JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
العربية

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

منصة ميكروفلويدريك متعددة الطبقات لتوصيل التعبير الجيني الخالي من الخلايا لفترات طويلة

Published: October 06, 2019
doi:
10.3791/59655
, , , , , ,
1Institute for Complex Molecular Systems, Department of Biomedical Engineering, Computational Biology Group,Eindhoven University of Technology, 2Institute for Molecules and Materials,Radboud University, 3Institute of Bioengineering,School of Engineering École Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL)

Summary

يتم وصف عمليه تصنيع الجهاز القائم علي pdms ، متعدد الطبقات ، ميكروفلويديك الذي يسمح في النسخ الأنبوبي والترجمة (ivtt) ردود الفعل علي القيام به علي مدي فترات طويلة. وعلاوة علي ذلك ، يتم توفير نظره عامه شامله عن الاجهزه والبرمجيات اللازمة لاتمته والحفاظ علي ردود الفعل هذه لمدد طويلة.

Abstract

وأصبحت القيود المفروضة علي البيولوجيا التركيبية القائمة علي الخلايا واضحة بشكل متزايد ، حيث يهدف الباحثون إلى تطوير دوائر تنظيميه جينيه تركيبيه أكبر وأكثر تعقيدا. وتحليل الشبكات التنظيمية الجينية التركيبية في الجسم الحي يستغرق وقتا طويلا ويعاني من نقص السيطرة البيئية ، مع تفاعل المكونات الاصطناعية الخارجية مع العمليات المضيفة مما يؤدي إلى سلوك غير مرغوب فيه. وللتغلب علي هذه القضايا ، أصبح توصيف الدوائر الجديدة الخالي من الخلايا أكثر انتشارا. في المختبر النسخ والترجمة (IVTT) مخاليط تسمح لتنظيم البيئة التجريبية ويمكن ان تكون الأمثل لكل نظام فريد من نوعه. البروتوكولات المعروضة هنا بالتفصيل تصنيع جهاز ميكروفلويدريك متعدد الطبقات التي يمكن استخدامها للحفاظ علي ردود الفعل IVTT لمدد طويلة. وعلي النقيض من ردود فعل الدفعات ، حيث تستنفد الموارد علي مر الزمن ، وتتراكم المنتجات (بواسطة) ، فان استخدام الاجهزه الصغريه يسمح بتجديد الموارد فضلا عن أزاله منتجات التفاعل. وبهذه الطريقة ، تحاكي البيئة الخلوية بالحفاظ علي بيئة خارجه عن التوازن يمكن فيها التحقيق في السلوك الدينامي للدوائر الجينية علي مدي فترات طويلة من الزمن. لاستغلال كامل الجهاز ميكروفلويديك متعدد الطبقات ، وقد تم دمج الاجهزه والبرمجيات لاتمته ردود الفعل ivtt. من خلال الجمع بين ردود الفعل ivtt مع منصة ميكروفلويديك المعروضة هنا, يصبح من الممكن لتحليل شامل السلوكيات الشبكة المعقدة, تعزيز فهمنا للأليات التي تنظم العمليات الخلوية.

Introduction

الخلايا قادره علي الشعور والاستجابة لبيئتهم باستخدام الشبكات التنظيمية الديناميكية المعقدة1,2. ويستخدم مجال البيولوجيا التركيبية معرفتنا بالمكونات الطبيعية التي تتالف منها هذه الشبكات لهندسه النظم البيولوجية التي يمكن ان توسع وظائف الخلايا3،4. وعلي العكس من ذلك ، فمن الممكن أيضا لتعزيز فهمنا للشبكات الطبيعية التي تحكم الحياة عن طريق تصميم نظائرها الاصطناعية مبسطه من الدوائر الموجودة أو عن طريق الهندسة الاماميه النظم البيولوجية التي تظهر السلوكيات التي تحدث بشكل طبيعي. ويتم القيام بالهندسة الهندسية لهذه النظم البيولوجية من أسفل إلى اعلي حيث يتم تصميم الدوائر الوراثية الجديدة أو مسارات الإشارات بطريقه عقلانيه ، وذلك باستخدام الأجزاء المحددة جيدا5و6. والجمع بين التصميم العقلاني للشبكات وتصميم النظم ذات الصلة بيولوجيا يمكن من التوصيف المتعمق للنظم التنظيمية البيولوجية ودراستها بمستويات مختلفه من التجريد7.

وكانت الاعمال الرائدة في Elowitz و Leibler8 و غاردنر وآخرون9 أول من يبرهن علي الإدخال الناجح للشبكات الوراثية التركيبية في المضيفين الخلويين. وفي العقد التالي ، واصل العديد من الباحثين البناء علي هذه النجاحات الاوليه علي الرغم من ظهور العديد من القيود المتعلقة بإدخال الدوائر الاصطناعية في الزنزانات7و10و11 ،12. ومن الناحية المثالية ، ينبغي ان يحدث إدخال الدوائر الاصطناعية في المضيفين الخلوية في الأزياء وحدات. للأسف ، فان تعقيد البيئة الخلوية يجعل هذا صعبا بشكل خاص ، مع وظيفة العديد من الأجزاء والشبكات التي تعتمد علي السياق العالي12،13،14. ونتيجة لذلك ، غالبا ما تواجه الشبكات تفاعلات غير مرغوب فيها مع إدخال مكونات المضيف الاصليه التي يمكن ان تؤثر علي وظيفة الدائرة الاصطناعية. المثل ، فان مكونات الشبكة الخارجية يمكن ان تمنع العمليات المضيفة ، وتتنافس علي الموارد المشتركة داخل المضيف ، وتؤثر علي حركيه النمو15،16،17. التالي ، من أجل التصميم العقلاني والتنبؤ بسلوك الشبكات التركيبية في بيئة الجسم الحيوي ، يتطلب نموذج شامل لجميع الديناميكيات الخاصة بالمضيف والدائرة18.

ومن البدائل القابلة للاستمرار لاستخدام المضيفين الخلويين لتوصيف الشبكات التركيبية تطبيق تكنولوجيات النسخ والترجمة في المختبرات (IVTT). تعمل كاختبار للشبكات الاصطناعية ، ويتم تنفيذ ردود الفعل في الحلول التي تشمل جميع المكونات المطلوبة لتمكين التعبير الجيني19،20،21. وبهذه الطريقة ، يتم إنشاء بيئة ذات صله بيولوجيا ، وان كانت مصطنعه ، يمكن من خلالها اختبار الشبكات التركيبية22،23،24،25،26، 27و28. والميزة الرئيسية لاستخدام حلول IVTT هي القدرة علي أداء ردود الفعل في ظل ظروف محدده من قبل المستخدم ، معالباحثين قادرينعلي ضبط التركيب الدقيق لكل رد فعل 2. وعلاوة علي ذلك ، يتيح النهج الخالي من الخلايا اجراء اختبارات عاليه الانتاجيه للشبكات التركيبية ، لأنه يزيل الحاجة إلى تنفيذ خطوات لاستنساخ الخلايا تستغرق وقتا طويلا. ونتيجة لذلك ، فان مده الدورات المتعاقبة للتصميم والبناء والاختبار تنخفض بشكل كبير29,30,31,32. ويمكن تسريع دوره التصميم باستخدام تقنيات الاستنساخ الخالية من الخلايا مثل جمعيه جيبسون لاجراء هندسه سريعة للشبكات الجديدة ، وعن طريق بناء الشبكات من قوالب الحمض النووي الخطية التي-علي عكس البلازميدات المطلوبة في اختبار الجسم المجري- يمكن تضخيمها عبر تفاعلات البلمره المتسلسلة (PCR)33،34.

ردود الفعل دفعه هي ابسط طريقه التي يمكن ان تؤديها ردود فعل IVTT ، والتي تتطلب سفينة رد فعل واحد حيث يتم الجمع بين جميع مكونات التفاعل35. ردود الفعل هذه كافيه للتعبير عن البروتين واختبار الدوائر الاساسيه حتى الآن تثبت غير كافيه عند محاولة دراسة السلوك الديناميكي طويل الأجل للشبكة. علي مدي رد فعل الدفعات ، والمواد الكاشفة اما المنضب أو الخضوع للتدهور مما ادي إلى انخفاض مستمر في معدلات النسخ والترجمة. وعلاوة علي ذلك ، ونتيجة لردود الفعل التقدم المنتجات تتراكم التي يمكن ان تتداخل مع-أو تمنع تماما-الأداء الصحيح للشبكة. وفي نهاية المطاف ، فان استخدام المفاعلات الدفعيه يحد من السلوك الدينامي الذي يمكن ملاحظته ، مع التنظيم السلبي الذي يشكل تحديا خاصا لتنفيذ5،36.

براعة من أنظمه ivtt تمكن من الطرق البديلة المتعددة التي يمكن ان يؤديها ردود فعل ivtt لفترات طويلة ، بدءا من التدفق المستمر إلى الطرق القائمة علي القطيرات ، فضلا عن نهج غسيل الكلي ابسط2،30، 37،38،39،40. تطبيق الاجهزه ميكروفلويديك يوفر للمستخدمين زيادة السيطرة علي ردود فعلهم في حين زيادة الانتاجيه وتقليل التكاليف35،41،42، مع كل نهج محدد وجود لها المزايا الخاصة. استخدام التدفق المستمر يمكن بسهوله الأمثل لزيادة غله التعبير ومع ذلك ، فان عدم القدرة علي أزاله المنتجات رد فعل محدده بشكل فعال يجعل دراسة السلوك الديناميكي غير تافه39. وفي حين ان استخدام النظم الصغرى القائمة علي القطيرات يسمح بفحص عالي الانتاجيه للشبكات الجديدة ، فان صعوبة تزويد الكواشف الجديدة بنتائج التفاعل في القطرات التي تشبه ردود فعل الدفعات الصغيرة الحجم43. المفاعلات القائمة علي غسيل الكلي تسمح بإدخال الكواشف الطازجة ، فضلا عن أزاله بعض منتجات رد الفعل ومع ذلك ، تتراكم جزيئات RNA والبروتينات الكبيرة داخل المفاعل ، كونها كبيره جدا لنشرها من خلال المسام الغشاء. وعلاوة علي ذلك ، مطلوب كميات كبيره من الكواشف للحفاظ علي ردود الفعل هذه لفترات طويلة30،44. في 2013, مايركل et al. قدم جهاز ميكروفلويدريك متعدد الطبقات المصممة خصيصا لاجراء ردود فعلivtt لفتراتطويلة 36,45. استخدام الاجهزه ميكروفلويديك متعددة الطبقات يسمح السيطرة المباشرة علي تدفق السوائل ، مما يسمح لأعاده توجيه التدفق ، فضلا عن عزل السوائل في مناطق محدده من الجهاز46،47. ويمكن لهذه المناطق المعزولة ان تعمل كغرف رد فعل مستقله علي نطاق نانوليتر حيث يمكن تنفيذ ردود فعل IVTT. علي مدي رد فعل IVTT واحد ، وتستخدم الحقن الدورية من الكواشف الطازجة في المفاعل لتجديد مكونات IVTT وقوالب الحمض النووي. وفي الوقت نفسه ، فان حجما متساويا من محلول رد الفعل القديم هو النازحين ، وأزاله منتجات التفاعل. وبهذه الطريقة ، يتم الحفاظ علي بيئة خارج التوازن حيث تبقي معدلات النسخ القاعدي والترجمة في حاله ثابته ، وأطاله عمر تفاعلات IVTT والسماح بحدوث سلوكيات ديناميكية غنيه. من خلال تطبيق هذا النهج ، والباحثون قادرون علي التحقيق في معدلات الحركية من العمليات الفردية التي تحدث داخل دائره معينه ، والمساعدة في الهندسة الاماميه للشبكات الوراثية الجديدة. فعلي سبيل المثال ، قامت نيدرهولتماير وآخرون بتنفيذ هذا النهج لتوصيف مختلف عناصر مذبذب الحلقة الجينية ، وتحديد معدلات الحركية منها36. وفي دراسات أخرى ، أظهرت الشركة ان المعدلات الحركية لعامل سيغما 28 (σ28) المحددة في ظروف الدفعات غير كافيه لوصف سلوك المذبذب المستند إلى28σ ، وان أضافه البيانات المستندة إلى التدفق تحسين التنبؤات نموذج من سلوك الشبكة22.

الهدف من هذه المخطوطة هو تقديم بروتوكول كامل لتصنيع الاجهزه الصغيرة متعددة الطبقات القادرة علي أداء ردود فعل IVTT طويلة الأجل. الاضافه إلى ذلك ، فان هذه المخطوطة تصف جميع الاجهزه والبرمجيات اللازمة لتنفيذ ردود الفعل الطويلة IVTT. يتم تحقيق الجهاز ميكروفلويديك-اللازمة للسيطرة علي تدفق السوائل في ذلك-باستخدام سلسله من الصمامات الهوائية التي تتصل مباشره إلى الاجهزه ميكروفلويديك عبر أطوال الأنابيب. في المقابل ، يتم التحكم في الصمامات الهوائية عبر واجهه تحكم افتراضيه مبنيه خصيصا. يتم تحقيق تدفق السوائل داخل الاجهزه ميكروفلويدريك باستخدام الضغط المستمر الذي يوفره نظام تنظيم الضغط المتاحة تجاريا. وعاده ما يتم اجراء التفاعلات IVTT بين 29 درجه مئوية و 37 درجه مئوية ويتم استخدام حاضنه المجهر لتنظيم درجه الحرارة اثناء ردود الفعل. ومع ذلك ، فان وظيفة خليط IVTT تتحلل تدريجيا عند تخزينها فوق 4 درجه مئوية. وعلي هذا النحو ، ستتوسع هذه المخطوطة علي نظام التبريد الذي يتم استخدامه لتهدئه الخليط من الرقاقة قبل الحقن في الجهاز الميكروفلوريك. وفي الختام ، تقدم هذه المخطوطة لمحه شامله عن الإجراءات المطلوبة للنجاح في تنفيذ ردود الفعل المطولة لل IVTT باستخدام مفاعل تدفق ميكروفلويديك ، بحيث يتمكن الباحثون الآخرون من تكرار هذه التكنولوجيا مع النسبية سهوله.

Protocol

1. اعداد رقاقه ملاحظه: البروتوكولات الخاصة بنا هي محدده لمقاومه الصور الايجابيه 40 XT و SU8 3050 السلبية الضوئية المستخدمة خلال هذا البحث. يمكن استخدام الصور الفوتوغرافية البديلة ، ومع ذلك فان سرعات الدوران المحددة ، ودرجات حرارة الخبز ، وأوقات الخبز ستختلف. يتم ربط تصميم الجهاز ميكروفلويديك المقدمة من niederholtmeyer et al.36 في جدول المواد. وضع اثنين من الرقائق السيليكون نظيفه (100 مم قطرها ، المنحى ، سمك 525 μm) في فرن محمي علي حرارة المجموعة إلى 250 درجه مئوية وترك رقائق لترطيب بين عشيه وضحيها (~ 16 ساعة).ملاحظه: ومن الممكن أيضا لرئيس الرقائق باستخدام الترسيب بخار HMDS. ومع ذلك ، هذا ليس ضروريا إذا كانت الرقائق المجففة بما فيه الكفاية. أزاله رقاقه واحده من السيليكون من الفرن والسماح لها تبرد إلى درجه حرارة الغرفة قبل المضي قدما في طلاء تدور. تطبيق 3-4 mL من 40 XT الضوئية إلى مركز رقاقه. للحصول علي ارتفاع ميزه من 25 ميكرومتر تطبيق بروتوكول تدور التالية: تدور ل 20 s في 500 دوره في الدقيقة (110 دوره في الدقيقة/ثانيه) ، وزيادة سرعه الدوران إلى 3100 دوره في الدقيقة (300 دوره في الدقيقة/ثانيه) وعقد هنا لمده 30 ثانيه ، ويتباطا رقاقه إلى 0 دوره في الدقيقة مع تباطؤ 200 دوره في الدقيقة/ثانيه. باستخدام الانسجه ستوكات أزاله بعناية اي حافه الديكور الذي قد حدث خلال طلاء تدور. خبز لينه باستخدام اثنين من لوحات ساخنه منفصلة تعيين إلى 70 درجه مئوية و 120 درجه مئوية علي النحو التالي: السماح لرقاقه للجلوس في 70 درجه مئوية ل 30 ثانيه. ثم نقل رقاقه إلى اللوحة الساخنة 120 درجه مئوية والسماح لها للراحة هنا لمده 3.5 دقيقه قبل العودة رقاقه إلى 70 درجه مئوية موقد لمده 30 ثانيه. أزاله رقاقه من اللوحة الساخنة و-تجنب الصدمات درجه الحرارة المفاجئة-السماح لها لتبرد إلى درجه حرارة الغرفة. وضع طبقه تدفق ضوئي (مستحلب الجانب أسفل) علي فيلم مقاومه للضوء وفضح رقاقه باستخدام مصباح الاشعه فوق البنفسجية حتى يتم تحقيق التعرض الكلي 200 mJ/سم2 . خبز ما بعد التعرض باستخدام اثنين من لوحات الساخنة (70 درجه مئوية و 105 درجه مئوية) بالطريقة التالية: السماح للرقاقة الجلوس في 70 درجه مئوية ل 20 ثانيه قبل نقل رقاقه إلى 105 درجه مئوية موقد وتركها هنا ل 40 s. وأخيرا العودة رقاقه إلى 70 درجه مئوية موقد لمزيد من 20 ثانيه لإكمال خبز ما بعد التعرض. السماح لرقاقه لتبرد إلى درجه حرارة الغرفة علي كومه من الانسجه ستوكات. تطوير رقاقه عن طريق نقلها إلى طبق بيتري مليئه 726 MIF المطور الضوئية المقاومة لبدء عمليه التنمية. يتم تسريع التنمية عند تنفيذها علي شاكر السطح والرقاقة بأكملها مغمورة في المطور. شطف رقاقه مع المياه المنزوعة الماء واستخدام المجهر ستيريو للتحقق من سطح رقاقه لأي بقايا مقاومه للضوء. إذا كان يمكن رؤية بقايا التصوير ، ثم العودة رقاقه إلى المطور. أعاده تدفق الصور الايجابيه المقاومة عن طريق وضع رقاقه علي صفيحه ساخنه تعيين في 110 درجه مئوية لمده 25 دقيقه. وسوف تؤدي هذه العملية في الميزات المدورة ، فضلا عن الصلب اي الشقوق التي قد ظهرت اثناء عمليه التصنيع. المضي قدما في silanize رقاقه كما هو موضح في الخطوة 1.17. أزاله رقاقه السيليكون الثانية من الفرن ، والسماح لها لتبرد إلى درجه حرارة الغرفة قبل المضي قدما في طلاء تدور. تطبيق 5 مل من SU8 3050 الضوئية مقاومه للضوء في وسط رقاقه. للحصول علي ارتفاع ميزه من 30 ميكرومتر تطبيق بروتوكول تدور التالية: تدور ل 20 s في 500 دوره في الدقيقة (110 rpm/ثانيه) ، وزيادة سرعه الدوران إلى 4,000 دوره في الدقيقة (330 rpm/ثانيه) وعقد هنا ل 42 s ، ويتباطا رقاقه إلى 0 دوره في الدقيقة مع تباطؤ 200 دوره في الدقيقة/ثانيه. باستخدام الانسجه ستوكات أزاله بعناية اي حافه الديكور الذي قد حدث خلال طلاء تدور. خبز لينه باستخدام اثنين من لوحات ساخنه منفصلة (65 درجه مئوية و 95 درجه مئوية) بالطريقة التالية: السماح لرقاقه للجلوس في 65 درجه مئوية ل 30 ثانيه. ثم نقل رقاقه إلى اللوحة الساخنة 95 درجه مئوية والسماح لها للراحة هنا لمده 14 دقيقه قبل العودة رقاقه إلى 65 درجه مئوية موقد لمده 30 ثانيه. أزاله رقاقه من اللوحة الساخنة والسماح لها لتبرد إلى درجه حرارة الغرفة. قياس شده مصباح الاشعه فوق البنفسجية قبل التعرض واستخدام هذا لتحديد مده التعرض المطلوبة لتحقيق جرعه التعرض الكلي من 260 مللي جول/سم2. وضع ضوئي (الجانب مستحلب أسفل) علي فيلم مقاومه للضوء ووضع رقاقه تحت مصدر ضوء الاشعه فوق البنفسجية. فضح رقاقه باستخدام مصباح الاشعه فوق البنفسجية حتى يتم تحقيق التعرض الإجمالي من 260 مللي جول/سم2 . خبز ما بعد التعرض باستخدام اثنين من لوحات الساخنة (65 درجه مئوية و 95 درجه مئوية) بالطريقة التالية: السماح للرقاقة الجلوس في 65 درجه مئوية ل 60 s قبل نقل رقاقه إلى اللوحة السريعة 95 درجه مئوية وتركها هنا لمده 4.5 دقيقه. العودة رقاقه إلى 65 ° c موقد لمده 30 ثانيه أخرى لإكمال خبز ما بعد التعرض. السماح لرقاقه لتبرد إلى درجه حرارة الغرفة علي كومه من الانسجه ستوكات. تطوير رقاقه عن طريق نقله إلى طبق بيتري مليئه mrDev-600 المصور لبدء عمليه التنمية. يتم تسريع التنمية عند تنفيذها علي شاكر السطح والرقاقة بأكملها مغمورة في المطور. شطف رقاقه مع ايزوبروبانول واستخدام المجهر ستيريو للتحقق من سطح رقاقه لأي بقايا مقاومه للضوء. إذا كان يمكن رؤية بقايا التصوير ، ثم العودة رقاقه إلى المطور. مره واحده وضعت بالبالكامل ، من الصعب خبز المقاومة للضوء عن طريق وضع رقاقه علي صفيحه ساخنه تعيين في 150 درجه مئوية ل 1 ح. Silanize كل من رقائق لمنع التصاق PDMS اثناء عمليات الطباعة الحجرية لينه. لاجراء عمليه السيلان ، ماصه pipet-x 2-3 قطرات (لكل رقاقه) من سيلان في قارورة زجاجيه صغيره. ضع هذه القارورة مع الرقاقات في المجفف واسحب المكنسة لمده 5-10 دقيقه. ختم المجفف وترك الرقائق تحت فراغ لمده 12-16 ساعة.تحذير: السينان سام ولا ينبغي استنشاقه. رعاية للعمل في غطاء الدخان وارتداء قفازات النتريل عند التعامل مع silane. وهذا يشمل وضع مضخة فراغ في غطاء الدخان عند سحب فراغ علي المجفف. حرر الفراغ من المجفف وقم بازاله الرقائق السيلانية. يشطف بالماء ويستخدم بخار N2 لتجفيف الرقائق. عند هذه النقطة يمكن وضع الرقائق في التخزين حتى المطلوب. 2. تصنيع الجهاز ميكروفلويديك ملاحظه: يمكن فصل عمليه الطباعة الحجرية الناعمة المستخدمة في تصنيع الاجهزه المجهرية متعددة الطبقات القائمة علي PDMS إلى ثلاث خطوات متميزة: 1) اعداد PDMS لكل من التدفق والتحكم في الطبقات ، 2) المحاذاة والترابط من طبقتين PDMS ، 3) إكمال الجهاز. اعداد PDMS اعداد اثنين من الحلول السلائف PDMS من خلال الجمع بين القاعدة وعوامل العلاج في كوب من البلاستيك واستخدام قضيب خلط لتحريك مكونات اثنين حتى مختلطة تماما. تتطلب طبقه التحكم 20 غرام من العامل الأساسي و 1 غرام من عامل المعالجة (نسبه 20:1). تتطلب طبقه التدفق 40 غرام من العامل الأساسي و 8 غ من عامل المعالجة (نسبه 5:1). Degas الحلول في المجفف. وضع رقاقه تدفق طبقه في طبق بيتري وتصب نسبه 5:1 الخليط PDMS علي رقاقه. Degas و PDMS لمده 30 دقيقه لأزاله فقاعات الهواء. تدور معطف رقاقه طبقه التحكم (أعدت باستخدام SU8 3050ال# سلبيه المقاومة للضوء) مع نسبه 20:1 PDMS. صب 5-10 مل من PDMS علي مركز رقاقه وتشغيل بروتوكول تدور التالية (الاحتفاظ اليسار أكثر من PDMS للاستخدام في وقت لاحق): تدور في 500 rpm لمده 15 ثانيه (100rpm/ثانيه) ، وزيادة سرعه الدوران إلى 1450 دوره في الدقيقة (300 rpm/ثانيه) ل 45 s ، ومن ثم يتباطا رقاقه إلى 0 دوره في الدقيقة (200 دوره في الدقيقة/ثانيه). لضمان سماكه الفيلم PDMS متجانسة ، وضع رقاقه PDMS المغلفة علي سطح مستو في طبق بيتري مغلقه (لتجنب تلوث الغبار). دع الرقاقة تجلس لمده 30 دقيقه قم بازاله طبقه التدفق من المجفف ووضع كل من طبقات التدفق والتحكم في الفرن (80 درجه مئوية). علاج كل طبقات لمده 28-30 دقيقه وأزاله عندما PDMS هو طيع بما فيه الكفاية للتلاعب ، في حين تبقي لزجه قليلا. المضي قدما فورا في عمليه المحاذاة. المحاذاة والترابط باستخدام مشرط ، قم بازاله كل من الاجهزه الاربعه من PDMS علي رقاقه طبقه التدفق. عند أزاله طبقه PDMS من رقاقه السيليكون ، علي الفور تغطيه الجانب ميزه مع الشريط الاسكتلندي لتجنب تلوث الجسيمات الغبار. تقريبا محاذاة كتل تدفق طبقه علي طبقه التحكم بالعين ، ووضع جانب ميزه من الجهاز في اتصال مع PDMS طبقه التحكم. وبعد ذلك ، اجراء تعديلات دقيقه علي موقف كل من كتل طبقه تدفق لمحاذاة قنوات طبقه التدفق مع قنوات طبقه التحكم ، وذلك باستخدام المجهر ستيريو للمساعدة في التصور من التعديلات. تطبيق الضغط لأزاله جيوب الهواء بين طبقتين PDMS. صب نسبه 20:1 المتبقية PDMS حفظها في وقت سابق حول كتل طبقه تدفق الانحياز. وضع الأوزان 100 g علي كل من الاجهزه لضمان الاتصال الكافي اثناء عمليه الترابط. عوده الاجهزه الانحياز (بما في ذلك الأوزان) إلى فرن 80 درجه مئوية وترك لهم السندات لمده لا تقل عن 1.5 h وليس أكثر من 6 ساعة. الانتهاء من الجهاز أزاله رقاقه من الفرن واستخراج كل من الاجهزه الفردية من رقاقه طبقه التحكم ، وتغطي الجانب ميزه من كل جهاز مع الشريط الاسكتلندي. بشكل متكرر ، لكمه ثقب واحد لكل من مداخل طبقه تدفق 9 ، 24 مداخل قناه طبقه التحكم ، ومنفذ طبقه تدفق واحد من كل جهاز. لكمه الجهاز مع الجانب ميزه تواجه ما يصل ، وذلك باستخدام كاميرا لضمان يتم لكمات ثقوب داخل حدود الميزة. لكل جهاز ، وتنظيف شريحة المجهر واحد مع ايزوبروبانول والأسيتون وتجف الشرائح تحت تيار من N2. في وقت لاحق ، ضع الشرائح المجهر علي صفيحه ساخنه تعيين إلى 150 درجه مئوية لمده 15 دقيقه. استخدام الأكسجين البلازما سحق للسندات الاجهزه PDMS إلى الشرائح الزجاجية ، وتطبيق قوه سحق من 50 W ل 45 s. تاكد من ان جانب الميزة من الجهاز يواجه صعودا عند السحق. مره واحده كامله ، ووضع ميزه الجهاز إلى أسفل علي الشريحة الزجاجية ، وتطبيق الضغط لأزاله الغاز المحاصرين بين الأسطح. وضع الاجهزه المستعبدين علي لوحه ساخنه تعيين إلى 110 درجه مئوية ل 1 ح. يمكن وضع الأوزان علي راس الاجهزه لتحسين التصاق الجهاز. 3. اعداد الاجهزه ملاحظه: لتحقيق السيطرة علي رقائق ميكروفلويديك ، العديد من القطع من الاجهزه تحتاج إلى تثبيت ومتصلة مع بعضها البعض. مطلوب ثلاث مجموعات متميزة من الاجهزه: 1) نظام التحكم بالهواء المضغوط لقناات التحكم ، 2) منظم ضغط هوائي للسيطرة علي تدفق الكواشف رد فعل داخل الجهاز ، و 3) نظام تبريد لتهدئه الحل رد فعل IVTT قبل حقن في الجهاز ميكروفلويدريك. يتم توفير نظره عامه حول اعداد الاجهزه في الشكل 1. وتجدر الاشاره إلى ان البروتوكولات المقدمة هنا تحاول ان تكون عامه قدر الإمكان ، ولكن يشار إلى بعض القطع المحددة من المعدات المستخدمة في جميع أبحاثنا. يمكن استبدال جميع الاجهزه ببدائل قادره علي أداء نفس الوظيفة. في مثل هذه الحالات ، يمكن استخدام البروتوكولات هنا لتحديد الخطوات العامة اللازمة لاعداد النظام ومتطلبات كل مكون. يتم تقديم الاجهزه البديلة بواسطة Brower وآخرون48 والأبيض والشوارع49. نظام التحكم بالهواء المضغوط (انظر الشكل 2) باستخدام بروتوكول الشركات المصنعة ، تاسيس اتصال TCP بين وحده تحكم fieldbus ومحطه عمل المستخدم. استخدام برنامج التحكم (المقدمة كملفات تكميليه) لإنشاء الأوامر MODBUS التي يتم إرسالها عبر اتصال TCP إلى وحده تحكم ، ويشتغل الصمامات الملف اللولبي. قم بتوسيع وحده تحكم fieldbus مع ثمانيه وحدات الإخراج الرقمية 4 قنوات ، واحد لكل صمام اللولبي المستخدمة. كل صمام اللولبي يتراس دبوس ربط. قم بتوصيل السلك الإيجابي بأحد المخرجات الايجابيه الاربعه علي واحده من وحدات الإخراج الرقمية اثناء توصيل السلك السالب بأحد المنافذ الارضيه لوحدات المخرجات الرقمية.ملاحظه: للحصول علي النظام للعمل بشكل صحيح ، يجب ان تكون متصلا لولبي بانتظام ، مع أول اللولبي التي يتم توصيلها إلى منفذ الإخراج الأول ، اللولبي الثاني إلى منفذ الإخراج الثاني وهلم جرا. في نظامنا ، يتم استخدام اثنين من صفائف صمام مع 8 و 22 صمامات اللولبي علي التوالي. منافذ الإخراج 1-8 الاتصال صفيف 8-صمام ، ومنافذ الإخراج 9-30 الاتصال صفيف 22 صمام. ربط كلا صفائف صمام إلى مصدر الهواء المضغوط باستخدام 1/4 “أنابيب. استخدام منظمات الضغط لضبط ضغط صفيف 22 صمام إلى 3 بار ، ومجموعه 8 صمام إلى 1 بار. تنظيم ضغط التدفق (انظر الشكل 3)ملاحظه: لتدفق السوائل من خلال طبقه تدفق الجهاز ميكروفلويديك ، يتم استخدام منظم ضغط 4 منافذ المتاحة تجاريا. يتم تنظيم ضغط الإخراج من كل ميناء عن طريق البرامج المقدمة مع وحده تحكم الضغط. قم بتوصيل منظم الضغط بالكمبيوتر باستخدام موصل USB المزود. قم بتوصيل منظم الضغط بمصدر هواء مضغوط ، لضمان الا يتجاوز الضغط الموفر الحد الأقصى للضغط المسموح به من قبل المنظم. ربط Luer الذكور إلى 3/32 “الموصل بارب لكل من أربعه الإناث Luer قفل الإخراج المنافذ من منظم الضغط. ربط طول أنابيب لينه (OD: 3 ملم ، ID: 1 ملم ، L: 10 سم) إلى الشوكة. توصيل Luer الذكور الثانية إلى 3/32 “موصل بارب إلى نهاية مفتوحة للأنابيب لينه ونعلق هذا إلى منافذ موصل السائل الخزان. استخدام البرامج المقدمة لتعيين الضغط المطلوب من كل منفذ من المنظم تدفق ، والضغط علي الكواشف المخزنة داخل الخزانات ليؤدي إلى تدفق الكواشف في الجهاز ميكروفلويديك. سيتم مناقشه الاتصال من الخزانات إلى الجهاز ميكروفلويديك في القسم 4.2. اعداد التبريد خارج الرقاقة (انظر الشكل 4) استخدام الأنابيب البلاستيكية (OD: 10 ملم ، ID: 6 ملم) لتوصيل نظام تبريد المياه إلى كتله المياه لوحه الباردة باستخدام التجهيزات ضغط. ملء خزان السوائل من نظام تبريد المياه مع المبرد وأماله بلطف وحده لأزاحه اي الهواء المحاصرين ، مضيفا باستمرار المبرد إلى الخزان للتاكد من انها لا تزال كامله. عندما يتم أزاله جميع الغاز من النظام ، وملء الخزان إلى ما يقرب من 90-95 ٪ من حجمه القصوى. لفائف PTFE الأنابيب (OD: 0.042 “، ID: 0.022”) علي الوجه البارد للعنصر Peltier وتامين هذا مع الشريط. تاكد من ان أحد طرفي أنابيب PTFE متصل بخزانات نظام التحكم في ضغط طبقه التدفق (كما هو موضح في القسم 4.3). وينبغي ان الطرف الآخر من الأنابيب PTFE نتوء لا يزيد عن 1 سم من سطح Peltier. ادراج طول 5-10 سم من الأنابيب نظره خاطفه (OD: 0.794 mm ، ID: 0.127 مم) في نهاية جاحظ من الأنابيب PTFE. ويرد مزيد من التوضيح في القسم 4.3 ملء الأنابيب والاتصال بجهاز ميكروفلويدريك. وضع الوجه الساخن للعنصر Peltier علي لوحه الباردة من كتله المياه ، وتطبيق المجمع الحراري كافيه لوجهين. تاكد من ان الأنابيب ، وعنصر Peltier ، وكتله التبريد علي اتصال مباشر مع بعضها البعض في جميع الأوقات. قم بتوصيل عنصر Peltier إلى وحده تحكم درجه الحرارة (عبر موصل ناقل تسلسلي) ، بحيث يمكن تنظيم الجهد المقدم إلى Peltier. وضع بشكل أمن الثرمستور علي سطح peltier ، وربط الإخراج إلى وحده تحكم درجه الحرارة. بعد تشغيل بروده المياه ، وتكييف الجهد المقدمة إلى Peltier حتى درجه الحرارة مستقره في 4 درجه مئوية.ملاحظه: مع هذا الاعداد ، يتم التحكم في درجه حرارة peltier يدويا عن طريق تكييف الجهد المقدمة ، في حين ان الثرمستور يخدم فقط لمراقبه درجه الحرارة. 4. اعداد تجربه ملاحظه: قبل بدء تجربه ، يجب اعداد الجهاز ميكروفلويديك ، ويجب ادراج الكواشف رد الفعل في الأنابيب الصحيحة للحقن في الجهاز. سيناقش هذا القسم: 1) اتصال أنابيب قناه التحكم إلى الجهاز ، 2) اتصال الكواشف تدفق غير المبردة إلى الجهاز ، و 3) اتصال الكواشف تدفق المبردة إلى الجهاز. توصيل أنابيب قناه التحكم لكل من قنوات التحكم في الجهاز ميكروفلويديك ، وقطع طول الأنابيب (OD: 0.06 “، ID: 0.02”). في نهاية واحده, ادراج دبوس من 23 ز, 1/2 “Luer كعب وفي الأخرى ادراج الفولاذ المقاوم للصدا ربط دبوس (OD: 0.65 مم, ID: 0.35 mm, L: 8 مم). ربط القاعدة Luer إلى Luer الذكور إلى 3/32 “موصل النايلون بارب. ادراج بارب من الموصل في طول أنابيب البولي يوريثين (OD: 4 مم ، ID: 2.5 مم). ادراج هذه الأنابيب البولي يوريثين مباشره في واحده من الصمامات اللولبي. نعلق 23 ز ، 1/2 “Luer كعب الروتين إلى حقنه وادراج هذا في قصيرة (3-4 سم) قطعه من الأنابيب (OD: 0.06” ، ID: 0.02 “). وضع نهاية مفتوحة لهذه الأنابيب في خزان من الماء فائق النقاء وملء الحقنه مع الماء نقاء. رقم كل قناه التحكم من الجهاز ميكروفلويديك كما هو موضح في الشكل 5. لكل قناه (باستثناء قنوات التحكم من 1 إلى 3 ، والتي لا تمتلئ بالماء) ، والعثور علي الأنابيب المقابلة (متصلة الصمامات اللولبي) وادراج دبوس معدني في نهاية مفتوحة من الأنابيب المرفقة بالحقنة. ضخ المياه في أنابيب قناه التحكم حتى يتم ملء نصف طول. قطع الأنابيب من الحقنه وادراج دبوس موصل الفولاذ المقاوم للصدا في ثقب المقابلة للجهاز ميكروفلويديك. كرر لجميع قنوات التحكم. استخدام واجهه التحكم لفتح جميع الصمامات اللولبي. وهذا سيضغط علي السائل داخل أنابيب قناه التحكم ، وإجباره علي الجهاز ميكروفلويديك وإغلاق جميع الصمامات المستندة إلى الغشاء داخل الجهاز. ويرد مثال لاغشيه مفتوحة ومغلقه داخل الجهاز في الشكل 6. توصيل الكواشف غير المبردة إلى الجهاز لكل من الكواشف غير المبردة ، وقطع طول الأنابيب (OD: 0.06 “، ID: 0.02”) لتوصيل ماخذ الخزان إلى مداخل الجهاز ميكروفلويديك. تاخذ واحده من نهاية الأنابيب وادراج هذا في الخزان ، وضمان ان الأنابيب تصل إلى قاعده الخزان. وينبغي تشديد منفذ أنابيب الخزان بحيث يتم تحقيق ختم محكم الهواء. ادراج دبوس اتصال الفولاذ المقاوم للصدا (OD: 0.65 mm ، ID: 0.35 مم ، ل: 8 ملم) في نهاية مفتوحة من الأنابيب. نعلق 23 ز, 1/2 “Luer كعب الروتين إلى نهاية صغيره (1 مل) حقنه. أضافه طول قصير من الأنابيب (OD: 0.06 “، ID: 0.02”) إلى القاعدة Luer. وضع نهاية الأنابيب في محلول كاشف المطلوب ، وملء حقنه مع كاشف. ادراج دبوس موصل الفولاذ المقاوم للصدا في أنابيب البولي يوريثين متصلة حقنه وملء الأنابيب مع كاشف. عند استخدام احجام ردود الفعل الصغيرة ، فان الكاشف لن يدخل الخزان ، والأنابيب نفسها ستكون بمثابه الخزان. افصل الحقنه وادخل دبوس الموصل في واحده من ثقوب مدخل طبقه التدفق للجهاز ميكروفلويديك. تطبيق الضغط علي كل من الخزانات باستخدام برنامج منظم الضغط لإجبار الكواشف في الجهاز ميكروفلويديك. توصيل السوائل المبردة بالجهاز الميكروفلويدريك تاكد من ان بروده المياه والعنصر بيلتييه قد تم تشغيلها ، مع درجه حرارة سطح من Peltier تعيين إلى 4 درجه مئوية. جبل الاعداد التبريد بالقرب من الجهاز ميكروفلويديك قدر الإمكان ، وتقليل حجم غير المبردة بين peltier ومدخل الجهاز. ربط النهاية المفتوحة للأنابيب PTFE لأنابيب متصلة واحده من خزانات السوائل (كما هو موضح في القسم 4.2) باستخدام دبوس موصل الفولاذ المقاوم للصدا (OD: 0.65 mm ، ID: 0.35 mm ، L: 8 مم). قم بتوصيل حقنه صغيره (1 مل) إلى قاعده Luer (23 G, 1/2 “) مع طول قصير من الأنابيب (OD: 0.06”, ID: 0.02 “) المرفقة بالنهاية. ملء حقنه مع كاشف إلى ان يبرد (هنا ، حل رد فعل IVTT). ربط الأنابيب نظره خاطفه إلى حقنه عبر الأنابيب الضامة وتطبيق الضغط المستمر علي حقنه ، مما اضطر كاشف من خلال أنابيب نظره خاطفه والي أنابيب PTFE. افصل أنابيب النظرة الخاطفة من الحقنه وادخلها مباشره في أحد مداخل قنوات التدفق الخاصة بجهاز ميكروفلويديك. عندما يتم تطبيق الضغط عن طريق برنامج منظم الضغط سيتم فرض الكاشف المبردة في الجهاز ميكروفلويديك. 5-التجريب ملاحظه: قبل اجراء التجارب يجب ان تكتمل كافة اتصالات الاجهزه والأنابيب المفصلة في البروتوكولات المقطعين 3 و 4 ، ويجب ان تكون جميع الكواشف متصلة بالجهاز. ويمكن بعد ذلك تقسيم الاجراء التجريبي إلى أربعه أجزاء متميزة: 1) تحميل الجهاز ميكروفلويديك ، 2) اعداد المجهر ، 3) معايره الجهاز ، و 4) أداء التجربة. يتم توفير واجهه التحكم الظاهرية المخصصة (انظر الشكل 7) المستخدمة خلال هذا البحث كمورد إضافي عبر قائمه المواد) تحميل الجهاز ميكروفلويديك وضع الجهاز ميكروفلويديك ، مع كل السيطرة وتدفق طبقه الأنابيب المرفقة في مرحله المجهر وإغلاق اي فتحات علي الحاضنة. تعيين درجه الحرارة المحيطة من الحاضنة إلى 29 درجه مئوية. تاكد من تشغيل نظام التبريد وتعيينه إلى 4 درجات مئوية قبل بدء التجربة. تاكد من ضغط جميع قنوات التدفق والتحكم. تعيين الضغط من قنوات التحكم 1-3 في شريط 1 ، وتضغط علي قنوات التحكم 9-29 في 3 بار. الكواشف تتطلب ضغط بين 20 و 100 ميليبار ليتم تطبيقها علي خزانات السوائل باستخدام برنامج منظم الضغط. أزاله الهواء من الجهاز ميكروفلويديك باستخدام واحده من الكواشف. إغلاق منفذ الجهاز (الضغط علي قناه التحكم 29) وفي نفس الوقت الاكتئاب قنوات التحكم 1-3 ، و 15-28. ثم قم بالضغط بشكل انتقائي علي قنوات التحكم الخاصة بالمعدد للسماح بتدفق الكاشف المحدد إلى الجهاز. استخدام المجهر لمراقبه أزاله الهواء.ملاحظه: في الحالة التي لا يتم تحميل الكواشف في الجهاز بشكل صحيح ، أو ان فقاعات الهواء لا يتم ازالتها ، يمكن زيادة الضغط تصل إلى 350 mbar. تاكد من ان جميع الكواشف تتدفق بشكل صحيح ، دون إدخال الهواء باستخدام وظيفة دافق في برنامج التحكم. ويمكن تبسيط رصد تدفق السوائل عن طريق التحميل الأول فلوكوفيري ورصد النزوح من قبل الكواشف الفردية. اعداد المجهر باستخدام المجهر ، حدد موقع اي نقاط الاهتمام (نقطه واحده داخل كل مفاعل كافيه) داخل الجهاز ميكروفلويديك ، وتخزين إحداثيات منه. وهذه النقاط سيتم التصوير خلال المعايرة والعمليات التجريبية.ملاحظه: خلال المعايرة والإجراءات التجريبية المدرجة ضمن برنامج التحكم ، يتم إرشاد المجهر للتقاط الصور بشكل دوري في الإحداثيات المخزنة سابقا. ولتحقيق ذلك ، يتصل برنامج التحكم ببرنامج المجهر ، ويبلغه بتسجيل صور جديده. هذا الاتصال هو فريد من نوعه لكل الاعداد المجهر ، وعلي هذا النحو تم تعديل هذه الوظيفة داخل واجهه البرامج المقدمة. المقدمة هو القابلة للتنفيذ وهميه ، والتي يمكن تعديلها من قبل المستخدم النهائي للتوافق مع نظام المجهر الخاصة بهم. معايره جهاز ميكروفلويدريك تحديد حجم السوائل النازحين من كل مفاعل خلال خطوه واحده للتدفق (سلسله المضخات التي توفرها قنوات التحكم بيريستالتيكالي اكتوتينغ 15-17 ، والتي تضم 6 أوامر MODBUS تم تنفيذها بالتتابع) ، عن طريق تنفيذ بروتوكول المعايرة المقدمة في حزمه البرامج. تعيين حقول البيانات التالية داخل برنامج التحكم: القناة العازلة Elution، القناة فلوكوفيري ، عدد دورات التخفيف (الافتراضي هو 10 dilutions) ، عدد من خطوات التدفق (الافتراضي هو 15 خطوات) ، عدد من دورات الاختلاط (الافتراضي هو 4 دورات) ، والوقت بين دورات خلط (الافتراضي هو 0 ثانيه). بدء المعايرة عن طريق الضغط علي اجراء تجربه المعايرة.ملاحظه: اثناء عمليه المعايرة ، تمتلئ جميع المفاعلات بالفلور وتسجل الصور. وفي وقت لاحق ، يتم تنفيذ سلسله من التخفيفات حيث يتم الاستنشاق في المفاعلات (استنادا إلى العدد المحدد لخطوات التدفق) ، التالي أزاحه الفلوروكوفيري. بعد الخلط بدقه ، يتم التقاط صور جديده. تتكرر هذه العملية لعدد مجموعه دورات التخفيف. عند الانتهاء من المعايرة ، اتبع الخطوات المقدمة من قبل برنامج التحكم ، واستكمال تحليل تجربه المعايرة.ملاحظه: سيوفر التحليل للمستخدمين نسبه التحديث لكل مفاعل استنادا إلى انخفاض الفلورية المسجلة خلال كل دوره التخفيف . وتشير هذه القيمة إلى الجزء الصغير من حجم المفاعل الذي شرده العدد المحدد لخطوات التدفق . المقابل ، ستستخدم هذه القيمة اثناء التجارب لتحديد عدد خطوات التدفق المطلوبة لأزاحه حجم مفاعل معين. تنفيذ التجربة قم بتعيين القيم المطلوبة للتجربة المطلوبة ضمن واجهه التحكم الظاهرية. الحرج هو كسر التحديث [٪] الذي يحدد حجم المفاعل النازحين لكل دوره تجريبية ، وينبغي تعيين ما بين 15 و 40 ٪.ملاحظه: سيحدد البروتوكول التجريبي المحدد الحقول التي يجب تعيينها لواجهه التحكم قبل بدء التجربة. سيلزم بعض الترميز الثانوي لتكييف واجهه التحكم للتجارب الجديدة. بدء البروتوكول التجريبي عن طريق الضغط علي زر تنفيذ التجربة في واجهه التحكم.ملاحظه: بدون تغيير ، يبدا البرنامج المتوفر تعبير بروتين بسيط. استعملت مفاعلات 1 و 8 كتحكمات, بينما مفاعلات 2-7 منزل تجارب متماثلة. هنا ، 75 ٪ من حجم المفاعل يتكون من محلول ivtt ، و 25 ٪ اما المياه نقاء أو حل الحمض النووي الخطي 2.5 nM. وتحدث التخفيفات كل 15 دقيقه ، مع نزوح 30 في المائة من حجم المفاعل لكل مخفف. يتم تسجيل الصور في نهاية كل دوره التخفيف. 6-تحليل البيانات ملاحظه: تم توفير البرامج النصية لتحليل الصور (انظر الملفات التكميلية أو جدول المواد) ، والاستفادة من حزمه تحليل ‘ bfopen ‘ ، والذي هو مطلوب لمراجعه ملفات ‘nd2’ (التي تقدمها لدينا اعداد المجهر). قم بتشغيل البرنامج النصي للتحليل ‘معايره البرنامج النصي. m’ وبمجرد المطالبة بتحديد الملف المطلوب ‘nd2’. سيتم عرض صوره مفاعل واحد مع التي يمكن تحديد كثافة الصورة الصحيحة. استخدم شريط التمرير لتحسين كثافة الصورة بحيث تكون حواف القناة ميكروفلويديك مرئية بوضوح. ستظهر صوره للمفاعل. ضمن هذه الصورة ، حدد منطقه داخل قناه المفاعل التي يجب تحديد كثافة مضان.ملاحظه: سيتم تحديد كثافة مضان لكل مفاعل ، لكل صوره مسجله مع النتائج المعروضة في مؤامرة بسيطه ، مما يسمح بتصور النتائج.

Representative Results

لإثبات فعاليه منصة ميكروفلويديك متعدد الطبقات لتوصيل التجارب ivtt ، تم استخدام الاعداد الموصوفة للتعبير عن بروتين degfp. وأجريت التجربة في مزيج من التفاعلاتالمتاحة تجاريا بالفعل ، والتي تضم جميع مكونات النسخ والترجمة اللازمة-المكملة بركائز التفاعل وقوالب الحمض النووي. أجريت التجارب عند درجه حرارة 29 درجه مئوية ؛ درجه الحرارة التي وجدت لتكون الأمثل للتعبير IVTT من البروتينات. ويمتلك الجهاز الصغير تسعه مداخل فريدة من نوعها ، استخدمت أربعه منها خلال هذه التجربة. احتوي الاولي المكتسبة تجاريا [ايكت] رد فعل خليط. مزيج التفاعل ivtt يستوعب جميع المكونات المطلوبة للتعبير عن البروتينات بنجاح ومع ذلك ، تمت أضافه gams المنقية إلى خليط التفاعل-في تركيز نهائي من 1.3 μM-قبل التحميل في الجهاز ميكروفلويديك. أضافه بروتين GamS يعمل علي تقليل تدهور أنواع الحمض النووي الخطي عند اجراء التجارب. وبشكل حاسم ، تم حقن خليط IVTT في أنابيب تترافلوروايثيلين (PTFE) ملفوفه علي عنصر بلتييه مع درجه حرارة سطح 4 درجه مئوية لتبريد المحلول قبل حقنه منه في جهاز ميكروفلويدريك. منع تدهور حل التفاعل قبل استخدامه. وقد استخدمت مايكرو التجويف الأثير كيتون (نظره خاطفه) أنابيب لتوصيل الأنابيب PTFE ترك سطح العنصر بيلتييه مع جهاز ميكروفلويدريك ، والحد من حجم الخليط التفاعل IVTT لا يتم تبريده. الحل الثاني المدرجة في الجهاز الواردة في الترميز الخطي DNA قالب لل deGFP-المذاب في الماء فائق النقاء-بتركيز 10 نانومتر. الحل الثالث ، المياه فائقه النقاء ، خدم أغراض متعددة خلال الإجراءات التجريبية. في المقام الأول ، تم استخدام المياه فائقه النقاء لضمان ان حجم النازحين لكل تخفيف كان مساويا لجميع المفاعلات ، والعمل كبديل للحمض النووي في ردود الفعل السيطرة. بالاضافه إلى ذلك ، تم استخدام المياه فائقه النقاء أيضا لتمييع الفلوروكوفيري اثناء معايره الجهاز ومسح حجم القتلى من الجهاز عند التبديل بين الكواشف. الحل النهائي الذي تم ادراجه في الجهاز كان حلا منقيا من FITC-ديكسكان (25 μM) مطلوب لاجراء معايره الجهاز الاوليه. تم حقن الحمض النووي ، والمياه ، والمحاليل الفلوروكوفيري في أنابيب (0.02 “ID ، 0.06” OD) التي يمكن ادراجها في وقت لاحق في واحده من قنوات تدفق الجهاز ميكروفلويديك وفقا للقسم 4.2 من البروتوكولات. علي هذا النحو ، تم تخزين هذه الحلول في 29 درجه مئوية لكامل التجارب. يتحقق تشغيل قنوات التحكم في الجهاز ميكروفلويديك عن طريق برامج التحكم المخصصة حيث يمكن تشغيل كل من قنوات التحكم بشكل فردي. لا يمكن تحقيق التنفيذ من ردود الفعل المطولة IVTT عن طريق هذه العملية اليدوية ويتطلب استخدام البروتوكولات المؤتمتة المدرجة في برنامج التحكم. عند اعداد جهاز ميكروفلويدريك لاجراء التجارب ، يمكن استخدام بروتوكولات مؤتمتة مماثله لتنفيذ عدد من العمليات المفيدة: تنظيف الجهاز من حجم القتلى مع كاشف جديد ، وخلط الكواشف داخل مفاعل الحلبة ، وتحميل كاشف جديد في المفاعل في حين تشريد حجم متساو من الحل الحالي. الاضافه إلى ذلك ، تتوفر عمليتين معقدين: توصيل معايره الجهاز ، وتنفيذ تعبير البروتين الخالي من الخلايا لفترات طويلة. يمكن تنفيذ جميع العمليات المذكورة أعلاه بسهوله من الواجهة الرئيسية ، إلى جانب القدرة علي تكوين معلمات متعددة لتغيير إعدادات عمليه معينه مثل قناه التدفق الوارد ، وحجم التدفق ، ومده الخلط. بسبب التقلبات في الضغط والعيوب اثناء تصنيع الجهاز الميكروفلوريك ، يمكن ان يختلف حجم السوائل النازحة خلال دوره حقن واحده بين الاجهزه. علي هذا النحو ، قبل اجراء التجارب IVTT ، تم تحديد حجم المفاعل النازحين لكل دوره الحقن (تحديث الكسر). وتتطلب هذه المعايرة ملء جميع المفاعلات الثمانية بمحلول مرجعي فلوري. في هذه الحالة ، تم استخدام محلول التنقية المنقي (25 μM). في وقت لاحق ، يتم تخفيف المفاعلات 10 مرات مع الماء فائق النقاء. ومن خلال قياس الانخفاض في الفلورية لكل دوره تخفيف لكل مفاعل ، تم تحديد حجم السوائل التي شردت اثناء دوره حقن واحده. ضمن برنامج التحكم ، تم تسجيل هذه القيمة ( نسبه التحديث) للاستخدام اثناء تجربه ivtt. وبشكل حاسم ، لحساب الاختلافات في معدل التدفق عبر الجهاز ، فضلا عن الاختلافات في احجام المفاعلات الفردية ، يتم تحديد نسبه التحديث وتخزينها لكل مفاعل علي حده. وقد أجريت سلسله ملء وتمييع المفاعلات تلقائيا باستخدام برنامج المعايرة أداء الذي يشكل جزءا من برنامج التحكم. وترد نتائج تجربه المعايرة في الشكل 8. وتنفذ العملية المبرمجة مسبقا الأكثر تعقيدا تجربه IVTT طويلة الأمد ، مما يسمح للمستخدمين ببدء التجربة والسماح لها فيما بعد بالعمل دون مراقبه حتى الانتهاء. وطوال التجربة ، استخدمت المفاعلات 1 و 5 كفراغات ، مع أضافه الماء فقط إلى المفاعلات اثناء عمليات التخفيف. واستخدم المفاعلان 2 و 6 كعنصرين من عناصر التحكم السلبية واحتويا فقط علي حل رد فعل IVTT والمياه فائقه النقاء. واحتويت المفاعلات المتبقية (3 و 4 و 7 و 8) علي حلول رد الفعل IVTT و 2.5 نيوتن متر من الترميز الخطي للحمض النووي لجين deGFP. ويتحقق البدء في المفاعلات عن طريق ملء جميع المفاعلات بالبالكامل (باستثناء 1 و 5) مع حل رد فعل IVTT ، قبل ان يتم تهجير 25 ٪ من حجم المفاعل مع المياه فائقه النقاء. وفي الاخره ، بدا الحقن الدوري للكواشف في المفاعلات. وأجريت التجربة بحيث تم حقن الكواشف الجديدة في المفاعلات كل 14.7 دقيقه ، مع نزوح 30 في المائة من حجم المفاعل خلال كل دوره تخفيف. وكان تكوين كل حقنه من هذا القبيل ان 75 ٪ من السائل حقن تتالف من محلول ivtt الطازجة ، في حين ان المتبقية 25 ٪ تتكون من الحمض النووي أو الماء نقاء. بعد كل حقنه من الكواشف الجديدة كانت المفاعلات مختلطة بشكل مستمر ، وبعد ذلك تم تسجيل صوره مضانه لكل مفاعل باستخدام المجهر. سمحت الرد فعل كان فيما بعد ان يركض باستمرار ل 68 دورات, ينتج في فتره تجريبية من 16.5 [ه.]. وترد نتائج هذه التجربة في الشكل 9. عند تنفيذ التجارب IVTT لفترات طويلة ، وهناك سببين رئيسيين لفشل رد الفعل. إدخال الهواء في الجهاز ميكروفلويديك أو تدهور حل رد فعل ivtt. حدوث الهواء داخل الجهاز ميكروفلويديك هو في معظم الأحيان نتيجة مباشره لفقاعات الهواء الصغيرة الموجودة في الحلول التدفق ، والتي يتم حقنها في وقت لاحق في الجهاز ميكروفلويديك. عند دخول الجهاز ، فان وجود الهواء يمنع التدفق السليم للسوائل ، حيث لم تعد ردود الفعل بشكل دوري منتعشة مما يؤدي إلى تشكيل ردود فعل دفعه داخل حلقات المفاعل. في بعض الحالات ، يتم أزاله الهواء ببطء من الجهاز عن طريق التنظيف المتكرر للكواشف ، وبعد ذلك يستمر رد الفعل علي النحو المقصود (كما هو موضح في الشكل 9). وفي حالات أخرى ، يظل الهواء محاصرا ، ولا يمكن ازالته الا بإجهاض التجربة ثم تطبيق الضغط المستمر (العالي) علي طبقه التدفق للجهاز الميكروفلوريك ، بما يماثل عمليه التعبئة الموصوفة في القسم 5.1 من البروتوكولات. خلال تجاربنا يتم تخزين محلله الخلية في أنابيب PTFE علي عنصر peltier تبريده إلى 4 درجه مئوية. كلا التدابير المساعدة في الحد من تدهور الحل رد فعل IVTT علي مر الزمن ، مع أنابيب PTFE خاملة ضمان التفاعل المحدود بين الأنابيب وحل رد الفعل ودرجات الحرارة الباردة الحفاظ علي الوظيفية (الحيوية) الجزيئية إدخال المكونات المطلوبة لتنفيذ IVTT. وينبغي ان يحدث تدهور في حل رد الفعل-نتيجة لعدم كفاية التبريد أو التفاعلات غير المرغوب فيها بين حل رد الفعل وبيئة التخزين-ثم هذا سوف تظهر نفسها تجريبيا كتخفيض تدريجي للبروتين التعبير مع مرور الوقت. وبمجرد التدهور ، لا يمكن استرداد حل رد الفعل الذي توصل اليه المركز وينبغي اعداد تجربه جديده. الشكل 1 اعداد الاجهزه المطلوبة لتنفيذ تفاعلات IVTT مستمرة. ا) التخطيطي لاعداد الاجهزه. ب) صوره للاعداد المستخدمة في هذه المخطوطة. يتطلب تنفيذ جهاز ميكروفلويدريك متعدد الطبقات لتفاعلات IVTT المستمرة اعداد الاجهزه واسعه لتنظيم ضغط التدفق ، يشتغل قنوات التحكم ، وردود الفعل الحرارة وبارده والكواشف ، وتخزين السوائل ، وصوره الجهاز خلال التجارب. يتم اجراء التجارب في درجات حرارة 30 درجه مئوية ، والتي يتم تحقيقها عن طريق وضع المجهر داخل حاضنه مجموعه لهذه الحرارة. لمنع تدهور حل رد فعل IVTT ، يتم تخزينه داخل PTFE أنابيب ملفوف علي الوجه البارد للعنصر Peltier. يتم تعيين درجه حرارة العنصر Peltier إلى 4 درجه مئوية ، مع بروده المياه وكتله المياه المستخدمة للحفاظ علي هذه الحرارة. الكواشف التي لا تتطلب التبريد ، يتم تخزينها في خزانات السوائل خارج حاضنه المجهر. يتم تطبيق الضغط المستمر علي هذه الخزانات من قبل الكمبيوتر منظم الضغط التي تسيطر عليها. وبهذه الطريقة ، يتم إجبار السوائل من خلال أنابيب ماخذ الخزانات ، والتي تتصل مباشره بقناات التدفق الداخل للجهاز الميكروفلويدريك. يتم توصيل كل من قنوات التحكم من الجهاز ميكروفلويدريك إلى صمام هوائي. مجموعه صمام كامل تحت ضغط مستمر. فتح صمام ، يسمح للضغط علي السائل داخل الأنابيب التي تربط الصمام الهوائي إلى قناه التحكم في الجهاز ميكروفلويديك ، التالي فتح وإغلاق الاغشيه pdms وجدت داخل الجهاز ميكروفلويديك. يتم فتح وإغلاق الصمامات الهوائية عن طريق واجهه المستخدم التي تامر وحده تحكم fieldbus (لا يظهر) لفتح وإغلاق الصمامات الهوائية المحددة. الشكل مقتبس من الرقم22. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم. الشكل 2 نظره عامه علي اعداد الصمام الهوائي واتصال قناه التحكم. يتم عرض صفيف 8 صمامات مع ثلاثه اتصالات قناه التحكم المجهزة للصمامات 1 و 2 و 3. ويمكن توفير الهواء المضغوط إلى صفيف صمام عبر 1/4 “أنابيب. لتفعيل قنوات التحكم يتم استخدام ضغطين: 1 بار لقناات التحكم في الضغط السفلي (1 ، 2 ، 3) و 3 بار لقناات التحكم في الضغط العالي (من 9 إلى 30 ، لا يظهر هنا). يمكن ملء الأنبوب بالماء الفائق وإدخاله في واحده من مداخل قناه التحكم باستخدام دبوس موصل الفولاذ المقاوم للصدا. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم. الشكل 3 نظره عامه علي منظم ضغط التدفق التجاري ونظام الخزان. ويستخدم منظم الضغط المتاحة تجاريا لحقن السوائل في طبقه تدفق الجهاز ميكروفلويدريك متعدد الطبقات. ربط وحده تحكم الضغط إلى جهاز كمبيوتر يسمح لتحوير الضغط المستخدمة لأداء حقن السوائل. الكواشف يمكن تخزينها في خزان السوائل ، والتي ترتبط مباشره إلى منظم الضغط. تطبيق الضغط علي الخزان يجبر السائل من الخزان عن طريق أنابيب منفذ. ويمكن توصيل هذه الأنابيب منفذ مباشره إلى واحده من مداخل السائل من الجهاز ميكروفلويديك باستخدام دبوس موصل الفولاذ المقاوم للصدا. في حاله ان حجم كاشف غير قادر علي الوصول إلى خزان السوائل ، وأنابيب ماخذ يعمل كخزان لكاشف. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم. الشكل 4 نظره عامه علي نظام التبريد المستخدمة لتبريد الكواشف رد الفعل. (يسار) اعداد التبريد المعزول و (اليمين) اعداد التبريد وضعت داخل المجهر ومتصلة بالجهاز ميكروفلويديك. ويستخدم عنصر peltier لتبريد الحل رد فعل ivtt قبل الحقن في الجهاز ميكروفلويديك. يتم تخزين الكاشف داخل أنابيب PTFE ملفوفه علي الوجه البارد للعنصر Peltier. ويستخدم طول الأنابيب نظره خاطفه لنقل السوائل المبردة إلى الجهاز ميكروفلويديك ، مع القطر الداخلي الصغير (0.005 “) التقليل من حجم الكاشف لم يعد يجري تبريده. إلى جانب الأنابيب PTFE ملفوف ، يتم وضع الثرمستور ، مما يسمح لمراقبه درجه الحرارة في الوقت الحقيقي علي سطح العنصر peltier. الجهد يطبق إلى [بلتير] ثبتت مثل ان السطح درجه حرارة من [بلتير] يبقي بين 0 [ك] و 4 [ك.]. لأزاله الحرارة الزائدة التي تنتجها العنصر Peltier ، يتم وضع الوجه الساخن من Peltier ضد كتله تبريد المياه ، مع أضافه سيليكون الحرة الشحوم بالوعة الحرارة ضمان نقل الحرارة الأمثل بين الوجهين. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم. الشكل 5 نظره عامه علي تصميم الجهاز ميكروفلويديك. مفاعل تدفق ميكروفلويدريك لردود الفعل المستمرة IVTT يتكون من ثمانيه حلقات المفاعل ، ولكل منها حجم 10.7 nL. تسعه مداخل تسمح لتدفق تسعه حلول رد فعل فريدة من نوعها في الجهاز. 24 قناه تحكم تنظم تدفق السوائل داخل الجهاز. وتشكل قنوات التحكم من 9 إلى 14 مجموعه معدده. يجب ان تكون قنوات التحكم هذه مضغوطه في جميع الأوقات لمنع تدفق السوائل إلى الجهاز. الاكتئاب من اثنين من قنوات التحكم في وقت واحد يسمح لتدفق كاشف واحد. وتستخدم قنوات التحكم 15 و 16 و 17 لبيريستالتيكالي ضخ الكواشف في الجهاز بطريقه مضبوطة. قنوات التحكم من 18 إلى 25 كل عنصر تحكم مدخل أحد المفاعلات الثمانية الموجودة داخل الجهاز. قناه التحكم 26 يمكن إغلاق قناه دافق ، التالي إجبار السوائل في المفاعلات. تحكم قناه 27 الإيدز في ملء متجانسة من المفاعلات. وتنظم قنوات التحكم 28 و 29 منافذ المفاعلات الحلقية ومنفذ الجهاز الوحيد علي التوالي. وأخيرا ، تستخدم قنوات التحكم 1 و 2 و 3 لبيريستالتيكالي ضخ السائل داخل المفاعلات الحلقية ، مما يؤدي إلى خلط الكواشف. التصميم من هذا [ميكروفلوريك] جهاز والرقم علي حد سواء يكيف من [نايدرهولتممير] [آت.].29. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم. الشكل 6 الغشاء القائم علي صمام داخل الجهاز ميكروفلويديك. ا) قناه تدفق داخل الجهاز ميكروفلويديك. يمكن رؤية قناتي تحكم في الخلفية. هذه القناات ليست الضغط وعلي هذا النحو الصمامات مفتوحة (السائل يمكن ان تتدفق). ب) تم ضغط قناتي التحكم المتقاطعتين لقناات طبقه التدفق ، وإغلاق الصمامات (اي ان تدفق السوائل يعوق). عند الضغط علي قنوات التحكم ، يتم تحويل غشاء PDMS الرقيق الذي يفصل بين قنوات طبقه التدفق والتحكم إلى الأعلى (طبقه التحكم تقع تحت طبقه التدفق) التي تغلق قناه طبقه التدفق. ان تقريب قناه طبقه التدفق أمر بالغ الاهميه في ضمان ان الغشاء المفرغ يغلق تماما قناه التدفق. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم. الشكل 7 واجهه المستخدم المستخدمة للسيطرة علي الجهاز ميكروفلويديك. في جميع انحاء هذا البحث ، تم استخدام واجهه التحكم المخصصة للسيطرة علي تدفق السوائل داخل الاجهزه ميكروفلويديك. تسمح الواجهة للمستخدمين بالتشغيل الفردي لكل قناه من قنوات التحكم (مرقمه 1-3 و 9-29) ، أو لتنفيذ بروتوكولات متقنه تؤدي إلى التنظيف والتحميل للكواشف ، ومعايره الجهاز ميكروفلويديك ، وتنفيذ التجارب. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم. الشكل 8 نتائج تجربه المعايرة. واثناء تجربه المعايرة ، تمتلئ المفاعلات بالفلور (25 ميكرومتر FITC-ديكسسين) وبعد ذلك يتم تسجيل كثافة الفلورية. وبعد ذلك ، تتبع سلسله من التخفيفات ، حيث يستخدم عدد محدد من خطوات التدفق (15) لضخ المياه الفائقة النقاء في المفاعلات. بعد كل تخفيف ، يتم خلط الكواشف ويقاس فلوري. ويكشف الانخفاض في كثافة الفلورية لكل تخفيف حجم حلقه المفاعل التي شردت للعدد المحدد من خطوات التدفق ؛ قيمه تسمي نسبه التحديث. ( ا) يظهر متوسط الكثافة والانحراف المعياري لجميع المفاعلات الثمانية باللون الأحمر ، مع اثار الكثافة الفردية المبينة باللون الرمادي. ب) يتم عرض متوسط نسبه التحديث والانحراف المعياري لكل خطوه تخفيف باللون الأحمر. وتظهر نسب التحديث الفردية لكل مفاعل علي حده باللون الرمادي. هو يستطيع كنت رايت ان سبعه من الثمانية مفاعلات يبدي تصرف مماثله جدا, ولكن واحده مفاعل يبدي تقلبات في التحديث نسبه بعد السابعة تخفيف دوره. وهذا يسلط الضوء علي الحاجة إلى نسب التحديث الفريدة لكل من المفاعلات ، بدلا من استخدام متوسط معدل التحديث لحقن الكواشف في المفاعلات. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم. الشكل 9 نتائج تجربه IVTT التعبير عن بروتين deGFP. وقد بدات رده فعل طويلة لل IVTT بحيث يتم تشريد 30 ٪ من حجم المفاعل كل 14.6 دقيقه. سمحت الرد فعل كان ان يركض ل علي 16 ساعات قبل يكون ينهي. واستخدم مفاعلان من الجهاز الميكروفلوريك كفراغين ، ولم يتم نقل سوي الماء الفائق النقاء عبر المفاعلات طوال التجربة (المفاعلان 1 و 5). وكانت جميع المفاعلات الأخرى تتالف من 75 في المائة من محلول رد الفعل IVTT و 25 في المائة من المياه الفائقة النقاء (المفاعلان 2 و 6) أو 2.5 نيوتن متر من قوالب الحمض النووي الخطي للتعبير عن المفاعلات (3 و 4 و 7 و 8). في جميع المفاعلات الاربعه حيث تم أضافه الحمض النووي ، وهناك التعبير deGFP واضحة. وتوفر ثلاثه من المفاعلات الاربعه كثافة مضانه مماثله ، مع مفاعل واحد يعرض اشاره فلورية اقل. ويمكن ان يحدث ذلك بسبب التفاوت في التدفق الناتج عن انخفاض الحمض النووي الذي يدخل المفاعل ، أو بسبب الاختلافات في ابعاد المفاعل. وبعد 14 ساعة ، تظهر زيادة مفاجئه في اشاره المفاعلات التي تحتوي علي الحمض النووي. ويحدث هذا بسبب فقاعه الهواء التي تدخل طبقه التدفق من الجهاز ميكروفلويديك ، يفترض ان تنشا من واحده من حلول التدفق الداخلي. ان محاصره الهواء في الجهاز ميكروفلويديك يحد بشكل كبير من تدفق السوائل من خلال القناات ، حيث لا يمكن أضافه الكواشف الطازجة إلى أو ازالتها من المفاعلات حتى الهواء قد مرت. وعند استئناف التدفق ، تعود التجربة إلى شدتها السابقة الفلورية. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم. ملفات اضافيه. يرجى النقر هنا لتحميل هذه الملفات. 

Discussion

وقد تم تقديم جهاز ميكروفلويدريك متعدد الطبقات يستند إلى PDMS ، وقد تم إثبات قدرته علي الحفاظ علي ردود فعل IVTT لفترات طويلة من الزمن. وعلي الرغم من ان هذه التكنولوجيا مناسبه تماما لهذا المثال المحدد ، فانه يمكن تصور استخدامها في العديد من التطبيقات الأخرى. السيطرة اضافيه علي تدفق السوائل-يقترن مع القدرة علي تجديد باستمرار الكواشف رد الفعل في حين أزاله (by) المنتجات-مثاليه لردود الفعل التوليف المستمر ، والتحقيق في مختلف السلوكيات الحيوية ، وفي وقت واحد التوصيل من الاختلافات متعددة من رد فعل واحد.

وعلي الرغم من عمليه التصنيع المباشرة نسبيا للاجهزه القائمة علي PDMS ، فان استخدامها يتطلب اعدادا واسعا من الاجهزه. وتشمل صفائف الصمامات ، ومنظمو الضغط ، ومضخات الضغط ، والحاضنات ، ووحدات التبريد ، والانتقال من التصنيع إلى الاستخدام ليس ابتدائيا ، ويتطلب استثمارا أوليا كبيرا. الاضافه إلى ذلك ، فان القدرة علي أقامه وتنفيذ تجارب ناجحه باستمرار مع هذه الاجهزه تتطلب استثمارا كبيرا في الوقت ؛ نقطه التي تهدف هذه المخطوطة إلى معالجتها. ومع ذلك ، مره واحده في المكان ، يمكن تعديل الاعداد بأكمله لمجموعه من الأغراض. وعلاوة علي ذلك ، فان اعداد الاجهزه يضم العديد من العناصر النمطية ، ويمكن توسيع كل منها للسماح باستخدام تصاميم الاجهزه الصغيرة الأكثر تعقيدا. الاضافه إلى ذلك ، فان التصميم المعياري يتيح استبدال مكونات الاجهزه ببدائل تعمل بشكل مماثل ، بحيث لا يقتصر المستخدمون علي الاعداد المحدد الموصوف هنا48،49.

يمكن ان يؤدي التباين بين الاجهزه الفردية ، وفي الظروف الخارجية (مثل تقلبات الضغط) إلى عدم الدقة عند اجراء التجارب باستخدام هذه الاجهزه. لمعالجه هذه المشكلة ، يجب اجراء معايره النظام قبل كل تجربه ، وتوفير نسبه تحديث فريدة لكل من المفاعلات. بينما تعالج المعايرة الاختلافات بين الجهاز والتجربة ، فهي عمليه تستغرق وقتا طويلا ولا تشوبها شائبه. لن تتدفق السوائل مع الفضول المختلفة مع نفس المعدل عند التعرض للضغط متطابقة ، وعلي هذا النحو أداء المعايرة مع الكواشف متعددة قد لا تسفر عن معدلات تحديثمتطابقة. ويخفف هذا التاثير من خلال الاستفادة من ثلاث قنوات التحكم بيريستالتيكالي ضخ الكواشف في الجهاز ميكروفلويديك ، بدلا من تنظيم التدفق عن طريق متفاوتة الضغط المقدمة فقط. كملاذ أخير في الحالات التي يكون فيها التفاوت في اللزوجة كبيرا جدا ، يمكن تطبيق نسبه التحديث الفريدة لكل كاشف فردي عن طريق اجراء تجارب معايره متعددة.

ان استخدام المضخة التمعجيه لحقن الكواشف في جهاز ميكروفلويدريك يخفف من اثار استخدام المحاليل مع الفضول المتفاوت ، ولكنه يخلق أيضا مشكله ثانويه. باستخدام خطوات منفصلة لضخ السوائل في الجهاز ميكروفلويديك ، يعني ان حل الحقن في مفاعل واحد ، محدوده بحجم حقن عند أداء دوره مضخة واحده. ضمن بحثنا هذه القيمة-تحديد خلال المعايرة-يساوي تقريبا 1 ٪ ، مشيرا إلى ان دوره مضخة واحده التفكك تقريبا 1 ٪ من حجم المفاعل (حوالي 0.1 nL). علي هذا النحو ، وتشريد 30 ٪ من حجم المفاعل يتطلب تنفيذ 30 دورات مضخة ، مع 23 دورات مضخة من الحل رد فعل ivtt المضافة ، وفقط 7 دورات مضخة من الحمض النووي أو المياه نقاء المضافة. وعلي الرغم من ان البروتوكولات التجريبية البديلة كافيه لبحثنا ، فقد تواجه مشاكل عند محاولة أضافه اعداد أكبر من الكواشف الفريدة ، أو استخدام جزءاقل من التحديث ، أو أضافه كميات أصغر من كاشف واحد إلى مفاعل. في مثل هذه الحالات ، يمكن تكييف تصميم جهاز ميكروفلويدريك لتوفير المفاعلات مع حجم أكبر. ويرد مثال علي ذلك في نيدرهولتماير وآخرون36.

وبشكل حاسم ، فان الجهاز المبين في هذه المخطوطة يسمح باستمرار ردود الفعل لفترات طويلة مما يؤدي إلى معدلات النسخ والترجمة الثابتة للدولة. عن طريق حقن الكواشف الجديدة بشكل دوري في المفاعلات-وأزاله ردود الفعل (من قبل) المنتجات-ردود الفعل المستدامة ويمكن رصد السلوكيات الديناميكية المعقدة. وبهذه الطريقة ، تم إنشاء منصة ان-إلى حد ما-يقلد البيئة الخلوية. وعلاوة علي ذلك ، تمكن هذه المنصة استكشاف ديناميات النظام ، من خلال تكييف الفترة بين الحقن وتكوين محدد من الحقن. ونتيجة لذلك ، فان هذه الاجهزه المجهرية متعددة الطبقات هي أداه قويه لتوصيف وتحسين الشبكات الاصطناعية الجديدة التي تعرض السلوك الديناميكي المعقد.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وقد حظي هذا العمل بدعم من مجلس البحوث الأوروبي ، وهو المشروع 677313 الذي منحته المنظمة الهولندية للبحوث العلمية (NWO, 723.016.003) ، والممول من وزاره التعليم والثقافة والعلوم (الجاذبية برامج, 024.001.035 & 024.003.013), برنامج العلوم الحدود البشرية منحه RGP0032/2015, المجلس الأوروبي للبحوث في اطار الاتحاد الأوروبي الأفق 2020 برنامج البحوث والابتكار منحه 723106, ومنحه مؤسسه العلوم الوطنية السويسرية 200021_182019.

Materials

Reagents
Acetone VWR 20063.365
AZ 40 XT Merck KGaA (Darmstadt, Germany) – Positive Photoresist
AZ 726 MIF Developer Merck KGaA (Darmstadt, Germany) – Developer Positive Photoresist
Isopropanol Merck KGaA (Darmstadt, Germany) 109634
Microscope slides VWR ECN 631-1550
mr Dev 600 Microresist Technology GmbH (Berlin, Germany) – Developer Negative Photoresist
Silicon Free Heat Sink Grease Circuit Works CW7270 Thermal Compound
Silicon wafers Silicon Materials – <1-0-0> orientation, 100 mm diameter, 525 µm thickness
SU-8 3050 Microchem Corp. (Newton, MA) – Negative Photoresist
Sylgard 184 Elastomer Kit (PDMS) The Dow Chemical Company 01317318
trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane Sigma-Aldrich 448931-10G
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
4 channel digital input/output module WAGO Kontakttechnik GmbH 750-504 8x
Camera lens The Imaging Source –
Compression fitting Koolance, Inc. FIT-V06X10 Fitting for tubing with 6mm ID and 10mm OD. 4x
Controller end module WAGO Kontakttechnik GmbH 750-600
Device connecting tubing Saint-Gobain Performance Plastics AAD04103 0.02" ID, 0.06" OD, Tygon Tubing (ND-100-80)
Device connector pins Unimed SA (Lausanne, Switserland) 200.010-A AISI 304 tubing, 0.35mm ID, 0.65mm OD, 8mm L
Ethernet Controller WAGO Kontakttechnik GmbH 750-881
Female bus connector Encitech DTCK15-DBS-K 15 pole female bus connector
Fluid reservoirs Fluigent Fluiwell-4C
Fluigent pressure system Fluigent MFCS-EZ 0 – 345 mbar
Hg short arc lamp Advanced Radiation Corporation – 350W
Hot plate Torrey Pines Scientific HP61
Inverted microscope Nikon Instruments Eclipse Ti-E
LabVIEW Software de Greef Lab, Eindhoven University of Technology https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software
Liquid coolant Koolance, Inc. LIQ-705CL-B
Luer stubs Instech Laboratories, Inc. LS23
Male Luer to barb connectors Cole Parmer 45505-32 3/32" ID
Matlab Software de Greef Lab, Eindhoven University of Technology https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software
Microcamera The Imaging Source DMK 42AUC03
Microscope camera Hamamatsu Photonics OrcaFlash4.0 V2 (C11440-22CU)
Orbital shaker Cole Parmer EW-513000-05
Oven Thermo Scientific Heraeus T6P 50045757
Oxygen plasma asher Quorum Technologies K1050X
PDMS puncher SYNEO Accu-Pucnh MP10
PEEK tubing Trajan 1301005001-5F 0.005" ID, 1/32" OD, Red
Peltier element European Thermodynamics APH-127-10-25-S
Peltier temperature controller Warner Instruments CL-100
Photomask CAD/Art Services, Inc. –
Photomask Design Maerkl Lab, EPFL https://zenodo.org/record/886937#.XBzpA8-2nOQ
Pneumatic valve array FESTO – 1x 22 valve array and 1x 8 valve array, Normally closed valves.
Power adapter Koolance, Inc. ADT-EX004S 110/220V AC Power Adapter
PTFE tubing Cole Parmer 06417-21 #24 AWG Thin Wall PTFE
Punching pin SYNEO CR0320245N21R4 OD: 0.032" (0.8128 mm), ID: 0.024" (0.6090 mm)
PVC Tubing Koolance, Inc. HOS-06CL 6 mm ID, 10 mm OD
Single edge blades GEM Scientific –
Soft tubing Fluigent – Supplied with fluid reservoirs. (1 mm ID, 3mm OD)
Spin coater Laurell Technologies Corporation WS-650MZ-23NPPB
Stereo microscope Olympus Corporation SZ61
Thermistor cable Warner Instruments TA-29 Cable with bead thermistor
UV exposure system ABM, USA – Near UV Exposure System, 350W
Vacuum pump Vacuumbrand GmbH MD1C
Water cooled cold plate block Koolance, Inc. PLT-UN40F
Water cooler Koolance, Inc. EX2-755
Weighing scales Sartorius M-prove
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. van Roekel, H. W. H., et al. Programmable chemical reaction networks: emulating regulatory functions in living cells using a bottom-up approach. Chemical Society Reviews. 44, 7465-7483 (2015).
  2. Hori, Y., Kantak, C., Murray, R. M., Abate, A. R. Cell-free extract based optimization of biomolecular circuits with droplet microfluidics. Lab on a Chip. , (2017).
  3. Del Vecchio, D., Sontag, E. D. Dynamics and control of synthetic bio-molecular networks. Proceedings of the American Control Conference. , 1577-1588 (2007).
  4. Purnick, P. E. M., Weiss, R. The second wave of synthetic biology: from modules to systems. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 410-422 (2009).
  5. Padirac, A., Fujii, T., Rondelez, Y. Bottom-up construction of in vitro switchable memories. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, E3212-E3220 (2012).
  6. Guido, N. J., et al. A bottom-up approach to gene regulation. Nature. 439, 856-860 (2006).
  7. Genot, A. J., Fujii, T., Rondelez, Y. In vitro regulatory models for systems biology. Biotechnology Advances. 31, 789-796 (2013).
  8. Elowitz, M. B., Leibler, S. A synthetic oscillatory network of transcriptional regulators. Nature. 403, 335-338 (2000).
  9. Gardner, T. S., Cantor, C. R., Collins, J. J. Construction of a genetic toggle switch in Escherichia coli. Nature. 403, 339-342 (2000).
  10. Montagne, K., Plasson, R., Sakai, Y., Fujii, T., Rondelez, Y. Programming an in vitro DNA oscillator using a molecular networking strategy. Molecular Systems Biology. 7, 466-466 (2014).
  11. Khalil, A. S., Collins, J. J. Synthetic biology: applications come of age. Nature Reviews Genetics. 11, 367-379 (2010).
  12. Hockenberry, A. J., Jewett, M. C. Synthetic in vitro circuits. Current Opinion in Chemical Biology. 16, 253-259 (2012).
  13. Del Vecchio, D. Modularity, context-dependence, and insulation in engineered biological circuits. Trends in Biotechnology. 33, 111-119 (2015).
  14. Cardinale, S., Arkin, A. P. Contextualizing context for synthetic biology – identifying causes of failure of synthetic biological systems. Biotechnology Journal. 7, 856-866 (2012).
  15. Venturelli, O. S., et al. Programming mRNA decay to modulate synthetic circuit resource allocation. Nature Communications. 8, 1-11 (2017).
  16. Scott, M., Mateescu, E. M., Zhang, Z., Hwa, T. Interdependence of cell growth and gene expression: origins and consequences. Science. 330, 1099-1103 (2010).
  17. Borkowski, O., Ceroni, F., Stan, G. B., Ellis, T. Overloaded and stressed: whole-cell considerations for bacterial synthetic biology. Current Opinion in Microbiology. 33, 123-130 (2016).
  18. Liao, C., Blanchard, A. E., Lu, T. An integrative circuit-host modelling framework for predicting synthetic gene network behaviours. Nature Microbiology. , (2017).
  19. Noireaux, V., Bar-Ziv, R., Libchaber, A. Principles of cell-free genetic circuit assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 12672-12677 (2003).
  20. Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nature Biotechnology. 19, 751-755 (2001).
  21. Oberholzer, T., Nierhaus, K. H., Luisi, P. L. Protein expression in liposomes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 261, 238-241 (1999).
  22. Yelleswarapu, M., et al. Sigma factor-mediated tuning of bacterial cell-free synthetic genetic oscillators. ACS Synthetic Biology. 7, (2018).
  23. Karig, D. K., Iyer, S., Simpson, M. L., Doktycz, M. J. Expression optimization and synthetic gene networks in cell-free systems. Nucleic Acids Research. 40, 3763-3774 (2012).
  24. Dunlop, M. J., et al. Distinct timescales of RNA regulators enable the construction of a genetic pulse generator. Biotechnology and Bioengineering. , (2019).
  25. Yoshiyama, T., Ichii, T., Yomo, T., Ichihashi, N. Automated in vitro evolution of a translation-coupled RNA replication system in a droplet flow reactor. Scientific Reports. 8, 1-8 (2018).
  26. Iyer, S., Karig, D. K., Norred, S. E., Simpson, M. L., Doktycz, M. J. Multi-input regulation and logic with T7 promoters in cells and cell-free systems. PLoS ONE. 8, 1-12 (2013).
  27. de los Santos, E. L. C., Meyerowitz, J. T., Mayo, S. L., Murray, R. M. Engineering Transcriptional Regulator Effector Specificity Using Computational Design and In vitro Rapid Prototyping: Developing a Vanillin Sensor. ACS Synthetic Biology. 5, 287-295 (2016).
  28. Guo, S., Murray, R. M. Construct functional feedforward loop biological circuits in a cell-free system and in cells. ACS Synthetic Biology. , (2019).
  29. Hughes, R. A., Ellington, A. D. Synthetic DNA synthesis and assembly: putting the synthetic in synthetic biology. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9, (2017).
  30. Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. The all E. coli TX-TL toolbox 2.0: A platform for cell-free synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5, 344-355 (2016).
  31. Takahashi, M. K., et al. Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions. Methods. 86, 60-72 (2015).
  32. Lee, J. W., et al. Creating single-copy genetic circuits. Molecular Cell. 63, 329-336 (2016).
  33. Gibson, D. G., et al. Complete chemical synthesis, assembly, and cloning of a mycoplasma genitalium genome. Science. 319, 1215-1220 (2008).
  34. Sun, Z. Z., Yeung, E., Hayes, C. A., Noireaux, V., Murray, R. M. Linear DNA for rapid prototyping of synthetic biological circuits in an Escherichia coli based TX-TL cell-free system. ACS Synthetic Biology. 3, 387-397 (2014).
  35. Georgi, V., et al. On-chip automation of cell-free protein synthesis: new opportunities due to a novel reaction mode. Lab on a Chip. 16, 269-281 (2016).
  36. Niederholtmeyer, H., Stepanova, V., Maerkl, S. J. Implementation of cell-free biological networks at steady state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15985-15990 (2013).
  37. Spirin, A. S., Baranov, V. I., Ryabova, L. A., Ovodov, S. Y., Alakhov, Y. B. A continuous cell-free translation system capable of producing polypeptides in high yield. Science. 242, 1162-1164 (1988).
  38. Karzbrun, E., Tayar, A. M., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. Programmable on-chip DNA compartments as artificial cells. Science. 345, 829-832 (2014).
  39. Timm, A. C., Shankles, P. G., Foster, C. M., Doktycz, M. J., Retterer, S. T. Toward microfluidic reactors for cell-free protein synthesis at the point-of-care. Small. 12, 810-817 (2016).
  40. Doktycz, M. J., Foster, C. M., Retterer, S. T., Timm, A. C., Shankles, P. G. Characterization of extended channel bioreactors for continuous-flow protein production. Journal of Vacuum Science & Technology B, Nanotechnology and Microelectronics: Materials, Processing, Measurement, and Phenomena. 33, 06FM02 (2015).
  41. Khnouf, R., Beebe, D. J., Fan, Z. H. Cell-free protein expression in a microchannel array with passive pumping. Lab on a chip. 9, 56-61 (2009).
  42. Siuti, P., Retterer, S. T., Doktycz, M. J. Continuous protein production in nanoporous, picolitre volume containers. Lab on a Chip. 11, 3523-3529 (2011).
  43. Kaminski, T. S., Scheler, O., Garstecki, P. Droplet microfluidics for microbiology: techniques, applications and challenges. Lab on a Chip. 16, 2168-2187 (2016).
  44. Shin, J., Noireaux, V. An E. coli cell-free expression toolbox: Application to synthetic gene circuits and artificial cells. ACS Synthetic Biology. 1, 29-41 (2012).
  45. Niederholtmeyer, H., et al. Rapid cell-free forward engineering of novel genetic ring oscillators. eLife. 4, 1-18 (2015).
  46. Galas, J., Haghiri-Gosnet, A. -. M., Estévez-Torres, A. A nanoliter-scale open chemical reactor. Lab on a Chip. 13, 415-423 (2013).
  47. Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. Monolithic Microfabricated Valves and Pumps by Multilayer Soft Lithography. Science. 288, 113-116 (2004).
  48. Brower, K., et al. An open-source, programmable pneumatic setup for operation and automated control of single- and multi-layer microfluidic devices. HardwareX. 3, 117-134 (2018).
  49. White, J. A., Streets, A. M. Controller for microfluidic large-scale integration. HardwareX. 3, 135-145 (2018).

Tags

Microfluidic PlatformCell-free Gene ExpressionSynthetic Gene NetworksPrototypingGFPBiochemical ReactionsFlow ReactorPneumatic ControlPeltier CoolingPTFE TubingPEEK TubingTemperature Control

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
van der Linden, A. J., Yelleswarapu, M., Pieters, P. A., Swank, Z., Huck, W. T. S., Maerkl, S. J., de Greef, T. F. A. A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression. J. Vis. Exp. (152), e59655, doi:10.3791/59655 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image