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Bioengineering

Une plate-forme microfluidique multicouche pour la conduite d'une expression génique prolongée sans cellules

Published: October 06, 2019
doi:
10.3791/59655
, , , , , ,
1Institute for Complex Molecular Systems, Department of Biomedical Engineering, Computational Biology Group,Eindhoven University of Technology, 2Institute for Molecules and Materials,Radboud University, 3Institute of Bioengineering,School of Engineering École Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL)

Summary

Le processus de fabrication d’un dispositif microfluidique à base de PDMS, multicouches, qui permet d’effectuer des réactions de transcription et de traduction in vitro (IVTT) sur de longues périodes est décrit. En outre, un aperçu complet du matériel et des logiciels nécessaires pour automatiser et maintenir ces réactions pendant de longues durées est fourni.

Abstract

Les limites de la biologie synthétique à base cellulaire deviennent de plus en plus évidentes à mesure que les chercheurs cherchent à mettre au point des circuits de régulation génétique synthétique plus vaste et plus complexe. L’analyse des réseaux de régulation génétiques synthétiques in vivo prend du temps et souffre d’un manque de contrôle environnemental, avec des composants synthétiques exogènes interagissant avec les processus de l’hôte entraînant un comportement indésirable. Pour surmonter ces problèmes, la caractérisation sans cellules des circuits nouveaux est de plus en plus répandue. Les mélanges de transcription et de traduction in vitro (IVTT) permettent la régulation de l’environnement expérimental et peuvent être optimisés pour chaque système unique. Les protocoles présentés ici détaillent la fabrication d’un dispositif microfluidique multicouche qui peut être utilisé pour soutenir les réactions IVTT pendant de longues durées. Contrairement aux réactions par lots, où les ressources s’épuisent au fil du temps et que les produits (par-) s’accumulent, l’utilisation de dispositifs microfluidiques permet de reconstituer les ressources ainsi que de retirer les produits de réaction. De cette façon, l’environnement cellulaire est imité en maintenant un environnement hors d’équilibre dans lequel le comportement dynamique des circuits génétiques peut être étudié sur de longues périodes de temps. Afin d’exploiter pleinement le dispositif microfluidique multicouches, le matériel et le logiciel ont été intégrés pour automatiser les réactions IVTT. En combinant les réactions IVTT avec la plate-forme microfluidique présentée ici, il devient possible d’analyser en profondeur les comportements de réseau complexes, en améliorant notre compréhension des mécanismes qui régulent les processus cellulaires.

Introduction

Les cellules sont capables de détecter et de répondre à leur environnement à l’aide de réseaux de réglementation dynamiques complexes1,2. Le domaine de la biologie synthétique utilise notre connaissance des composants naturels qui composent ces réseaux pour concevoir des systèmes biologiques qui peuvent étendre la fonctionnalité des cellules3,4. Inversement, il est également possible de mieux comprendre les réseaux naturels qui régissent la vie en concevant des analogues simplifiés et synthétiques des circuits existants ou en mettant en avant des systèmes biologiques qui présentent des comportements naturels. L’ingénierie de novo de ces systèmes biologiques est effectuée de façon ascendante où de nouveaux circuits génétiques ou voies de signalisation sont conçus de manière rationnelle, en utilisant des parties bien définies5,6. La combinaison de la conception rationnelle des réseaux avec la conception de systèmes biologiquement pertinents permet la caractérisation et l’étude approfondies des systèmes de régulation biologique avec différents niveaux d’abstraction7.

Les œuvres pionnières d’Elowitz et Leibler8 et Gardner etcoll. 9 ont été les premières à démontrer l’introduction réussie de réseaux génétiques synthétiques dans les hôtes cellulaires. Au cours de la décennie suivante, de nombreux chercheurs ont continué à s’appuyer sur ces premiers succès malgré l’émergence de plusieurs limitations concernant l’introduction de circuits synthétiques dans les cellules7,10,11 ,12. Idéalement, l’introduction de circuits synthétiques dans les hôtes cellulaires devrait se faire de façon modulaire. Malheureusement, la complexité de l’environnement cellulaire rend cela particulièrement difficile, avec la fonction de nombreuses pièces et réseaux étant très dépendant du contexte12,13,14. En conséquence, les réseaux éprouvent souvent des interactions indésirables avec les composants de l’hôte natif qui peuvent affecter la fonction du circuit synthétique. De même, les composants du réseau exogène peuvent inhiber les processus de l’hôte, rivaliser pour les ressources partagées au sein de l’hôte, et influencer la cinétique de croissance15,16,17. Par conséquent, afin de concevoir et de prédire rationnellement le comportement des réseaux synthétiques dans un environnement in vivo, un modèle complet de toutes les dynamiques spécifiques à l’hôte et au circuit est nécessaire18.

Une alternative viable à l’utilisation d’hôtes cellulaires pour la caractérisation des réseaux synthétiques est l’application de technologies de transcription et de traduction in vitro (IVTT). Agissant comme un banc d’essai pour les réseaux synthétiques, les réactions sont effectuées dans des solutions comprenant tous les composants nécessaires pour permettre l’expression des gènes19,20,21. De cette manière, un environnement biologiquement pertinent, quoique artificiel, est créé dans lequel les réseaux synthétiques peuvent être testés22,23,24,25,26, 27,28. Un avantage majeur de l’utilisation des solutions IVTT est la capacité d’effectuer des réactions dans des conditions spécifiées par l’utilisateur, avec des chercheurs capables d’ajuster la composition précise de chaque réaction2. En outre, l’approche sans cellules permet des tests à haut débit des réseaux synthétiques, car elle élimine la nécessité d’effectuer des étapes de clonage cellulaire qui prennent beaucoup de temps. En conséquence, la durée de la conception successive – construire – cycles d’essai est considérablement réduite29,30,31,32. Le cycle de conception peut être encore accéléré en utilisant des techniques de clonage sans cellules telles que l’assemblage Gibson pour concevoir rapidement de nouveaux réseaux, et en construisant des réseaux à partir de modèles d’ADN linéaires qui – contrairement aux plasmides requis pour les essais in vivo – peut être amplifié par des réactions en chaîne de polymérase (PCR)33,34.

Les réactions par lots sont la méthode la plus simple par laquelle les réactions IVTT peuvent être effectuées, nécessitant un seul vaisseau de réaction dans lequel tous les composants de réaction sont combinés35. De telles réactions sont suffisantes pour l’expression des protéines et les tests de circuit de base, mais s’avèrent insuffisantes lorsque l’on tente d’étudier le comportement dynamique à long terme d’un réseau. Au cours d’une réaction par lots, les réactifs sont soit épuisés, soit dégradations, ce qui entraîne une diminution continue des taux de transcription et de traduction. En outre, au fur et à mesure que les réactions progressent, les sous-produits s’accumulent qui peuvent interférer – ou inhiber complètement – le bon fonctionnement du réseau. En fin de compte, l’utilisation de réacteurs par lots limite le comportement dynamique qui peut être observé, avec une réglementation négative étant particulièrement difficile à mettre en œuvre5,36.

La polyvalence des systèmes IVTT permet de multiples méthodes alternatives par lesquelles des réactions IVTT prolongées peuvent être effectuées, allant du flux continu aux méthodes basées sur les gouttelettes ainsi que des approches de dialyse plus simples2,30, 37,38,39,40. L’application d’appareils microfluidiques offre aux utilisateurs un contrôle accru sur leurs réactions tout en augmentant le débit et en minimisant les coûts35,41,42, chaque approche spécifique ayant son propres avantages. L’utilisation du flux continu peut être facilement optimisée pour augmenter les rendements d’expression cependant, l’incapacité de supprimer efficacement les produits de réaction spécifiques rend l’étude du comportement dynamique non négligeable39. Bien que l’utilisation de systèmes microfluidiques à base de gouttelettes permet le dépistage à haut débit de nouveaux réseaux, la difficulté de fournir de nouveaux réactifs à la réaction entraîne des gouttelettes ressemblant à des réactions de lots de petit volume43. Les réacteurs à base de dialyse permettent l’introduction de réactifs frais ainsi que l’élimination de certains produits de réaction cependant, les molécules d’ARN et les protéines plus grandes s’accumulent dans le réacteur, étant trop grandes pour être diffusées à travers les pores de la membrane. En outre, de grands volumes de réactifs sont nécessaires pour soutenir ces réactions pendant de longues périodes30,44. En 2013, Maerkl et coll. ont présenté un dispositif microfluidique multicouches conçu spécifiquement pour effectuer des réactions IVTT prolongées36,45. L’utilisation d’appareils microfluidiques multicouches permet un contrôle direct sur le flux de fluide, permettant la réorientation du débit ainsi que l’isolement du fluide dans des régions spécifiques de l’appareil46,47. Ces régions isolées peuvent fonctionner comme des chambres de réaction indépendantes à l’échelle nanolitre dans laquelle des réactions IVTT peuvent être effectuées. Au cours d’une seule réaction IVTT, des injections périodiques de réactifs frais dans le réacteur sont utilisées pour reconstituer les composants IVTT et les modèles d’ADN. Simultanément, un volume égal de l’ancienne solution de réaction est déplacé, en supprimant les produits de réaction. De cette manière, un environnement hors d’équilibre est maintenu où les taux de transcription et de traduction basal restent en état stable, prolongeant la durée de vie des réactions iVTT et permettant aux comportements dynamiques riches de se produire. En appliquant cette approche, les chercheurs sont en mesure d’étudier les taux cinétiques des processus individuels se produisant dans un circuit spécifique, en aidant à l’ingénierie prospective de nouveaux réseaux génétiques. Par exemple, Niederholtmeyer et coll. ont mis en œuvre cette approche pour caractériser divers éléments d’un oscillateur d’anneau génétique, en déterminant les taux cinétiques de36. Dans d’autres études, Yelleswarapu et coll. ont montré que les taux cinétiques du facteur sigma 28(28) déterminés dans des conditions de lots étaient insuffisants pour décrire le comportement d’un oscillateur basé sur28et que l’ajout de données basées sur le flux prévisions de modèle améliorées du comportement du réseau22.

L’objectif de ce manuscrit est de présenter un protocole complet pour la fabrication d’appareils microfluidiques multicouches capables d’effectuer des réactions IVTT à long terme. En outre, ce manuscrit décrira tout le matériel et le logiciel nécessaires pour effectuer des réactions prolongées IVTT. L’actionnement du dispositif microfluidique – nécessaire pour contrôler le flux de fluides qui s’y trouve – est réalisé à l’aide d’une série de valves pneumatiques qui se connectent directement aux dispositifs microfluidiques par l’intermédiaire de longueurs de tubes. À leur tour, les vannes pneumatiques sont contrôlées via une interface de contrôle virtuelle sur mesure. L’écoulement des fluides à l’intérieur des dispositifs microfluidiques est réalisé à l’aide d’une pression continue qui est fournie par un système de régulation de la pression disponible dans le commerce. Les réactions IVTT sont généralement effectuées entre 29 et 37 oC et un incubateur de microscope est utilisé pour réguler la température pendant les réactions. Cependant, la fonctionnalité du mélange IVTT se dégrade progressivement lorsqu’elle est stockée au-dessus de 4 oC. En tant que tel, ce manuscrit s’étendra sur le système de refroidissement hors puce utilisé pour refroidir le mélange IVTT avant l’injection dans le dispositif microfluidique. En conclusion, ce manuscrit fournit un aperçu complet des procédures requises pour effectuer avec succès des réactions IVTT prolongées à l’aide d’un réacteur à débit microfluidique de sorte que d’autres chercheurs seront en mesure de reproduire cette technologie avec des aisance.

Protocol

1. Préparation wafer REMARQUE : Nos protocoles sont spécifiques pour le photoresist positif 40 XT et le photoresist négatif SU8 3050 utilisés lors de cette recherche. Des photorésistants alternatifs peuvent être utilisés, mais les vitesses de rotation spécifiques, les températures de cuisson et les temps de cuisson varient. La conception de l’appareil microfluidique fournie par Niederholtmeyer et coll.36 est liée à la Table des Matériaux. Placer deux gaufrettes de silicium propres (100 mm de diamètre, 1-0-0-gt; orientées, 525 ‘m d’épaisseur) dans un four préchauffé réglé à 250 oC et laisser les gaufrettes se déshydrater pendant la nuit (16 h).REMARQUE : Il est également possible d’amorcer les gaufrettes à l’aide du dépôt de vapeur HMDS; cependant, ce n’est pas nécessaire si les gaufrettes sont suffisamment déshydratées. Retirer une plaquette de silicium du four et laisser refroidir à température ambiante avant de procéder à la rotation du revêtement. Appliquer 3-4 ml du photoresist 40 XT au centre de la plaquette. Pour obtenir une hauteur de 25 m, appliquez le protocole de spin suivant : tourner pour 20 s à 500 tr/min (110 tr/min/s), augmenter la vitesse de rotation à 3100 tr/min (300 tr/min) et tenir ici pendant 30 s, et décélérer la plaquette à 0 tr/min avec une décélération de 200 tr/min/s. Utilisation d’un Tissu de microfibre enlève soigneusement n’importe quelle perle de bord qui a pu s’être produite pendant le revêtement de rotation. Cuire au four doux à l’aide de deux plaques chaudes séparées fixées à 70 oC et 120 oC de la manière suivante : laisser reposer la plaquette à 70 oC pendant 30 s. Transférer ensuite la plaque chauffante sur la plaque chauffante de 120 oC et laisser reposer ici pendant 3,5 min avant de remettre la plaque chauffante de 70 oC pour une autre plaque chauffante. Retirez la plaque chauffante et, évitant les chocs de température soudains, laissez-la refroidir à température ambiante. Placez le photomasque de couche d’écoulement (côté émulsion vers le bas) sur le film photorésistant et exposez la plaquette à l’aide d’une lampe UV jusqu’à ce qu’une exposition totale de 200 mJ/cm2 soit atteinte. Cuire au four après l’exposition à l’aide de deux plaques chaudes (70 oC et 105 oC) de la manière suivante : laisser reposer la plaquette à 70 oC pendant 20 s avant de transférer la plaquette sur la plaque chauffante de 105 oC et de la laisser ici pendant 40 s. Enfin, retournez la plaquette sur la plaque chauffante de 70 oC pendant 20 s supplémentaires pour terminer la cuisson après l’exposition. Laisser refroidir la plaquette à température ambiante sur une pile de tissus en microfibre. Développez la plaquette en la transférant dans un plat Petri rempli de 726 mIF photoresist développeur pour commencer le processus de développement. Le développement est accéléré lorsqu’il est effectué sur un shaker de banc et la plaquette entière est submergée dans le développeur. Rincez la plaquette à l’eau déminéralisée et utilisez un microscope stéréo pour vérifier la surface de la plaquette pour décevoir tout résidu de photorésistance. Si des résidus de photoresist peuvent être vus, retournez la plaquette au développeur. Reflux de la photoresist positive en plaçant la plaquette sur une plaque chaude fixée à 110 oC pendant 25 min. Ce processus se traduira par des caractéristiques arrondies ainsi que l’annexion des fissures qui peuvent avoir paru au cours du processus de fabrication. Procédez à silaniser la plaquette telle que décrite à l’étape 1.17. Retirer la deuxième plaquette de silicium du four, ce qui lui permet de refroidir à température ambiante avant de procéder à la rotation du revêtement. Appliquer 5 ml de su8 3050 photoresist au centre de la plaquette. Pour obtenir une hauteur de 30 m, appliquez le protocole de spin suivant : tourner pour 20 s à 500 tr/min (110 tr/s), augmenter la vitesse de rotation à 4 000 tr/min (330 tr/min/s) et tenir ici pour 42 s, et décélérer la plaquette à 0 tr/min avec une décélération de 200 tr/min/s. Utilisation d’un Tissu de microfibre enlève soigneusement n’importe quelle perle de bord qui a pu s’être produite pendant le revêtement de rotation. Cuire au four à l’aide de deux plaques chaudes séparées (65 oC et 95 oC) de la manière suivante : laisser reposer la plaquette à 65 oC pendant 30 s. Transférer ensuite la plaque chauffante sur la plaque chauffante de 95 oC et laisser reposer ici pendant 14 min avant de remettre la plaque chauffante de 65 oC pour une autre plaque chauffante de 30 s. Retirez la plaque chauffante et laissez-la refroidir à température ambiante. Mesurez l’intensité de la lampe UV avant l’exposition et utilisez-la pour déterminer la durée d’exposition requise pour obtenir une dose totale d’exposition de 260 mJ/cm2. Placez le photomasque (côté émulsion vers le bas) sur le film photorésistant et placez la plaquette sous la source de lumière UV. Exposer la plaquette à l’aide d’une lampe UV jusqu’à ce qu’une exposition totale de 260 mJ/cm2 soit atteinte. Cuire au four après l’exposition à l’aide de deux plaques chaudes (65 oC et 95 oC) de la manière suivante : laisser reposer la plaque chauffante à 65 oC pendant 60 s avant de transférer la plaque chauffante sur la plaque chauffante de 95 oC et de la laisser ici pendant 4,5 min. Remettre la plaque chauffante à la plaque chauffante de 65 oC pendant 30 s supplémentaires. pour terminer la cuisson après l’exposition. Laisser refroidir la plaquette à température ambiante sur une pile de tissus en microfibre. Développer la plaquette en le transférant à un plat Petri rempli de mrDev-600 photodeveloper pour commencer le processus de développement. Le développement est accéléré lorsqu’il est effectué sur un shaker de banc et la plaquette entière est submergée dans le développeur. Rincez la plaquette à l’isopropanol et utilisez un microscope stéréo pour vérifier la surface de la plaquette pour décevoir tout résidu de photorésistance. Si des résidus de photoresist peuvent être vus, retournez la plaquette au développeur. Une fois complètement développé, cuire dur le photoresist en plaçant la plaquette sur une plaque chaude fixée à 150 oC pendant 1 h. Silanize les deux gaufrettes pour empêcher l’adhérence de PDMS pendant les processus de soft-lithography. Pour effectuer la silanisation, pipet 2-3 gouttelettes (par plaquette) de la silane dans un petit flacon de verre. Placez cette fiole, avec les gaufrettes dans un dessiccateur et tirez le vide pendant 5-10 min. Sceller le dessiccateur et laisser les gaufrettes sous vide pendant une période de 12 à 16 h.CAUTION: Le silane est toxique et ne doit pas être inhalé. Prenez soin de travailler dans une hotte de fumée et de porter des gants nitriles lors de la manipulation de la sélane. Cela comprend le placement de la pompe à vide dans le capot de fumée lors de la traction sous vide sur le dessiccateur. Relâchez le vide du dessiccateur et retirez les gaufrettes silanisées. Rincer à l’eau et utiliser une vapeur de N2 pour sécher les gaufrettes. À ce stade, les gaufrettes peuvent être placées dans le stockage jusqu’à ce que nécessaire. 2. Fabrication d’appareils microfluidiques REMARQUE : Le processus de lithographie souple utilisé pour fabriquer des dispositifs microfluidiques multicouches à base de PDMS peut être séparé en trois étapes distinctes : 1) La préparation PDMS des couches de débit et de contrôle, 2) L’alignement et la liaison des deux couches DeMD, 3) Le l’achèvement de l’appareil. Préparation PDMS Préparer deux solutions précurseurs PDMS en combinant la base et les agents de durcissement dans un bécher en plastique et à l’aide d’une tige de mélange pour remuer les deux composants jusqu’à ce qu’ils soient entièrement mélangés. La couche de contrôle nécessite 20 g d’agent de base et 1 g d’agent de durcissement (rapport de 20:1). La couche d’écoulement nécessite 40 g de l’agent de base et 8 g de l’agent de durcissement (rapport de 5:1). Dégazer les solutions dans un dessiccateur. Placer la plaquette de couche d’écoulement dans un plat Petri et verser le mélange De PDMS de rapport 5:1 sur la plaquette. Degas le PDMS pendant 30 min pour enlever les bulles d’air. Enrober la plaquette de couche de commande (préparée à l’aide du SU8 3050photoresist négatif) avec un pDMS ratio 20:1. Verser 5-10 ml du PDMS sur le centre de la plaquette et exécuter le protocole de spin suivant (conserver la gauche sur PDMS pour une utilisation ultérieure): spin à 500 tr/min pour 15 s (100 tr/s), augmenter la vitesse de rotation à 1450 tr/min (300 tr/min/s) pour 45 s , puis décélérer la plaquette à 0 tr/min (200 tr/min/s). Pour assurer l’épaisseur homogène du film PDMS, placez la plaquette enduite PDMS sur une surface plane dans un plat Petri fermé (pour éviter la contamination par la poussière). Laisser la plaquette s’asseoir pendant 30 min. Retirez la couche d’écoulement du dessiccateur et placez les couches d’écoulement et de commande dans un four (80 oC). Cure les deux couches pendant 28-30 min et retirez lorsque le PDMS est assez malléable pour manipuler, tout en restant légèrement collant. Procédez immédiatement au processus d’alignement. Alignement et collage À l’aide d’un scalpel, retirer chacun des quatre appareils du PDMS sur la plaquette de couche d’écoulement. En enlevant la couche de PDMS de la plaquette de silicium, recouvrez immédiatement le côté de dispositif avec le ruban de scotch pour éviter la contamination de particule de poussière. Alignez grossièrement les blocs de couche d’écoulement sur la couche de commande par l’œil, plaçant le côté caractéristique de l’appareil en contact avec la couche de contrôle PDMS. Par la suite, effectuer des ajustements fins à la position de chacun des blocs de couche d’écoulement pour aligner les canaux de la couche d’écoulement avec les canaux de la couche de contrôle, à l’aide d’un microscope stéréo pour faciliter la visualisation des ajustements. Appliquer une pression pour enlever les poches d’air entre les deux couches PDMS. Versez les 20:1 rapports Restants PDMS enregistrés plus tôt autour des blocs de couche de débit alignés. Placez des poids de 100 g sur chacun des appareils afin d’assurer un contact suffisant pendant le processus de liaison. Remettre les appareils alignés (y compris les poids) au four de 80 oC et les laisser se lier pendant au moins 1,5 h et pas plus de 6 h. Finition de l’appareil Retirez la plaquette du four et extrayez chacun des appareils individuels de la plaquette de la couche de contrôle, en couvrant le côté caractéristique de chaque appareil avec du ruban adhésif scotch. Itérativement, percer un seul trou pour chacune des 9 entrées de couche d’écoulement, 24 entrées de canal de couche de commande, et la sortie de couche d’écoulement unique de chaque dispositif. Perforez l’appareil avec le côté de la fonction vers le haut, à l’aide d’une caméra pour s’assurer que les trous sont percés dans les limites des entités. Pour chaque appareil, nettoyez une seule lame de microscope avec l’isopropanol et l’acétone et séchez les diapositives sous un flux de N2. Par la suite, placez les lames de microscope sur une plaque chaude fixée à 150 oC pendant 15 min. Utilisez le plasma d’oxygène ashing pour lier les dispositifs PDMS aux glissières de verre, en appliquant une puissance d’ashing de 50 W pour 45 s. Assurez-vous que le côté de dispositif de dispositif est orienté vers le haut en ashing. Une fois terminé, placez le côté fonction de l’appareil vers le bas sur la glissière de verre, en appliquant une pression pour enlever le gaz emprisonné entre les surfaces. Placez les dispositifs collés sur une plaque chauffante fixée à 110 oC pendant 1 h. Les poids peuvent être placés sur les appareils pour améliorer l’adhérence de l’appareil. 3. Configuration matérielle REMARQUE : Pour maîtriser les puces microfluidiques, de nombreux éléments matériels doivent être installés et connectés les uns aux autres. Trois groupes distincts de matériel sont nécessaires : 1) Système de contrôle pneumatique pour les canaux de commande, 2) Régulateur de pression pneumatique pour contrôler le flux des réactifs de réaction à l’intérieur de l’appareil, et 3) Un système de refroidissement pour refroidir la solution de réaction IVTT avant l’injection dans le dispositif microfluidique. Un aperçu de la configuration matérielle est fourni à la figure 1. Il convient de noter que les protocoles fournis ici tentent d’être aussi généraux que possible, mais certaines pièces d’équipement spécifiques utilisées tout au long de notre recherche sont référencées. Tout le matériel peut être remplacé par des alternatives capables d’effectuer la même fonction. Dans de tels cas, les protocoles ici peuvent être utilisés pour décrire les étapes générales nécessaires à la mise en place du système et les exigences de chacun des composants. Les configurations matérielles alternatives sont présentées par Brower et coll.48 et White and Streets49. Système de contrôle pneumatique (voir Figure 2) À l’aide du protocole des fabricants, établir une connexion TCP entre le contrôleur de fieldbus et le poste de travail de l’utilisateur. Utilisez un logiciel de contrôle (fourni sous forme de fichiers supplémentaires) pour composer les commandes MODBUS qui sont envoyées via la connexion TCP au contrôleur, et actionner les valves solénoïdes. Élargissez le contrôleur fieldbus avec huit modules de sortie numérique à 4 canaux, un pour chaque valve solénoïde utilisée. Chaque soupape solénoïde préside à une goupille de raccordement. Connectez le fil positif à l’un des quatre extrants positifs sur l’un des modules de sortie numérique tout en connectant le fil négatif à l’un des ports au sol des modules de sortie numérique.REMARQUE : Pour que le système fonctionne correctement, les solénoïdes doivent être connectés systématiquement, le premier solénoïde étant connecté au premier port de sortie, le deuxième solénoïde au deuxième port de sortie et ainsi de suite. Dans notre système, deux panneaux de valve sont utilisés avec 8 et 22 valves solénoïdes respectivement. Les ports de sortie 1-8 se connectent au réseau à 8 soupapes, et les ports de sortie 9-30 se connectent au réseau de 22 soupapes. Connectez les deux panneaux de soupape à une source d’air comprimé à l’aide d’un tube d’un demi-temps. Utilisez des régulateurs de pression pour définir la pression du tableau de 22 soupapes à 3 barres, et le tableau à 8 soupapes à 1 barre. Régulation de la pression de débit (voir figure 3)REMARQUE : Pour émettre des fluides à travers la couche d’écoulement de l’appareil microfluidique, un régulateur de pression à 4 ports disponible dans le commerce est utilisé. La pression de sortie de chaque port est régulée par un logiciel fourni avec le contrôleur de pression. Connectez le régulateur de pression à un ordinateur à l’aide du connecteur USB fourni. Connectez le régulateur de pression à une source d’air comprimé, en veillant à ce que la pression fournie ne dépasse pas la pression maximale autorisée par le régulateur. Connectez un Luer mâle à un connecteur de barbe de 3/32 po à chacun des quatre ports de sortie de verrouillage Luer femelles du régulateur de pression. Connectez une longueur de tubes souples (OD: 3 mm, ID: 1 mm, L: 10 cm) à la barbe. Connectez un deuxième Mâle Luer au connecteur de barbe de 3/32 po à l’extrémité ouverte du tube mou et attachez-le aux ports de connecteur de réservoir de fluide. Utilisez le logiciel fourni pour définir la pression souhaitée de chaque prise du régulateur de débit, en faisant pression sur les réactifs stockés dans les réservoirs pour entraîner l’écoulement des réactifs dans le dispositif microfluidique. La connexion des réservoirs au dispositif microfluidique sera discutée dans la section 4.2. Configuration de refroidissement Hors-Chip (voir Figure 4) Utilisez des tubes en PVC (OD : 10 mm, ID : 6 mm) pour connecter le système de refroidissement à l’eau au bloc d’eau à plaque froide à l’aide de raccords de compression. Remplissez le réservoir de liquide du système de refroidissement à l’eau avec un liquide de refroidissement et inclinez doucement l’appareil pour déplacer tout air emprisonné, ajoutant continuellement du liquide de refroidissement au réservoir pour s’assurer qu’il reste plein. Lorsque tout le gaz est retiré du système, remplissez le réservoir à environ 90-95% de son volume maximal. Tube PTFE en coil (OD: 0.042″, ID: 0.022″) sur la face froide de l’élément Peltier et le fixer avec du ruban adhésif. Assurez-vous qu’une extrémité du tube PTFE est reliée aux réservoirs du système de contrôle de la pression de la couche d’écoulement (tel que décrit à la section 4.3). L’autre extrémité du tube PTFE ne doit pas dépasser 1 cm de la surface de Peltier. Insérer une longueur de 5 à 10 cm de tube PEEK (OD : 0,794 mm, ID : 0,127 mm) dans l’extrémité saillante du tube PTFE. Le remplissage du tube et la connexion au dispositif microfluidique sont expliqués à la section 4.3. Placez la face chaude de l’élément Peltier sur la plaque froide du bloc d’eau, en appliquant suffisamment de composé thermique sur les deux faces. Assurez-vous que le tube, l’élément Peltier et le bloc de refroidissement sont en contact direct les uns avec les autres en tout temps. Connectez l’élément Peltier au contrôleur de température (via un connecteur d’autobus en série), de sorte que la tension fournie au Peltier peut être réglée. Placez solidement un thermistor sur la surface de Peltier, reliant la sortie au contrôleur de température. Après avoir allumé le refroidisseur d’eau, adaptez la tension fournie au Peltier jusqu’à ce que la température soit stable à 4 oC.REMARQUE : Avec cette configuration, la température peltier est contrôlée manuellement en adaptant la tension fournie, tandis que le thermistor ne sert qu’à surveiller la température. 4. Préparation d’une expérience REMARQUE : Avant de commencer une expérience, le dispositif microfluidique doit être préparé, et les réactifs de réaction doivent être insérés dans le tube correct pour l’injection dans l’appareil. Cette section portera sur : 1) La connexion des tubes de canal de contrôle à l’appareil, 2) La connexion des réactifs d’entrée non refroidis à l’appareil, et 3) La connexion des réactifs d’entrée refroidis à l’appareil. Connexion du tube du canal de commande Pour chacun des canaux de contrôle de l’appareil microfluidique, coupez une longueur de tuyauterie (OD : 0,06 », ID : 0,02). À une extrémité, insérez la goupille d’un talon Luer de 23 G, 1/2 po et à l’autre, insérez une goupille de raccordement en acier inoxydable (OD : 0,65 mm, ID : 0,35 mm, L : 8 mm). Connectez le talon Luer à un Luer mâle à un connecteur en nylon barb 3/32. Insérer la barbe du connecteur dans une longueur de tube en polyuréthane (OD: 4 mm, ID: 2,5 mm). Insérez ce tube de polyuréthane directement dans l’une des valves solénoïdes. Fixez un talon Luer de 23 G, 1/2 po à une seringue et insérez-le dans un petit morceau de tube (3-4 cm) (OD : 0,06», ID : 0,02 po). Placez l’extrémité ouverte de cette tubulure dans un réservoir d’eau ultrapure et remplissez la seringue d’eau ultrapure. Numérodez chaque canal de commande de l’appareil microfluidique comme indiqué dans la figure 5. Pour chaque canal (à l’exclusion des canaux de contrôle 1 à 3, qui ne sont pas remplis d’eau), trouver le tube correspondant (connecté aux valves solénoïdes) et insérer une goupille métallique dans l’extrémité ouverte de la tuyauterie attachée à la seringue. Injecter de l’eau dans le tube du canal de commande jusqu’à ce que la moitié de la longueur ait été remplie. Débranchez le tube de la seringue et insérez la goupille de connecteur en acier inoxydable dans le trou correspondant de l’appareil microfluidique. Répétez l’opération pour tous les canaux de contrôle. Utilisez l’interface de commande pour ouvrir toutes les valves solénoïdes. Ceci pressurisera le fluide dans le tube de canal de commande, le forçant dans le dispositif microfluidique et fermant toutes les valves basées de membrane dans l’appareil. Un exemple de membranes ouvertes et fermées à l’intérieur de l’appareil est donné dans la figure 6. Connexion de réactifs non refroidis à l’appareil Pour chacun des réactifs non refroidis, coupez une longueur de tuyauterie (OD : 0,06 », ID : 0,02 po) pour connecter la sortie du réservoir aux entrées de l’appareil microfluidique. Prenez une extrémité de la tuyauterie et insérez-la dans le réservoir, en veillant à ce que la tuyauterie atteigne la base du réservoir. La sortie de tuyauterie du réservoir doit être resserrée de sorte qu’un joint étanche à l’air soit atteint. Insérer une goupille de connexion en acier inoxydable (OD: 0.65 mm, ID: 0.35 mm, L: 8 mm) dans l’extrémité ouverte du tube. Fixer un talon Luer de 23 G, 1/2 po à l’extrémité d’une petite seringue (1 ml). Ajouter une courte longueur de tuyauterie (OD: 0.06″, ID: 0.02″) au talon Luer. En plaçant l’extrémité de la tuyauterie dans la solution de réactif désirée, remplissez la seringue avec le réactif. Insérez la goupille de connecteur en acier inoxydable dans le tube en polyuréthane relié à la seringue et remplissez le tube avec le réactif. Lors de l’utilisation de petits volumes de réaction, le réactif n’entrera pas dans le réservoir, et le tube lui-même agira comme réservoir. Débranchez la seringue et insérez la goupille de connecteur dans l’un des trous d’entrée de couche d’écoulement de l’appareil microfluidique. Appliquer une pression sur chacun des réservoirs à l’aide du logiciel de régulateur de pression pour forcer les réactifs dans le dispositif microfluidique. Connexion des fluides refroidis à l’appareil microfluidique Assurez-vous que le refroidisseur d’eau et l’élément Peltier ont été allumés, avec la température de surface du Peltier fixée à 4 oC. Montez la configuration de refroidissement aussi près que possible de l’appareil microfluidique, en minimisant le volume non refroidi entre le Peltier et l’inlet de l’appareil. Connectez l’extrémité ouverte du tube PTFE à un tube relié à l’un des réservoirs de fluides (tel que décrit dans la section 4.2) à l’aide d’une goupille de connecteur en acier inoxydable (OD : 0,65 mm, ID : 0,35 mm, L : 8 mm). Connectez une petite seringue (1 ml) à un talon Luer (23 G, 1/2″) avec une courte longueur de tube (OD: 0.06″, ID: 0.02″) attaché à la fin. Remplissez la seringue avec le réactif à refroidir (ici, la solution de réaction IVTT). Connectez le tube PEEK à la seringue par l’intermédiaire du tube conjonctif et appliquez une pression constante sur la seringue, forçant le réactif à travers le tube PEEK et dans le tube PTFE. Débranchez le tube PEEK de la seringue et insérez-le directement dans l’une des entrées du canal d’écoulement de l’appareil microfluidique. Lorsque la pression est appliquée via le logiciel de régulateur de pression, le réactif refroidi sera forcé dans le dispositif microfluidique. 5. Expérimentation REMARQUE : Avant d’effectuer des expériences, toutes les connexions matérielles et tubing détaillées dans les sections 3 et 4 des protocoles doivent être terminées, et tous les réactifs doivent être connectés à l’appareil. La procédure expérimentale peut ensuite être divisée en quatre parties distinctes : 1) Le chargement de l’appareil microfluidique, 2) La préparation du microscope, 3) l’étalonnage de l’appareil, et 4) l’exécution de l’expérience. L’interface de contrôle virtuelle personnalisée (voir Figure 7) utilisée tout au long de cette recherche est fournie comme ressource supplémentaire via la liste des matériaux) Chargement de l’appareil microfluidique Placez le dispositif microfluidique, avec tous les tubes de couche de commande et d’écoulement attachés dans le stade de microscope et fermez toutes les ouvertures sur l’incubateur. Fixer la température ambiante de l’incubateur à 29 oC. Assurez-vous que le système de refroidissement a été allumé et est réglé à 4 oC avant de lancer l’expérience. Assurez-vous que tous les canaux de débit et de contrôle sont pressurisés. Définir la pression des canaux de contrôle 1-3 à 1 barre, et pressuriser les canaux de contrôle 9-29 à 3 barres. Les réactifs nécessitent une pression comprise entre 20 et 100 mbar pour être appliqués sur les réservoirs de fluide s’appuyant sur le logiciel de régulateur de pression. Retirez l’air de l’appareil microfluidique à l’aide d’un des réactifs. Fermez la sortie de l’appareil (pressuriser le canal de commande 29) et dépressuriser simultanément les canaux de commande 1-3 et 15-28. Ensuite, dépressuriser sélectivement les canaux de contrôle du multiplexeur pour permettre au réactif sélectionné de s’écouler dans l’appareil. Utilisez le microscope pour surveiller l’enlèvement de l’air.REMARQUE : Dans le cas où les réactifs ne se chargent pas correctement dans l’appareil ou que les bulles d’air ne sont pas enlevées, la pression peut être augmentée jusqu’à 350 mbar. Assurez-vous que tous les réactifs circulent correctement, sans introduire d’air – en utilisant la fonction Flush dans le logiciel de contrôle. La surveillance du flux de fluide peut être simplifiée en chargeant d’abord un fluorophore et en surveillant son déplacement par des réactifs individuels. Préparation du microscope À l’aide du microscope, localisez tous les points d’intérêt (un seul point dans chaque réacteur est suffisant) à l’intérieur du dispositif microfluidique, et stockez les coordonnées de celui-ci. Ces points seront représentés lors de l’étalonnage et des processus expérimentaux.REMARQUE : Pendant l’étalonnage et les procédures expérimentales incluses dans le logiciel de contrôle, le microscope est chargé de capturer périodiquement des images aux coordonnées précédemment stockées. Pour ce faire, le logiciel de contrôle communique avec le logiciel de microscope, l’informant d’enregistrer de nouvelles images. Cette communication est unique à chaque configuration de microscope, et en tant que telle cette fonctionnalité a été modifiée dans l’interface logicielle fournie. Fourni est un factice exécutable, qui peut être modifié par l’utilisateur final pour la compatibilité avec leur propre système de microscope. Calibrage de l’appareil microfluidique Déterminer le volume de fluide déplacé de chaque réacteur au cours d’une seule étape d’entrée (séquence de pompe fournie par les canaux de commande actionnement péristaltiquement 15-17, comprenant 6 commandes MODBUS exécutées de façon séquentielle), en exécutant le protocole d’étalonnage fourni dans le logiciel. Définir les champs de données suivants dans le logiciel de contrôle : Elution Buffer Channel, Fluorophore Channel, Nombre de cycles de dilution (par défaut est de 10 dilutions), Nombre d’étapes d’entrée (par défaut 15 étapes), Nombre de cycles de mélange (par défaut est de 4 cycles), et le temps entre les cycles de mixage (par défaut est de 0 secondes). Initier l’étalonnage en appuyant sur Perform Calibration Experiment.REMARQUE : Pendant le processus d’étalonnage, tous les réacteurs sont remplis d’un fluorophore et des images sont enregistrées. Par la suite, une série de dilutions sont effectuées lorsqu’une élude est mesurée dans les réacteurs (en fonction du nombre fixé d’étapes d’entrée), déplaçant ainsi le fluorophore. Après un bon mélange, de nouvelles images sont prises. Ce processus se répète pour le nombre de cycles de dilutionensemble . À la fin de l’étalonnage, suivez les étapes présentées par le logiciel de contrôle, complétant l’analyse de l’expérience d’étalonnage.REMARQUE : L’analyse fournira aux utilisateurs le ratio de rafraîchissement pour chaque réacteur en fonction de la diminution de fluorescence enregistrée au cours de chaque cyclede dilution. Cette valeur indique la fraction du volume du réacteur déplacée par le nombre d’étapes d’entrée. À son tour, cette valeur sera utilisée lors d’expériences pour déterminer combien d’étapes d’entrée sont nécessaires pour déplacer un volume de réacteur spécifique. Exécution de l’expérience Définir les valeurs requises pour l’expérience souhaitée dans l’interface de contrôle virtuelle. Critique est la fraction de rafraîchissement [%] qui détermine le volume du réacteur déplacé par cycle expérimental et doit être fixé entre 15 et 40%.REMARQUE : Le protocole expérimental spécifique déterminera quels champs de l’interface de contrôle doivent être réglés avant le lancement de l’expérience. Un codage mineur sera nécessaire pour adapter l’interface de contrôle pour de nouvelles expériences. Lancez le protocole expérimental en appuyant sur le bouton Perform Experiment dans l’interface de contrôle.REMARQUE : Inaltéré, le logiciel fourni initie une simple expression protéique. Les réacteurs 1 et 8 sont utilisés comme commandes, tandis que les réacteurs 2-7 abritent des expériences identiques. Ici, 75% du volume du réacteur comprend la solution IVTT, et 25% est soit de l’eau ultrapure, soit une solution d’ADN linéaire de 2,5 nM. Les dilutions se produisent toutes les 15 minutes, 30 % du volume du réacteur étant déplacé par dilution. Les images sont enregistrées à la fin de chaque cycle de dilution. 6. Analyse des données REMARQUE : Des scripts ont été fournis pour l’analyse des images (voir les fichiers complémentaires ou le Tableau des matériaux),en faisant usage du paquet d’analyse «bfopen», qui est nécessaire pour l’examen des fichiers’.nd2′(fournis par notre microscope). Exécutez le script d’analyse ‘calibrationScript.m’ et une fois invité sélectionnez le fichier’.nd2’souhaité. Une seule image de réacteur sera montrée avec laquelle l’intensité d’image correcte peut être déterminée. Utilisez le curseur pour optimiser l’intensité de l’image de telle sorte que les bords du canal microfluidique sont clairement visibles. Une image du réacteur sera montrée. Dans cette image, sélectionnez une zone à l’intérieur du canal du réacteur dont l’intensité de fluorescence doit être déterminée.REMARQUE : L’intensité de fluorescence de chaque réacteur, pour chaque image enregistrée, sera déterminée avec les résultats affichés dans une parcelle simple, permettant la visualisation des résultats.

Representative Results

Pour démontrer l’efficacité de la plate-forme microfluidique multicouche pour la conduction des expériences IVTT, la configuration décrite a été utilisée pour exprimer la protéine deGFP. L’expérience a été menée dans un mélange de30 réactions IVTT disponible dans le commerce – comprenant toutes les composantes nécessaires de transcription et de traduction – complétées par des substrats de réaction et des modèles d’ADN. Des expériences ont été menées à une température de 29 oC; une température jugée optimale pour l’expression IVTT des protéines. Le dispositif microfluidique possède neuf entrées uniques, dont quatre ont été utilisées au cours de cette expérience. Le premier contenait le mélange de réaction IVTT obtenu commercialement. Le mélange de réaction IVTT s’adapte à tous les composants nécessaires pour exprimer avec succès les protéines cependant, GamS purifié a été ajouté au mélange de réaction – à une concentration finale de 1,3 M – avant le chargement dans le dispositif microfluidique. L’ajout de la protéine GamS sert à minimiser la dégradation des espèces d’ADN linéaire lors de l’exécution des expériences. Essentiellement, le mélange IVTT a été injecté dans le polytétrafluoroéthylène (PTFE) tube enroulé sur un élément Peltier avec une température de surface de 4 oC pour refroidir la solution avant l’injection de celui-ci dans le dispositif microfluidique; la dégradation de la solution de réaction avant son utilisation. Le tube de cétone d’éther de polyéther de micro-bore (PEEK) a été employé pour relier le tube de PTFE laissant la surface d’élément de Peltier avec le dispositif microfluidique, réduisant le volume du mélange de réaction d’IVTT ne refroidissant pas. La deuxième solution insérée dans l’appareil contenait le codage linéaire du modèle d’ADN pour le deGFP – dissous dans de l’eau ultrapure – à une concentration de 10 nM. La troisième solution, l’eau ultrapure, a servi à plusieurs fins au cours des procédures expérimentales. Principalement, l’eau ultrapure a été utilisée pour s’assurer que le volume déplacé par dilution était égal pour tous les réacteurs, agissant comme un remplacement de l’ADN dans les réactions de contrôle. En outre, l’eau ultrapure a également été utilisée pour diluer le fluorophore pendant l’étalonnage de l’appareil et pour rincer le volume mort de l’appareil lors de la commutation entre réactifs. La solution finale insérée dans l’appareil était une solution FITC-dextran purifiée (25 M) nécessaire pour effectuer l’étalonnage initial de l’appareil. Les solutions d’ADN, d’eau et de fluorophore ont été injectées dans des tubes (0,02″ ID, 0,06″ OD) qui pourraient ensuite être insérés dans l’un des canaux d’entrée du dispositif microfluidique selon la section 4.2 des protocoles. En tant que tel, ces solutions ont été stockées à 29 oC pour l’ensemble des expériences. L’actionnement des canaux de contrôle de l’appareil microfluidique est réalisé par le biais d’un logiciel de contrôle personnalisé où chacun des canaux de contrôle peut être actionné individuellement. L’exécution de réactions IVTT prolongées ne peut pas être réalisée via ce processus manuel et nécessite l’utilisation de protocoles automatisés incorporés dans le logiciel de contrôle. Lors de la préparation d’un dispositif microfluidique pour des expériences, des protocoles automatisés similaires peuvent être utilisés pour exécuter un certain nombre de processus utiles: le rinçage du volume mort de l’appareil avec un nouveau réactif, le mélange des réactifs dans le réacteur à anneaux, et le chargement de un nouveau réactif dans le réacteur tout en déplaçant un volume égal de la solution actuelle. En outre, deux processus complexes sont disponibles : la conduction d’un calibrage de dispositif, et l’exécution d’une expression de protéine cell-free prolongée. Tous les processus susmentionnés peuvent être facilement exécutés à partir de l’interface principale, en plus de la possibilité de configurer plusieurs paramètres pour varier des paramètres de processus spécifiques tels que le canal d’entrée, le volume d’entrée et la durée de mixage. En raison des fluctuations de pression et des imperfections lors de la fabrication d’appareils microfluidiques, le volume de liquide déplacé au cours d’un seul cycle d’injection peut varier d’un appareil à l’autre. En tant que tel, avant d’effectuer des expériences IVTT, le volume du réacteur déplacé par cycle d’injection (Refresh Fraction) a été déterminé. Cet étalonnage nécessite le remplissage des huit réacteurs avec une solution de référence fluorescente. Dans ce cas, une solution FITC-dextran purifiée (25 M) a été utilisée. Par la suite, les réacteurs sont dilués 10 fois avec de l’eau ultrapure. En mesurant la diminution de la fluorescence par cycle de dilution pour chaque réacteur, le volume de fluide déplacé au cours d’un seul cycle d’injection a été déterminé. Dans le logiciel de contrôle, cette valeur (le Ratio De rafraîchissement) a été enregistrée pour une utilisation pendant l’expérience IVTT. Essentiellement, pour tenir compte des variations du débit à travers l’appareil, ainsi que des écarts dans les volumes individuels du réacteur, le ratio de rafraîchissement est déterminé et stocké pour chaque réacteur individuel. La séquence de remplissage et de dilution des réacteurs a été effectuée automatiquement à l’aide du programme de calibrage de performance qui fait partie du logiciel de contrôle. Les résultats de l’expérience d’étalonnage sont présentés à la figure 8. Le processus préprogrammé le plus complexe exécute une expérience IVTT de longue durée, permettant aux utilisateurs d’initier l’expérience et de lui permettre par la suite de fonctionner sans surveillance jusqu’à l’achèvement. Tout au long de l’expérience, les réacteurs 1 et 5 ont été utilisés comme blancs, avec seulement de l’eau ajoutée aux réacteurs pendant les dilutions. Les réacteurs 2 et 6 ont été utilisés comme contrôles négatifs et ne contenaient que la solution de réaction IVTT et de l’eau ultrapure. Les réacteurs restants (3, 4, 7 et 8) contenaient les solutions de réaction IVTT et 2,5 nM de codage linéaire de l’ADN pour le gène deGFP. L’initialisation des réacteurs est réalisée en remplissant entièrement tous les réacteurs (à l’exclusion de 1 et 5) avec la solution de réaction IVTT, avant que 25% du volume du réacteur ne soit déplacé avec de l’eau ultrapure. Par la suite, l’injection périodique de réactifs dans les réacteurs a été lancée. L’expérience a été menée de telle sorte que de nouveaux réactifs ont été injectés dans les réacteurs toutes les 14,7 minutes, 30 % du volume du réacteur étant déplacé pendant chaque cycle de dilution. La composition de chaque injection était telle que 75 % du liquide injecté comprenait une solution IVTT fraîche, tandis que les 25 % restants étaient constitués d’ADN ou d’eau ultrapure. Après chaque injection de nouveaux réactifs, les réacteurs ont été continuellement mélangés, après quoi une image de fluorescence de chaque réacteur a été enregistrée à l’aide du microscope. La réaction a été plus tard permise de fonctionner sans interruption pendant 68 cycles, ayant pour résultat une durée expérimentale de 16.5 h. Les résultats de cette expérience sont donnés à la figure 9. Lors de l’exécution d’expériences Prolongées IVTT, il ya deux causes principales pour l’échec d’une réaction; l’introduction de l’air dans le dispositif microfluidique ou la dégradation de la solution de réaction IVTT. L’apparition d’air dans le dispositif microfluidique est le plus souvent le résultat direct de petites bulles d’air existant dans les solutions d’entrée, qui sont ensuite injectées dans le dispositif microfluidique. En entrant dans l’appareil, la présence d’air inhibe le bon flux de fluides, par lequel les réactions ne sont plus périodiquement rafraîchies conduisant à la formation de réactions par lots dans les anneaux du réacteur. Dans certains cas, l’air est lentement retiré de l’appareil par le rinçage répété des réactifs, après quoi la réaction se poursuit comme prévu (comme le montre la figure 9). Dans d’autres cas, l’air reste emprisonné, et ne peut être enlevé qu’en avortant l’expérience et en appliquant par la suite une pression continue (élevée) à la couche d’écoulement du dispositif microfluidique, analogue au processus de remplissage décrit à la section 5.1 des protocoles. Au cours de nos expériences, le lysate cellulaire est stocké dans un tube PTFE sur un élément Peltier refroidi à 4 oC. Les deux mesures aident à limiter la dégradation de la solution de réaction IVTT au fil du temps, avec le tube inerte PTFE assurant une interaction limitée entre le tube et la solution de réaction et les températures froides préservant le fonctionnel (bio)moléculaire composants nécessaires pour effectuer IVTT. Si la dégradation de la solution de réaction se produit – en raison d’un refroidissement insuffisant ou d’interactions indésirables entre la solution de réaction et l’environnement de stockage – alors cela se montrera expérimentalement comme une réduction progressive des protéines l’expression au fil du temps. Une fois dégradée, la solution de réaction IVTT ne peut pas être récupérée et une nouvelle expérience doit être préparée. Figure 1. Configuration matérielle nécessaire pour effectuer des réactions IVTT continues. A) Schéma de la configuration matérielle. B) Photographie de la configuration utilisée tout au long de ce manuscrit. La mise en œuvre d’un dispositif microfluidique multicouches pour les réactions IVTT continues nécessite une configuration matérielle étendue pour réguler la pression d’écoulement, actionner les canaux de contrôle, les réactions de chaleur et de refroidissement et les réactifs, stocker les fluides, et l’image de l’appareil pendant Expériences. Les expériences sont réalisées à des températures de 30 oC, ce qui est réalisé en plaçant le microscope dans un incubateur réglé à cette température. Pour éviter la détérioration de la solution de réaction IVTT, il est stocké dans le tube PTFE enroulé sur la face froide d’un élément Peltier. La température de l’élément Peltier est fixée à 4 oC, avec un refroidisseur d’eau et un bloc d’eau utilisés pour maintenir cette température. Les réactifs qui ne nécessitent pas de refroidissement sont stockés dans des réservoirs de liquide à l’extérieur de l’incubateur de microscope. Une pression constante est exercée sur ces réservoirs par un régulateur de pression contrôlé par ordinateur. De cette façon, les fluides sont forcés à travers la tuyauterie de sortie des réservoirs, qui se connectent directement aux canaux d’entrée de l’appareil microfluidique. Chacun des canaux de contrôle de l’appareil microfluidique est relié à une valve pneumatique. L’ensemble du réseau de vannes est sous pression constante. L’ouverture de la valve, permet la pressurisation du fluide dans le tube reliant la valve pneumatique au canal de commande de l’appareil microfluidique, ouvrant et fermant ainsi les membranes PDMS trouvées dans le dispositif microfluidique. Les vannes pneumatiques sont ouvertes et fermées via une interface utilisateur qui commande à un contrôleur de fieldbus (non montré) d’ouvrir et de fermer des vannes pneumatiques spécifiques. Figure adaptée de Yelleswarapu et coll.22. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 2. Aperçu de la configuration pneumatique de la valve et de la connexion du canal de commande. Un tableau à 8 soupapes est indiqué avec trois raccordements de canal de commande montés aux soupapes 1, 2, et 3. L’air comprimé peut être fourni au tableau de soupape par l’intermédiaire du tube de 1/4 po. Pour les actionnements des canaux de contrôle, deux pressions sont utilisées : 1 barre pour les canaux de contrôle de pression inférieure (1, 2 et 3) et 3 barres pour les canaux de contrôle de pression plus élevé (9 à 30, non indiquées ici). Le tube peut être rempli avec de l’eau ultrapure et inséré dans l’une des entrées du canal de contrôle à l’aide d’une goupille de connecteur en acier inoxydable. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 3. Aperçu du régulateur de pression d’écoulement commercial et du système de réservoir. Un régulateur de pression disponible dans le commerce est utilisé pour injecter des fluides dans la couche d’écoulement du dispositif microfluidique multicouche. La connexion du contrôleur de pression à un ordinateur permet de modulation de la pression utilisée pour effectuer les injections de liquide. Les réactifs peuvent être stockés dans un réservoir de fluide, qui est directement relié au régulateur de pression. L’application de pression sur le réservoir force le liquide à sortir du réservoir par la tuyauterie de sortie. Ce tube de sortie peut être relié directement à l’une des entrées de liquide de l’appareil microfluidique à l’aide d’une goupille de connecteur en acier inoxydable. Si le volume du réactif n’est pas en mesure d’atteindre le réservoir de fluide, le tube de sortie agit comme un réservoir pour le réactif. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 4. Aperçu du système de refroidissement utilisé pour refroidir les réactifs de réaction. (Gauche)Configuration de refroidissement isolée et (droite) Configuration de refroidissement placée dans le microscope et connectée à l’appareil microfluidique. Un élément Peltier est utilisé pour refroidir la solution de réaction IVTT avant l’injection dans le dispositif microfluidique. Le réactif est stocké dans le tube PTFE enroulé sur la face froide de l’élément Peltier. Une longueur de tube PEEK est utilisée pour transférer le liquide refroidi à l’appareil microfluidique, avec le petit diamètre interne (0,005″) minimisant le volume de réactif n’est plus refroidi. À côté du tube PTFE enroulé, un thermistor est placé, permettant une surveillance de la température en temps réel à la surface de l’élément Peltier. La tension appliquée au Peltier est fixée de telle sorte que la température de surface du Peltier reste comprise entre 0 et 4 oC. Pour éliminer l’excès de chaleur produit par l’élément Peltier, le visage chaud du Peltier est placé contre un bloc refroidi à l’eau, avec l’ajout de la graisse de l’évier de chaleur sans silicone assurant un transfert optimal de chaleur entre les deux faces. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 5. Aperçu de la conception de l’appareil microfluidique. Le réacteur à débit microfluidique pour les réactions IVTT continues se compose de huit anneaux de réacteur, chacun avec un volume de 10,7 nL. Neuf entrées permettent l’afflux de neuf solutions de réaction uniques dans l’appareil. 24 canaux de contrôle régulent l’écoulement des fluides à l’intérieur de l’appareil. Les canaux de commande 9 à 14 forment un multiplexeur. Ces canaux de contrôle doivent être pressurisés en tout temps pour inhiber l’écoulement du liquide dans l’appareil. La dépressurisation de deux canaux de contrôle permet simultanément l’entrée d’un seul réactif. Les canaux de commande 15, 16 et 17 sont utilisés pour pomper les réactifs de façon contrôlée. Les canaux de contrôle 18 à 25 contrôlent chacun l’enlet de l’un des huit réacteurs trouvés à l’intérieur de l’appareil. Le canal de commande 26 peut fermer le canal de chasse d’eau, forçant ainsi le fluide dans les réacteurs. Le canal de commande 27 aide au remplissage homogène des réacteurs. Les canaux de commande 28 et 29 régulent respectivement les prises de réacteur sinique et la seule prise de périphérique. Enfin, les canaux de commande 1, 2 et 3 sont utilisés pour pomper le fluide dans les réacteurs d’anneau, ce qui entraîne le mélange des réactifs. La conception de ce dispositif microfluidique et la figure sont toutes deux adaptées de Neiderholtmeyer et coll.29. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 6. Valve à base de membrane à l’intérieur du dispositif microfluidique. A) Canal de flux à l’intérieur du dispositif microfluidique. Deux canaux de contrôle peuvent être vus en arrière-plan. Ces canaux ne sont pas pressurisés et, à ce titre, les vannes sont ouvertes (le fluide peut s’écouler). B) Les deux canaux de commande qui croisent les canaux de la couche d’écoulement ont été pressurisés, fermant les vannes (c.-à-d. que le flux de fluide est entravé). Lors de la pressurisation des canaux de commande, la fine membrane PDMS séparant les canaux de la couche d’écoulement et de contrôle est déviée vers le haut (la couche de commande se trouve sous la couche d’écoulement) qui ferme le canal de couche d’écoulement. L’arrondi du canal de la couche d’écoulement est essentiel pour s’assurer que la membrane déviée ferme complètement le canal d’écoulement. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 7. Interface utilisateur utilisée pour contrôler l’appareil microfluidique. Tout au long de cette recherche, une interface de contrôle personnalisée a été utilisée pour contrôler le flux de fluides à l’intérieur des dispositifs microfluidiques. L’interface permet aux utilisateurs d’actionner individuellement chacun des canaux de contrôle (numérotés 1-3 et 9-29), ou d’exécuter des protocoles élaborés entraînant le rinçage et le chargement des réactifs, l’étalonnage de l’appareil microfluidique, et l’exécution de Expériences. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 8. Résultats d’une expérience d’étalonnage. Au cours d’une expérience d’étalonnage, les réacteurs sont remplis d’un fluorophore (25 M FITC-Dextran) après quoi l’intensité de fluorescence est enregistrée. Par la suite, une série de dilutions s’ensuivent, où un certain nombre d’étapes d’entrée (15) sont utilisées pour injecter de l’eau ultrapure dans les réacteurs. Après chaque dilution, les réactifs sont mélangés et la fluorescence est mesurée. La diminution de l’intensité de fluorescence par dilution révèle le volume de l’anneau du réacteur déplacé pour le nombre fixé d’étapes d’entrée; une valeur appelée le ratiode rafraîchissement. A) L’intensité moyenne et l’écart standard des huit réacteurs sont indiqués en rouge, avec les traces d’intensité individuelles indiquées en gris. B) Le ratio de rafraîchissement moyen et l’écart standard sont indiqués pour chaque étape de dilution en rouge. Les ratios de rafraîchissement individuels de chaque réacteur sont indiqués en gris. On peut voir que sept des huit réacteurs présentent un comportement très similaire, mais un réacteur montre des fluctuations dans le ratio de rafraîchissement après le septième cycle de dilution. Cela met en évidence la nécessité de ratios de rafraîchissement uniques pour chacun des réacteurs, par opposition à l’utilisation d’un ratio de rafraîchissement moyen pour l’injection de réactifs dans les réacteurs. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 9. Résultats d’une expérience IVTT exprimant la protéine deGFP. Une réaction prolongée de l’IVTT a été déclenchée de telle sorte que 30 % du volume du réacteur soit déplacé toutes les 14,6 minutes. La réaction a été autorisée à courir pendant plus de 16 heures avant d’être terminée. Deux réacteurs du dispositif microfluidique ont été utilisés comme blancs, avec seulement de l’eau ultrapure qui a traversé les réacteurs tout au long de l’expérience (réacteurs 1 et 5). Tous les autres réacteurs comprenaient 75 % de solution de réaction IVTT et 25 % d’eau ultrapure (réacteurs 2 et 6) ou de modèles d’ADN linéaires de 2,5 nM codant pour l’expression du deGFP (réacteurs 3, 4, 7 et 8). Dans les quatre réacteurs où l’ADN a été ajouté, il y a une expression claire deGFP. Trois des quatre réacteurs offrent une intensité de fluorescence similaire, un réacteur affichant un signal de fluorescence plus faible. Cela pourrait être causé par une disparité de débit entraînant moins d’ADN entrant dans le réacteur, ou en raison de variations dans les dimensions du réacteur. Après 14 heures, une augmentation soudaine est observée dans le signal des réacteurs contenant de l’ADN. Ceci est causé par une bulle d’air entrant dans la couche d’écoulement de l’appareil microfluidique, probablement provenant de l’une des solutions d’entrée. Le piégeage de l’air dans le dispositif microfluidique limite considérablement le flux de fluides à travers les canaux, ce qui empêche l’ajout ou l’enlèvement de réactifs frais des réacteurs jusqu’à ce que l’air soit passé. À la reprise du débit, l’expérience retrouve son intensité de fluorescence précédente. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Fichiers supplémentaires. Veuillez cliquer ici pour télécharger ces fichiers. 

Discussion

Un dispositif microfluidique multicouche basé sur le PDMS a été présenté, et sa capacité à soutenir les réactions IVTT pendant de longues périodes de temps a été démontrée. Bien que bien adaptée à cet exemple spécifique, cette technologie peut être utilisée pour de nombreuses autres applications. Le contrôle supplémentaire sur le flux de fluide – jumelé à la capacité de réapprovisionner continuellement les réactifs de réaction tout en enlevant (par) les produits – est idéal pour les réactions de synthèse continue, l’étude de divers comportements dynamiques, et les simultanés conduction de multiples variations d’une seule réaction.

Malgré le processus de fabrication relativement simple des dispositifs basés sur PDMS, l’utilisation de celui-ci nécessite une configuration matérielle étendue. Comprenant des panneaux de vannes, des régulateurs de pression, des pompes à pression, des incubateurs et des unités de refroidissement, la transition de la fabrication à l’utilisation n’est pas élémentaire et nécessite un investissement initial important. En outre, la capacité de mettre en place et d’effectuer régulièrement des expériences réussies avec ces appareils nécessite un investissement de temps important; un point que ce manuscrit vise à aborder. Cependant, une fois en place, la configuration entière peut être modifiée pour une gamme de fins. En outre, la configuration matérielle comprend de nombreux éléments modulaires, dont chacun peut être élargi pour permettre des conceptions d’appareils microfluidiques plus complexes à employer. En outre, la conception modulaire permet le remplacement des composants matériels par des alternatives fonctionnant de la même manière, de sorte que les utilisateurs ne sont pas limités à la configuration spécifique décrite ici48,49.

La variabilité entre les différents appareils et dans les conditions externes (telles que les fluctuations de pression) peut entraîner des inexactitudes lors de l’exécution d’expériences à l’aide de ces dispositifs. Pour résoudre ce problème, un étalonnage du système devrait être effectué avant chaque expérience, fournissant un ratio de rafraîchissement unique pour chacun des réacteurs. Bien que l’étalonnage s’adresse aux variations de l’appareil à l’appareil et de l’expérience à l’expérience, il s’agit d’un processus qui prend beaucoup de temps et n’est pas sans faille. Les fluides avec des viscosités différentes ne circuleront pas avec le même taux lorsqu’ils sont exposés à une pression identique, et en tant que tels l’exécution de l’étalonnage avec plusieurs réactifs peuvent ne pas donner des ratiosde rafraîchissement identiques. Cet effet est atténué en utilisant trois canaux de contrôle pour pomper peristaltiquement les réactifs dans le dispositif microfluidique, plutôt que de réguler le flux en variant la pression fournie seulement. En dernier recours dans les cas où la disparité dans la viscosité est très grande, un ratio de rafraîchissement unique peut être mis en œuvre pour chaque réactif individuel en effectuant plusieurs expériences d’étalonnage.

L’utilisation d’une pompe péristétique pour injecter des réactifs dans le dispositif microfluidique atténue les effets de l’utilisation de solutions avec des viscosités variables, mais elle crée également un problème secondaire. L’utilisation d’étapes discrètes pour pomper les fluides dans le dispositif microfluidique, signifie que la résolution des injections dans un seul réacteur, est limitée par le volume injecté lors de l’exécution d’un cycle de pompe unique. Dans le cadre de nos recherches, cette valeur – déterminée pendant l’étalonnage – est à peu près égale à 1 %, ce qui indique qu’un seul cycle de pompe déplace environ 1 % du volume du réacteur (environ 0,1 nL). En tant que tel, le déplacement de 30% du volume du réacteur nécessite l’exécution de 30 cycles de pompe, avec 23 cycles de pompe de la solution de réaction IVTT ajouté, et seulement 7 cycles de pompe de l’ADN ou de l’eau ultrapure ajouté. Bien que suffisants pour nos recherches, d’autres protocoles expérimentaux peuvent rencontrer des problèmes lorsqu’ils tentent d’ajouter un plus grand nombre de réactifs uniques, d’utiliser une fractionde rafraîchissement plus faible ou d’ajouter de plus petits volumes d’un seul réactif à un réacteur. Dans de tels cas, la conception de l’appareil microfluidique peut être adaptée pour fournir aux réacteurs un volume plus important. Un exemple de tel est rapporté dans Niederholtmeyer et al.36.

Essentiellement, l’appareil décrit dans ce manuscrit permet de maintenir des réactions pendant des durées prolongées, ce qui entraîne des taux de transcription et de traduction à taux d’état stable. En injectant périodiquement de nouveaux réactifs dans les réacteurs – et en supprimant les réactions (par) produits – les réactions sont soutenues et des comportements dynamiques complexes peuvent être surveillés. De cette façon, une plate-forme a été créée qui – dans une certaine mesure – imite l’environnement cellulaire. En outre, cette plate-forme permet l’exploration de la dynamique du système, en adaptant la période entre les injections et la composition spécifique des injections. En conséquence, ces dispositifs microfluidiques multicouches sont un outil puissant pour la caractérisation et l’optimisation de nouveaux réseaux synthétiques qui affichent un comportement dynamique complexe.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par le Conseil européen de la recherche, ERC (projet n. 677313 BioCircuit) une subvention nWO-VIDI de l’Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (NWO, 723.016.003), un financement du Ministère de l’éducation, de la culture et des sciences (Gravity 024.001.035 et 024.003.013), le Human Frontier Science Program Grant RGP0032/2015, le Conseil européen de la recherche dans le cadre du programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne Grant 723106, et une subvention de la Fondation nationale suisse pour la science 200021_182019.

Materials

Reagents
Acetone VWR 20063.365
AZ 40 XT Merck KGaA (Darmstadt, Germany) – Positive Photoresist
AZ 726 MIF Developer Merck KGaA (Darmstadt, Germany) – Developer Positive Photoresist
Isopropanol Merck KGaA (Darmstadt, Germany) 109634
Microscope slides VWR ECN 631-1550
mr Dev 600 Microresist Technology GmbH (Berlin, Germany) – Developer Negative Photoresist
Silicon Free Heat Sink Grease Circuit Works CW7270 Thermal Compound
Silicon wafers Silicon Materials – <1-0-0> orientation, 100 mm diameter, 525 µm thickness
SU-8 3050 Microchem Corp. (Newton, MA) – Negative Photoresist
Sylgard 184 Elastomer Kit (PDMS) The Dow Chemical Company 01317318
trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane Sigma-Aldrich 448931-10G
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
4 channel digital input/output module WAGO Kontakttechnik GmbH 750-504 8x
Camera lens The Imaging Source –
Compression fitting Koolance, Inc. FIT-V06X10 Fitting for tubing with 6mm ID and 10mm OD. 4x
Controller end module WAGO Kontakttechnik GmbH 750-600
Device connecting tubing Saint-Gobain Performance Plastics AAD04103 0.02" ID, 0.06" OD, Tygon Tubing (ND-100-80)
Device connector pins Unimed SA (Lausanne, Switserland) 200.010-A AISI 304 tubing, 0.35mm ID, 0.65mm OD, 8mm L
Ethernet Controller WAGO Kontakttechnik GmbH 750-881
Female bus connector Encitech DTCK15-DBS-K 15 pole female bus connector
Fluid reservoirs Fluigent Fluiwell-4C
Fluigent pressure system Fluigent MFCS-EZ 0 – 345 mbar
Hg short arc lamp Advanced Radiation Corporation – 350W
Hot plate Torrey Pines Scientific HP61
Inverted microscope Nikon Instruments Eclipse Ti-E
LabVIEW Software de Greef Lab, Eindhoven University of Technology https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software
Liquid coolant Koolance, Inc. LIQ-705CL-B
Luer stubs Instech Laboratories, Inc. LS23
Male Luer to barb connectors Cole Parmer 45505-32 3/32" ID
Matlab Software de Greef Lab, Eindhoven University of Technology https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software
Microcamera The Imaging Source DMK 42AUC03
Microscope camera Hamamatsu Photonics OrcaFlash4.0 V2 (C11440-22CU)
Orbital shaker Cole Parmer EW-513000-05
Oven Thermo Scientific Heraeus T6P 50045757
Oxygen plasma asher Quorum Technologies K1050X
PDMS puncher SYNEO Accu-Pucnh MP10
PEEK tubing Trajan 1301005001-5F 0.005" ID, 1/32" OD, Red
Peltier element European Thermodynamics APH-127-10-25-S
Peltier temperature controller Warner Instruments CL-100
Photomask CAD/Art Services, Inc. –
Photomask Design Maerkl Lab, EPFL https://zenodo.org/record/886937#.XBzpA8-2nOQ
Pneumatic valve array FESTO – 1x 22 valve array and 1x 8 valve array, Normally closed valves.
Power adapter Koolance, Inc. ADT-EX004S 110/220V AC Power Adapter
PTFE tubing Cole Parmer 06417-21 #24 AWG Thin Wall PTFE
Punching pin SYNEO CR0320245N21R4 OD: 0.032" (0.8128 mm), ID: 0.024" (0.6090 mm)
PVC Tubing Koolance, Inc. HOS-06CL 6 mm ID, 10 mm OD
Single edge blades GEM Scientific –
Soft tubing Fluigent – Supplied with fluid reservoirs. (1 mm ID, 3mm OD)
Spin coater Laurell Technologies Corporation WS-650MZ-23NPPB
Stereo microscope Olympus Corporation SZ61
Thermistor cable Warner Instruments TA-29 Cable with bead thermistor
UV exposure system ABM, USA – Near UV Exposure System, 350W
Vacuum pump Vacuumbrand GmbH MD1C
Water cooled cold plate block Koolance, Inc. PLT-UN40F
Water cooler Koolance, Inc. EX2-755
Weighing scales Sartorius M-prove
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van der Linden, A. J., Yelleswarapu, M., Pieters, P. A., Swank, Z., Huck, W. T. S., Maerkl, S. J., de Greef, T. F. A. A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression. J. Vis. Exp. (152), e59655, doi:10.3791/59655 (2019).
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