur des Peltiers zwischen 0 °C und 4 °C bleibt. Um überschüssige Wärme zu entfernen, die durch das Peltier-Element erzeugt wird, wird die Heißfläche des Peltiers gegen einen wassergekühlten Block platziert, wobei silikonfreies Kühlkörperfett für eine optimale Wärmeübertragung zwischen den beiden Flächen sorgt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 5. Überblick über das Mikrofluid-Gerätedesign. Der mikrofluidische Durchflussreaktor für kontinuierliche IVTT-Reaktionen besteht aus acht Reaktorringen mit einem Volumen von jeweils 10,7 nL. Neun Einlässe ermöglichen den Zufluss von neun einzigartigen Reaktionslösungen in das Gerät. 24 Steuerkanäle regulieren den Flüssigkeitsfluss innerhalb des Gerätes. Steuerkanäle 9 bis 14 bilden einen Multiplexer. Diese Steuerkanäle sollten jederzeit unter Druck gesetzt werden, um den Flüssigkeitsfluss in das Gerät zu hemmen. Die gleichzeitige Deprimurisierung von zwei Steuerkanälen ermöglicht den Zufluss eines einzelnen Reagenzes. Die Steuerkanäle 15, 16 und 17 werden verwendet, um die Reagenzien kontrolliert in das Gerät zu pumpen. Die Steuerkanäle 18 bis 25 steuern jeweils den Einlass eines der acht Reaktoren, die sich im Gerät befinden. Steuerkanal 26 kann den Spülkanal schließen und so Flüssigkeit in die Reaktoren zwingen. Steuerkanal 27 hilft bei der homogenen Befüllung der Reaktoren. Die Steuerkanäle 28 und 29 regeln die Ringreaktorauslässe bzw. den einzigen Geräteauslass. Schließlich werden die Steuerkanäle 1, 2 und 3 verwendet, um die Flüssigkeit in den Ringreaktoren peristaltisch zu pumpen, was zu einer Vermischung der Reagenzien führt. Das Design dieses mikrofluidischen Geräts und die Figur sind beide von Neiderholtmeyer et al.29adaptiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 6. Membranbasiertes Ventil innerhalb des mikrofluidischen Geräts. A) Durchflusskanal innerhalb des mikrofluidischen Geräts. Im Hintergrund sind zwei Steuerkanäle zu sehen. Diese Kanäle sind nicht unter Druck gesetzt und als solche sind die Ventile offen (Flüssigkeit kann fließen). B) Die beiden Steuerkanäle, die die Strömungsschichtkanäle schneiden, wurden unter Druck gesetzt und schließen die Ventile (d. h. der Flüssigkeitsfluss wird behindert). Bei Druck der Steuerkanäle wird die dünne PDMS-Membran, die die Strömungs- und Regelschichtkanäle trennt, nach oben abgelenkt (die Kontrollschicht liegt unter der Strömungsschicht), wodurch der Strömungsschichtkanal geschlossen wird. Die Rundung des Strömungsschichtkanals ist entscheidend, um sicherzustellen, dass die umgelenkte Membran den Durchflusskanal vollständig schließt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 7. Benutzeroberfläche zur Steuerung von mikrofluidischen Geräten. Während dieser Forschung wurde eine benutzerdefinierte Steuerungsschnittstelle verwendet, um den Fluss von Flüssigkeiten innerhalb der mikrofluidischen Geräte zu steuern. Die Schnittstelle ermöglicht es dem Anwender, jeden der Steuerkanäle einzeln zu betätigen (nummeriert 1-3 und 9-29), oder aufwendige Protokolle auszuführen, die zum Spülen und Laden von Reagenzien, zur Kalibrierung des mikrofluidischen Geräts und zur Experimente. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 8. Ergebnisse eines Kalibrierungsexperiments. Während eines Kalibrierexperiments werden die Reaktoren mit einem Fluorophor (25 M FITC-Dextran) gefüllt, nach dem die Fluoreszenzintensität aufgezeichnet wird. Anschließend folgt eine Reihe von Verdünnungen, bei denen eine reihe von Zuflussschritten (15) verwendet werden, um reinstes Wasser in die Reaktoren zu injizieren. Nach jeder Verdünnung werden die Reagenzien gemischt und die Fluoreszenz gemessen. Die Abnahme der Fluoreszenzintensität pro Verdünnung zeigt das Volumen des Reaktorrings, der für die eingestellte Anzahl von Zulaufschritten verschoben wurde; ein Wert, der als Refresh Ratiobezeichnetwird. A) Die durchschnittliche Intensität und Standardabweichung aller acht Reaktoren wird rot dargestellt, wobei die einzelnen Intensitätsspuren grau dargestellt werden. B) Das durchschnittliche Aktualisierungsverhältnis und die Standardabweichung werden für jeden Verdünnungsschritt rot angezeigt. Die einzelnen Refresh Ratios jedes einzelnen Reaktors sind grau dargestellt. Es ist zu sehen, dass sieben der acht Reaktoren ein sehr ähnliches Verhalten aufweisen, aber ein Reaktor zeigt Schwankungen im Refresh Ratio nach dem siebten Verdünnungszyklus. Dies unterstreicht die Notwendigkeit einzigartiger Refresh Ratios für jeden Reaktor, im Gegensatz zur Verwendung eines durchschnittlichen Refresh Ratio für die Injektion von Reagenzien in die Reaktoren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 9. Ergebnisse eines IVTT-Experiments, das das DeGFP-Protein exzessiiert. Eine längere IVTT-Reaktion wurde so eingeleitet, dass 30 % des Reaktorvolumens alle 14,6 Minuten verschoben werden. Die Reaktion durfte über 16 Stunden laufen, bevor sie beendet wurde. Zwei Reaktoren der mikrofluidischen Vorrichtung wurden als Rohlinge verwendet, wobei während des gesamten Versuchs nur Reinstwasser durch die Reaktoren geflogen wurde (Reaktoren 1 und 5). Alle anderen Reaktoren bestanden aus 75 % IVTT-Reaktionslösung und 25 % entweder aus Reinstwasser (Reaktoren 2 und 6) oder 2,5 nM linearen DNA-Vorlagen, die für die Expression von DeGFP kodieren (Reaktoren 3, 4, 7 und 8). In allen vier Reaktoren, in denen DNA hinzugefügt wurde, gibt es eine klare DeGFP-Expression. Drei der vier Reaktoren bieten eine ähnliche Fluoreszenzintensität, wobei ein Reaktor ein niedrigeres Fluoreszenzsignal anzeigt. Dies könnte durch eine Unterschiedliche im Durchfluss, die dazu führt, dass weniger DNA in den Reaktor gelangt, oder durch Schwankungen der Reaktorabmessungen verursacht werden. Nach 14 Stunden ist ein plötzlicher Anstieg des Signals der DNA-haltigen Reaktoren zu beobachten. Dies wird durch eine Luftblase verursacht, die in die Strömungsschicht des mikrofluidischen Geräts eindringt und vermutlich von einer der Zuflusslösungen stammt. Das Einfangen von Luft in der mikrofluidischen Vorrichtung begrenzt den Flüssigkeitsfluss durch die Kanäle erheblich, wodurch den Reaktoren keine frischen Reagenzien zugesetzt oder aus den Reaktoren entfernt werden können, bis die Luft vorbei ist. Nach Wiederaufnahme des Flusses kehrt das Experiment zu seiner vorherigen Fluoreszenzintensität zurück. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Ergänzende Dateien. Bitte klicken Sie hier, um diese Dateien herunterzuladen. 

Discussion

Ein mikrofluidisches Gerät auf PDMS-Basis wurde vorgestellt, und seine Fähigkeit, IVTT-Reaktionen über einen längeren Zeitraum aufrecht zu erhalten, wurde nachgewiesen. Obwohl diese Technologie für dieses spezifische Beispiel gut geeignet ist, kann sie für zahlreiche andere Anwendungen eingesetzt werden. Die zusätzliche Kontrolle des Flüssigkeitsflusses – gepaart mit der Fähigkeit, Reaktionsreagenzien kontinuierlich aufzufüllen und gleichzeitig (durch) Produkte zu entfernen – ist ideal für kontinuierliche Synthesereaktionen, die Untersuchung verschiedener dynamischer Verhaltensweisen und die gleichzeitige Leitung mehrerer Variationen einer einzelnen Reaktion.

Trotz des relativ einfachen Fertigungsprozesses von PDMS-basierten Geräten erfordert deren Verwendung eine umfangreiche Hardware-Einrichtung. Der Übergang von der Fertigung zur Verwendung besteht aus Ventilanordnungen, Druckreglern, Druckpumpen, Inkubatoren und Kühlaggregaten und erfordert keine erheblichen Anfangsinvestitionen. Darüber hinaus erfordert die Fähigkeit, konsequent emittierende Experimente mit diesen Geräten durchzuführen, eine erhebliche Zeitinvestition; ein Punkt, auf den dieses Manuskript eingehen soll. Sobald sie jedoch eingerichtet ist, kann das gesamte Setup für eine Reihe von Zwecken geändert werden. Darüber hinaus umfasst die Hardware-Einrichtung zahlreiche modulare Elemente, die jeweils erweitert werden können, um komplexere mikrofluidische Gerätekonstruktionen zum Einsatz zu veranlassen. Darüber hinaus ermöglicht der modulare Aufbau den Austausch von Hardwarekomponenten durch ähnlich funktionierende Alternativen, so dass die Benutzer nicht auf die hier beschriebene spezifische Einrichtung beschränkt sind48,49.

Die Variabilität zwischen einzelnen Geräten und unter den äußeren Bedingungen (z. B. Druckschwankungen) kann bei der Durchführung von Experimenten mit diesen Geräten zu Ungenauigkeiten führen. Um dieses Problem zu beheben, sollte vor jedem Experiment eine Kalibrierung des Systems durchgeführt werden, die ein eindeutiges Aktualisierungsverhältnis für jeden der Reaktoren bereitstellt. Während die Kalibrierung die Geräte-zu-Gerät- und Experiment-zu-Experiment-Variationen adressiert, ist es ein zeitaufwändiger Prozess und nicht einwandfrei. Flüssigkeiten mit unterschiedlichen Viskositäten fließen nicht mit der gleichen Rate, wenn sie identischem Druck ausgesetzt sind, und als solche führt die Kalibrierung mit mehreren Reagenzien möglicherweise nicht zu identischen Refresh Ratios. Dieser Effekt wird durch den Einsatz von drei Steuerkanälen abgeschwächt, um die Reagenzien peristaltisch in das mikrofluidische Gerät zu pumpen, anstatt den Durchfluss nur durch Variation des zugeführten Drucks zu regulieren. Als letztes Mittel in Fällen, in denen die Viskositätsunterschiede sehr groß sind, kann für jedes einzelne Reagenz ein einzigartiges Refresh Ratio implementiert werden, indem mehrere Kalibrierungsexperimente durchgeführt werden.

Die Verwendung einer peristaltischen Pumpe zur Injektion von Reagenzien in das mikrofluidische Gerät dämt die Auswirkungen der Verwendung von Lösungen mit unterschiedlichen Viskositäten ab, schafft aber auch ein sekundäres Problem. Die Verwendung diskreter Schritte, um Flüssigkeiten in das mikrofluidische Gerät zu pumpen, bedeutet, dass die Auflösung von Injektionen in einen einzelnen Reaktor durch das Volumen begrenzt wird, das bei der Durchführung eines einzelnen Pumpenzyklus injiziert wird. Innerhalb unserer Forschung beträgt dieser Wert – der während der Kalibrierung ermittelt wurde – ungefähr 1%, was darauf hindeutet, dass ein einzelner Pumpenzyklus etwa 1% des Reaktorvolumens (ca. 0,1 nL) verdrängt. Daher erfordert die Verdrängung von 30 % des Reaktorvolumens die Ausführung von 30 Pumpenzyklen, wobei 23 Pumpenzyklen der IVTT-Reaktionslösung hinzugefügt und nur 7 Pumpenzyklen von DNA oder Reinstwasser hinzugefügt werden. Obwohl alternative versuchsweise, Probleme zu vermeiden, können alternative Versuchsprotokolle Probleme auftreten, wenn sie versuchen, eine größere Anzahl einzigartiger Reagenzien hinzuzufügen, eine niedrigere Refresh Fractionzu verwenden oder einem Reaktor kleinere Volumina eines einzelnen Reagenzes hinzuzufügen. In solchen Fällen kann das Mikrofluid-Gerätedesign angepasst werden, um Reaktoren ein größeres Volumen zu bieten. Ein Beispiel dafür ist in Niederholtmeyer et al.36berichtet.

Entscheidend ist, dass das in diesem Manuskript beschriebene Gerät es ermöglicht, Reaktionen über einen längeren Zeitraum aufrecht zu erhalten, was zu stationären Transkriptions- und Übersetzungsraten führt. Durch periodische Injektion neuer Reagenzien in die Reaktoren – und Entfernen von Reaktion (durch) Produkte – werden die Reaktionen nachhaltig und komplexe dynamische Verhaltensweisen überwacht werden. Auf diese Weise wurde eine Plattform geschaffen, die – bis zu einem gewissen Grad – die zelluläre Umgebung imitiert. Darüber hinaus ermöglicht diese Plattform die Erforschung der Systemdynamik, indem der Zeitraum zwischen den Injektionen und der spezifischen Zusammensetzung der Injektionen angepasst wird. Daher sind diese mehrschichtigen mikrofluidischen Geräte ein leistungsfähiges Werkzeug zur Charakterisierung und Optimierung neuartiger synthetischer Netzwerke, die komplexes dynamisches Verhalten aufweisen.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde vom Europäischen Forschungsrat, ERC (Projekt n. 677313 BioCircuit) unterstützt, einem NWO-VIDI-Stipendium der niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO, 723.016.003), mit Mitteln des Ministeriums für Bildung, Kultur und Wissenschaft (Gravity 024.001.035 & 024.003.013), das Human Frontier Science Program Grant RGP0032/2015, den European Research Council im Rahmen des Forschungs- und Innovationsprogramms Horizont 2020 der Europäischen Union Grant 723106 und einen Stipendium der Schweizerischen Nationalstiftung 200021_182019.

Materials

Reagents
Acetone VWR 20063.365
AZ 40 XT Merck KGaA (Darmstadt, Germany) – Positive Photoresist
AZ 726 MIF Developer Merck KGaA (Darmstadt, Germany) – Developer Positive Photoresist
Isopropanol Merck KGaA (Darmstadt, Germany) 109634
Microscope slides VWR ECN 631-1550
mr Dev 600 Microresist Technology GmbH (Berlin, Germany) – Developer Negative Photoresist
Silicon Free Heat Sink Grease Circuit Works CW7270 Thermal Compound
Silicon wafers Silicon Materials – <1-0-0> orientation, 100 mm diameter, 525 µm thickness
SU-8 3050 Microchem Corp. (Newton, MA) – Negative Photoresist
Sylgard 184 Elastomer Kit (PDMS) The Dow Chemical Company 01317318
trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane Sigma-Aldrich 448931-10G
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
4 channel digital input/output module WAGO Kontakttechnik GmbH 750-504 8x
Camera lens The Imaging Source –
Compression fitting Koolance, Inc. FIT-V06X10 Fitting for tubing with 6mm ID and 10mm OD. 4x
Controller end module WAGO Kontakttechnik GmbH 750-600
Device connecting tubing Saint-Gobain Performance Plastics AAD04103 0.02" ID, 0.06" OD, Tygon Tubing (ND-100-80)
Device connector pins Unimed SA (Lausanne, Switserland) 200.010-A AISI 304 tubing, 0.35mm ID, 0.65mm OD, 8mm L
Ethernet Controller WAGO Kontakttechnik GmbH 750-881
Female bus connector Encitech DTCK15-DBS-K 15 pole female bus connector
Fluid reservoirs Fluigent Fluiwell-4C
Fluigent pressure system Fluigent MFCS-EZ 0 – 345 mbar
Hg short arc lamp Advanced Radiation Corporation – 350W
Hot plate Torrey Pines Scientific HP61
Inverted microscope Nikon Instruments Eclipse Ti-E
LabVIEW Software de Greef Lab, Eindhoven University of Technology https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software
Liquid coolant Koolance, Inc. LIQ-705CL-B
Luer stubs Instech Laboratories, Inc. LS23
Male Luer to barb connectors Cole Parmer 45505-32 3/32" ID
Matlab Software de Greef Lab, Eindhoven University of Technology https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software
Microcamera The Imaging Source DMK 42AUC03
Microscope camera Hamamatsu Photonics OrcaFlash4.0 V2 (C11440-22CU)
Orbital shaker Cole Parmer EW-513000-05
Oven Thermo Scientific Heraeus T6P 50045757
Oxygen plasma asher Quorum Technologies K1050X
PDMS puncher SYNEO Accu-Pucnh MP10
PEEK tubing Trajan 1301005001-5F 0.005" ID, 1/32" OD, Red
Peltier element European Thermodynamics APH-127-10-25-S
Peltier temperature controller Warner Instruments CL-100
Photomask CAD/Art Services, Inc. –
Photomask Design Maerkl Lab, EPFL https://zenodo.org/record/886937#.XBzpA8-2nOQ
Pneumatic valve array FESTO – 1x 22 valve array and 1x 8 valve array, Normally closed valves.
Power adapter Koolance, Inc. ADT-EX004S 110/220V AC Power Adapter
PTFE tubing Cole Parmer 06417-21 #24 AWG Thin Wall PTFE
Punching pin SYNEO CR0320245N21R4 OD: 0.032" (0.8128 mm), ID: 0.024" (0.6090 mm)
PVC Tubing Koolance, Inc. HOS-06CL 6 mm ID, 10 mm OD
Single edge blades GEM Scientific –
Soft tubing Fluigent – Supplied with fluid reservoirs. (1 mm ID, 3mm OD)
Spin coater Laurell Technologies Corporation WS-650MZ-23NPPB
Stereo microscope Olympus Corporation SZ61
Thermistor cable Warner Instruments TA-29 Cable with bead thermistor
UV exposure system ABM, USA – Near UV Exposure System, 350W
Vacuum pump Vacuumbrand GmbH MD1C
Water cooled cold plate block Koolance, Inc. PLT-UN40F
Water cooler Koolance, Inc. EX2-755
Weighing scales Sartorius M-prove
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van der Linden, A. J., Yelleswarapu, M., Pieters, P. A., Swank, Z., Huck, W. T. S., Maerkl, S. J., de Greef, T. F. A. A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression. J. Vis. Exp. (152), e59655, doi:10.3791/59655 (2019).
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