マイクロパターンと定量イメージングを用いた哺乳類細胞の新しい空間組織のマッピング

注: メソッドの概要は、図1に示されています。 1. マスクデザイン Azioune et al.18に記載されているガイドラインに従ってフォトマスクを設計します。この調査で使用したソフトウェアおよびマスクの製造元を参照する場合は、材料の表を参照してください。注: 1 つのマスクで複数のジオメトリ、サイズ、または図形間の間隔を作成できます。UVランプは49までの異なった設計(2 cm x 2 cmの切りくずを仮定する)を含むことができる15 cmのフォトマスクを合わせることができる。 2. マイクロパターン製造手順 必要な材料を準備します。 リン酸緩衝生理食生(PBS)に0.1%ポロクサマー407(10mLの10mg)の溶液を調べ、室温でシェーカーに残します。ポロクサマー407は溶解するのに約20分かかります。 10cm角のペトリ皿の底に実験室フィルム(材料の表を参照)を置きます。これは、マトリックス堆積のためのチャンバとして使用されます。 フォトマスクの表面を100%アセトンで洗浄し、次に100%イソプロパノールで、最後にddH2Oで清掃します。可能であれば、フォトマスクを空気乾燥するか、清潔なペーパータオルでマスクを乾かしてください。 フォトマスクとまったく同じサイズの正方形、硬質、不透明なプラスチック片を準備します(後で「ホルダー」と呼ばれます)。注:これは、照明ステップ中にフォトマスクに接触してプラスチックカバースリップを維持するために使用されます。 UVOランプをオンにし、10分間ウォーミングイルミネーションを実行します。 フォトパターンチップを作成します。注:任意のサイズのチップを作成するために手順を適応させることが可能です。わかりやすくするために、ここでは 12 mm の丸いマイクロパターンチップを生成する手順について説明します。 12 mm の穴パンチを使用して、疎水性プラスチック スライドをカットして 12 mm のラウンド カバースリップを作成し、きれいな新しいペトリ皿に入れます。注意:これは表面処理に損傷を与える可能性があるため、プラスチックの表面との皮膚接触を避けるために、常に手袋を使用してください。 ピンセットでカバースリップから保護フィルムを慎重に取り外します。注: 種まき手順 (セクション 3) 中にチップ上のセルの配置に影響を与える可能性があるため、プラスチック表面を損傷しないようにしてください。 フォトマスクを清潔で安定した表面(例えば、フォトマスクボックス)に置き、クロム側を上向きに置き、目的のチップ設計の位置にddH2 Oの2 μLドロップを追加します。 ddH2Oのドロップにカバースリップを置き、穏やかに押します。注:フォトマスクに面するプラスチック側が、前の手順で取り外したフィルムによって保護された側であることを確認します。 プラスチック製のスライドの上にホルダーを置き、フォトマスクに接触するプラスチック片を維持するためにクランプでこのサンドイッチを慎重に固定します。注:プラスチック製のスライドがフォトマスクの表面と接触して完全に維持されるように、クランプをプラスチックスライドの位置にできるだけ近づけます。 アセンブリを光源から約2cmのUVOランプに入れ、10分間点灯します。注:光の電力は、チップがソースから2cmの距離に置かれると、波長254nmで6 mW/cm2と推定されます。 底面にフォトマスクでサンドイッチを保持し、サンドイッチを分解しながらスライドが動き回るのを防ぐために、片手で圧力を維持しながらクランプを慎重に取り外します。ホルダーを取り外し、すべてのプラスチック片がマスクの上にあり、ホルダーにくっついないようにします。 チップの上にddH2Oを追加し、フォトマスクからチップをそっと取り外します。メモ:プラスチックチップがフォトマスクに貼り付いている場合は、チップが突然取り外された場合に備えて、チップの上にピンセットを少し上に保持しながら、プラスチックピペットチップを使用してチップを取り外します。 最後に、マトリックス蒸着室内にフォトパターンチップを配置します。メモ:チップの照らされた側面が上向きであることを確認します。 マトリックスを堆積します。注:このセクションのすべての手順は、組織培養フードで行う必要があります。 ポロクサマー407溶液を0.22 μmポリエテルスルホン(PES)フィルターで濾過します。 無菌濾過ポロクサマー407とゼラチンの1mg/mLの500 μg/mLを混合してECMコーティング溶液を調出します。注: その他の ECM 分子の可能性のある追加情報については、表 1も参照してください。 各照らされたチップに200 μLのコーティング溶液を加えます。実験室用フィルムは、落下がチップの外に落ちるのを防ぎます。 蒸発を制限し、一晩4°Cでチップと一緒に置くためにddH2Oで満たされた3センチペトリ皿を追加します。 3. 播種手順 注:以下に説明するステップは、標準的なmESC培地を用いてCGR8マウス胚性幹細胞(mESC)24用に最適化されています(材料の表も参照)。ただし、原則として、任意の細胞型に対して手順を適応させることが可能です。また、マウス胚性幹細胞の従来の細胞培養は、広範な文書化が他の場所で見出すことができるとしてここに記載されていないことにも注意してください25. コーティング溶液を吸引し、滅菌PBSで少なくとも5分間チップを2回インキュベートします。 その間、温暖培地中に5.5 x 105セル/mLの細胞懸濁液を調用する。 各チップ上の細胞懸濁液のピペ200 μL(約100,000セル/cm2)。 播種室を閉じ、細胞をインキュベーターに1時間付着させたままにする。 1時間後、マルチウェルプレート(チップ数に応じて4ウェルまたは24ウェルプレート)のウェルを500μL/ウェルの温かい媒体で充填し、チップを無菌ピンセットでプレートに移します。 非付着細胞を取り外すためにプレートを激しく振ります。培地を吸引し、すぐに新鮮な暖かい媒体に置き換えます。顕微鏡下でパターニングが見えるかどうかを確認します(図2a)。注: mESC または他のマトリックスタンパク質以外の細胞株を使用する場合は、接着時間を最適化する必要がある場合があります (表 2も参照)。 図 2a に示すようにパターンがはっきりと見えるまで、この手順を繰り返します。注: この手順は重要であり、手順の成功を決定します。強すぎる洗浄手順は、細胞を剥離し、対照的に不十分な洗浄は、パターンの間に付着した細胞を残す可能性がある(図2c,d)。 4. 固定 注:培養中の48時間後、細胞はパターンの形状に厳密に従う密集したコロニーを形成する必要があります(図2bに示すように)。 プレートにチップを残し、媒体の約90%を取り出し、チップが乾燥するのを防ぐのに十分な培地を残します。注:チップがアーティファクトの汚れを避け、表面からの細胞の剥離を防ぐために、チップが決して乾燥しないようにすることが重要です。接着パターン間のチップ表面の疎水性のために、チップは脱濡れする傾向を持ち得る。この段階では、固定剤は、大きなドーム型コロニーがチップから切り離される可能性があります。ワッシュは非常に穏やかで、理想的には、チップに直接ではなく、井戸の側面に液体をピペッティングすることによって行われるべきです。 ウェルあたり少なくとも500 μLのパラホルムアルデヒド(PFA)ベースの固定溶液をウェルごとに追加し、10分間インキュベートします。注:コロニーが特に厚く(5セル層以上)に見える場合は、固定時間を20分に調整する必要がある場合があります。 固定後、洗浄液(0.01%ポロクサマー407付PBS)で3回洗浄する。洗浄液中に希釈された50mM NH4Clを用いた余分な洗浄は、残留PFA架橋活性をクエンチするためにインターカレータされてもよい。 ブロッキング溶液で少なくとも30分間サンプルをインキュベートします。注:この段階では、サンプルは染色の約1週間前に4°Cで保存されてもよい。その場合は、蒸発を防ぐために、実験室用フィルムでプレートを密封してください。 5. 免疫染色 10cm角ペトリ皿の底に実験室用フィルムのシートを配置することにより、染色室を準備します。 抗体溶液を調記します(この記事で使用される抗体と希釈のリストについては、表3を参照)。 上向きの細胞を支える側でチップを染色室に入れ、直ちに100μLの一次抗体溶液をチップ上に加えます。注意:この段階では、チップはステップ4.1のように簡単に濡れ落ちるべきではありません。しかし、チップが乾燥しないことが重要であるため、注意が必要です。複数のチップを処理する必要がある場合は、各チップにステップ 5.3 を順番に適用します。 室温で回転プラットフォーム上で1時間インキュベートします。注:細胞が大きな3D構造を形成している場合、サンプルの均一な染色を可能にするために、より長いインキュベーション時間が必要な場合があります。インキュベーション時間は24時間まで増加してもよい。しかし、染色室は水で満たされた3cmの皿を含む必要があり、染色室は蒸発を防ぐために実験室フィルムで密封されなければなりません。 新鮮なマルチウェルプレートにチップを移し、洗浄液で3回洗浄します。 ステップ5.3および5.4に記載されているように、二次抗体を使用してインキュベーションを行う。 任意の標準的な取り付け媒体(例えば、Mowiol)の20 μLを使用して顕微鏡スライドにチップを取り付けます。 6. イメージング 注:イメージ投射は標準的な共焦点顕微鏡で行うことができる。ここでは、後続の定量分析に十分な画質を確保するための推奨事項のみを提供します。 注意: オペレータのバイアスを避けるために、画像へのコロニーは核エンベロープ信号を使用してのみ選択する必要があります(コロニーがパターンの形状に正しく従っているかどうかを確認します)。顕微鏡の設定を調整する場合を除き、目的のマーカーの信号をチェックすることは避けてください。 集録ビットの深さが 12 ビットまたは 16 ビットであることを確認します。 各画像チャンネルのダイナミックレンジを最大化するために、適切な設定を特定します。特に、画像のクリッピングは避けてください。 マイクロパターンの自己蛍光をイメージするチャネルを含めます(図3参照)。 画像サイズとズーム係数を調整して、X 軸と Y 軸で 0.1 ~ 0.6 μm のボクセル サイズと Z 軸の 0.2 ~ 2 μm の範囲を取得します。注:例えば、本研究では、40倍の目的(1.3に等しい数値絞り)、デジタルズームのない1024 x 1024ピクセルの画像サイズ、および0.5 μmのZステップサイズを持つ反転走査共焦点顕微鏡を使用しました。その結果、ボクセルサイズは0.38 μm x 0.38 μm x 0.5 μmでした。 コロニーごとに、Z 軸に沿った最小位置と最大位置を定義して、コロニー全体が取得されるようにします。信号が低い平面を少なくとも 1 つ、コロニーの上下に含める必要があります。 Z スタックの向きが常に取得されていることを確認します (常に上から下へ、または常に下から上に) スキャン速度、画像解像度、フレーム平均、検出器のゲインを調整して、画質と撮影時間の最適な値を特定します。その指標として、図3に示すように1つのコロニーに対する撮像時間は約2~3分であった。注意:すべての画像は、同等にするために、同じ目的と取得設定で同じ顕微鏡で取得する必要があります。 取得の最後に、すべてのイメージを保存し、各イメージが表す実験条件を識別するために一意の命名規則を割り当てます。注:例として図 4を参照してください。画像は、BioFormats 26でサポートされている任意の形式に保存されることがあります。コロニーが視野よりも大きい場合、ImageJのステッチプラグインは27を使用することができる。また、ステッチの場合は、イルミネーションロールオフ補正が必要になる場合があります。 7. 画像解析 注: この手順で推奨されるコンピュータの仕様は、16 GB RAM、マルチコア 3.33 GHz CPU、および少なくとも 50 GB のディスク領域 (イメージされたチップの数に応じて) です。ソフトウェアは、Linux、WindowsとMacOS上でテストされています。PickCellsは、複雑な多次元画像における細胞の集合的組織の分析に特化したグラフィックユーザーインターフェイスを備えたクロスプラットフォーム画像解析アプリケーションです(Blin et al.,)。PickCells に関する詳細情報と、ここで説明した特定のモジュールのドキュメントについては、オンラインで見つけることができます: https://pickcellslab.frama.io/docs/。また、我々はソフトウェアを改善し続けるにつれて、インターフェイスが変更されることに注意してください。インターフェイスが図またはビデオに示されているものと異なる場合は、オンラインマニュアルを参照してください。 オンラインで入手できるドキュメントに従って PickCells をインストールして実行します。 画像を読み込み、提供された情報の正確性を確認します (図4-1)。 各チャンネルの名前を文書化します。 Nessysモジュール28(図4-2)を用いた核エンベロープ信号に基づくセグメント核と、生成されたセグメント化された画像の名前を付けるために使用される接頭辞(例えば「核」)を提供する。注: 使用方法とパラメータ調整に関するドキュメントは、https://framagit.org/pickcellslab/nessysにあります。 セグメンテーション エディタ モジュール (図 4-3)を使用して、必要に応じてセグメンテーションを検査および編集する注: 何らかの理由でセグメンテーションプロセスで満足のいく結果が得られなかった場合は、データベース フォルダ内のイメージを手動で削除し、MetaModelビューの「セグメンテーション結果」ノードも削除します。次に、手順 7.4 と 7.5 を繰り返します。画像の小さなサブセットのみのセグメンテーションのみが満足のいく結果を提供しない場合は、Nessys スタンドアロン アプリケーション (7.4 のリンクを参照) を使用し、”障害のあるイメージ’ のセグメンテーションを試み、データベース フォルダ内の対応するファイルを置き換えます。 基本的なセグメンテーションモジュールを使用してパターン自動蛍光信号をセグメント化する(図4-4) 生成されたセグメント化されたイメージの名前に使用するプレフィックス (“パターン” など) を指定します。 自己蛍光信号を含むチャネルを選択します。 ノイズリダクションを適用します。一般に、カーネルサイズが 10 x 10 x 0.5 ボクセルのガウスフィルタを使用すると、満足のいく結果が生じます。 下限しきい値を設定して、背景が青色で表示され、前景が白く表示されるようにします。また、上限しきい値を最大値に設定して、最終結果 (赤い領域) から高い強度が除外されないようにします。 最後の手順でスキップを選択します。 [終了]をクリックし、すべてのイメージが処理されるまで待ちます。 核に関しては、セグメンテーションエディタモジュール(図4-5)を使用して、必要に応じてセグメンテーション結果を視覚的に検査し、修正できるようになりました。 核オブジェクトを作成し、基本的なオブジェクトフィーチャを計算します。 メイン インターフェイスの左側にあるタスク バーから組み込み機能モジュールを起動します (図 4-6)。 楕円体フィッターパネルとサーフェスエクストラクターパネルを閉じて、基本フィーチャーパネルのみを開いたままにします。 オブジェクトタイプとしてNucleusを選択し、ステップ7.4で示す接頭辞を「セグメント化された画像」に選択します。 「計算」を押して、すべてのイメージが処理されるまで待ちます。注: この手順の後、核セグメンテーションを再度編集することはできません。 パターン オブジェクトを作成し、基本的なオブジェクト フィーチャを計算します。手順 7.8.1 から 7.8.4 を繰り返し、今回のみ[カスタムタイプをオブジェクトタイプとして]を選択し、セグメント化されたイメージの場合はステップ 7.6.1 で指定したプレフィックスを選択します。注: この手順を行った後、パターンセグメンテーションを再度編集することはできません。 各核が属するイメージの名前を核属性として格納します。 [データ > 新しい属性]をクリックし、ポップアップ ダイアログで[Nucleus]を選択し、[OK] をクリックします。 ノードに接続されている他のオブジェクトからデータを収集するを選択し、[次へ]をクリックします。 左側のパネルで[イメージ]を選択し、パス定義パネルの[完了]フラグの下にある尋問マークをダブルクリックして、イメージノードをパスのターゲットとして設定します。 左側のパネルで[使用可能な属性]ペインを展開し、name 属性を選択します。 [縮小] 操作ペインを展開し、[1つを取得]を選択し、[変更]ボタンをクリックして [次へ]をクリックします。 「画像名」と入力し、タブキーを押して「OK」をクリックします。 核オブジェクトに「正規化座標」属性を作成します(図4-7)。 ステップ 7.10.1 から 7.10.6 に適応して、パターンの大セントロイドの座標を核属性として格納します。この新しい属性に名前を付けます”パターン座標”。 次に、[データ > 新しい属性]をクリックし、[Nucleus] をクリックし、[OK] をクリックします。 [ノードの空間ベクトルと方向ベクトルの間に関数を定義する] を選択し、[次へ]をクリックします。 関数の種類の場合は、配列操作を選択し、V1 で項目ベクトルを選択し、[高度]を選択し、V2 で項目ベクトルを選択し、パターン調整e を選択します。 [次へ]をクリックし、[名前]フィールドに「正規化された座標」と入力し、[終了]をクリックします。 タブ別の値ファイルにデータをエクスポートします。 8. R分析 Rstudio をダウンロードしてインストールします。注: ソフトウェア情報とダウンロード リンクは、https://www.rstudio.com/で入手できます。 この分析に必要な R スクリプトをダウンロードします。注: スクリプトは GitLab リポジトリからダウンロードできます: https://framagit.org/pickcellslab/hexmapr。 Rstudioを開けろ注: スクリプトを初めて実行する場合は、必要な R パッケージ (ggplot2 とスケール) をインストールします。 Rstudio から binnedmap_template を開きます。R スクリプト。 作業ディレクトリをソース ファイルの場所に設定します。 図 5に示すように、スクリプトを特定のデータセットに適合させる手順に従います。 スクリプトを実行して密度マップを生成します。