Il metodo qui presentato utilizza il micromodellamento insieme all’imaging quantitativo per rivelare l’organizzazione spaziale all’interno delle culture dei mammiferi. La tecnica è facile da stabilire in un laboratorio di biologia cellulare standard e offre un sistema trattabile per studiare patterning in vitro.
Un obiettivo fondamentale in biologia è capire come emergono i modelli durante lo sviluppo. Diversi gruppi hanno dimostrato che la creazione di modelli può essere realizzata in vitro quando le cellule staminali sono spazialmente confinate su micromodelli, creando così modelli sperimentali che offrono opportunità uniche per identificare, in vitro, i principi fondamentali della Organizzazione.
Qui descriviamo la nostra implementazione della metodologia. Abbiamo adattato una tecnica di fotomodellamento per ridurre la necessità di attrezzature specializzate per rendere più facile stabilire il metodo in un laboratorio di biologia cellulare standard. Abbiamo anche sviluppato un framework di analisi delle immagini gratuito, open-source e facile da installare per misurare con precisione il posizionamento preferenziale delle sottopopolazioni di cellule all’interno di colonie di forme e dimensioni standard. Questo metodo permette di rivelare l’esistenza di eventi di patterning anche in popolazioni di cellule apparentemente disorganizzate. La tecnica fornisce informazioni quantitative e può essere utilizzata per disaccoppiare le influenze dell’ambiente (ad esempio, segnali fisici o segnali endogeni), su un determinato processo di modellazione.
Nei sistemi dei mammiferi, il patterning è una proprietà emergente del comportamento collettivo delle cellule e quindi, i modelli possono formarsi in vitro se vengono forniti segnali appropriati alle celle1,2,3,4, 5 Del numero 3( , 6. Un modo per rivelare la capacità intrinseca delle cellule di auto-organizzarsi in vitro è quello di costringere le cellule a formare gruppi/colonie di forme e dimensioni definite7,8,9,10 . Una tecnica che consente questo è micropatterning11. La micropatterning consente di definire con precisione la posizione in cui le molecole di matrice extracellulare (ECM) vengono depositate su una superficie. Questo, a sua volta determina dove le cellule possono aderire e quindi controlla come le cellule si organizzano spazialmente.
Il micropatterning è una tecnica con numerose applicazioni, ad esempio il micropatterning consente la standardizzazione delle condizioni iniziali prima della differenziazione12. È importante sottolineare che il micropatterning consente di controllare facilmente le dimensioni, la forma e la spaziatura delle colonie cellulari e questa proprietà può essere utilizzata per elaborare esperimenti volti a interrogare la risposta collettiva delle cellule al morfogeno o ai segnali fisici7 , 8 (IN vio , 10 del sistema , 13 del sistema , 14 Del sistema , 15 Mi lasa del sistema , 16 , 17.
Sono stati sviluppati diversi metodi di micromodellazione11. Le tecniche di fotomodellazione sono forse i metodi più semplici per stabilire18. Questi approcci hanno anche il vantaggio di precisione in quanto possono essere utilizzati per controllare la forma delle singole celle18,19,20. Tuttavia, richiedono anche costose attrezzature specializzate, tra cui un rivestimento di spin, una camera al plasma e un detergente UVO (UV-Ozone) che generalmente non sono prontamente disponibili nei laboratori di biologia standard. Per facilitare l’adozione della tecnica, abbiamo adattato il protocollo per richiedere solo la lampada UVO. Iniziamo da vetrini di plastica disponibili in commercio che possono essere tagliati con forbici o con un foro per il formato desiderato.
Un’importante utilità dei micromodelli è la capacità di standardizzare le colonie al fine di confrontare le singole colonie tra più repliche. Questo permette di chiedere in che misura la formazione del modello all’interno di queste colonie è riproducibile, ed esplorare i fattori che influenzano la robustezza del processo di modellazione. È importante sottolineare che la quantificazione dei modelli “mediati” in più colonie standardizzate può anche rivelare processi di modellazione che altrimenti non sarebbero evidenti. Il vantaggio di essere in grado di quantificare il patterning sulle colonie standardizzate dipende dalla possibilità di misurare con precisione l’espressione proteica, idealmente a livello di singola cellula. Tuttavia, le cellule su micromodelli sono spesso strettamente imballate, rendendole difficili da segmentare con alta precisione. Le cellule spesso si organizzano in tre dimensioni anziché in due dimensioni e può essere difficile rilevare e conservare informazioni tridimensionali (3D) durante la segmentazione. Una volta che le celle sono state segmentate con successo, sono necessari metodi di calcolo per estrarre le informazioni di patterning dai set di dati risultanti.
Abbiamo sviluppato strumenti di segmentazione e analisi delle immagini per aiutare a superare questi problemi. Questo metodo di analisi utilizza solo software libero e open-source e non richiede la conoscenza della riga di comando o della programmazione per implementare. Per illustrare il metodo qui, usiamo cellule staminali embrionali di topo (mES) che esprimono spontaneamente un marcatore di brachiury di differenziazione precoce (Tbra)21,22. Anche se nessuna disposizione spaziale apparente è visivamente rilevabile, il metodo consente la creazione di una mappa del posizionamento preferenziale delle cellule di T . Mostriamo anche che il patterning Tbra contrasta con l’assenza di una localizzazione preferenziale delle cellule che esprimono Id1, una lettura diretta del percorso della proteina morfogenetica ossea (BMP)23. Discutiamo anche le attuali limitazioni del metodo e come questa tecnica può essere adattata ad altri sistemi sperimentali.
Qui descriviamo un metodo per analizzare i modelli emergenti nelle colture di cellule. Un approccio di micropatterning semplificato viene utilizzato per standardizzare la forma e le dimensioni delle colonie cellulari, e presentiamo strumenti di analisi delle immagini e script R che consentono il rilevamento e la quantificazione dei modelli all’interno di queste colonie.
La pipeline che proponiamo è simile in una certa misura con un metodo precedentemente pubblicato31 in cui gli autori si concentrano sulle condizioni di coltura, utilizzando micromodelli disponibili in commercio, per ottenere la formazione di strato germinale riproducibile nelle colonie ESC per il studio dei primi eventi di gastrulazione in vitro. Il nostro obiettivo è più mirato a fornire una pipeline generalizzabile per la scoperta della formazione di modelli in vitro dove l’organizzazione collettiva delle cellule può diventare evidente solo dopo l’analisi statistica. Per questo motivo, forniamo un robusto flusso di lavoro di analisi delle immagini che consente l’identificazione e l’analisi accurata della posizione nucleare nello spazio 3D su più colonie (vedi anche la sezione “Vantaggio e limitazioni del metodo di rilevamento dei pattern” di questo discussione). Abbiamo anche deciso di sviluppare un semplice approccio di micropatterning interno che offra un’alternativa più flessibile ed economica alle soluzioni disponibili in commercio a lungo termine che speriamo siano utili alla comunità.
Infine, notiamo che durante la revisione di questo manoscritto, è stato rilasciato un nuovo pacchetto per l’analisi del patterning in vitro simile ai nostri script R32. Questo nuovo pacchetto accetta tabelle di funzionalità delle celle come input che possono essere ottenute da piattaforme di imaging ad alta velocità effettiva. Crediamo che la tabella delle caratteristiche dei nuclei generata al punto 7 del nostro protocollo potrebbe in linea di principio servire come input a questo nuovo pacchetto anche se non abbiamo testato questa possibilità noi stessi.
Adattabilità del metodo ad altri tipi di cellule e geometrie di colonia
Vi presentiamo questo approccio nel contesto dello studio dell’emergere di fattori di trascrizione mesodermici nelle colture di cellule pluripotenti in presenza di siero. Tuttavia, il metodo è facilmente adattabile ad altri tipi di cellule e alle colture senza siero, anche se potrebbe essere necessario ottimizzare le concentrazioni di ECM/poloxamer 407 (cfr. tabella 1 per le concentrazioni testate e Tabella 2 per una guida alla risoluzione dei problemi). Il metodo può anche essere adattato a dimensioni più grandi o più piccole di micromodelli e ad una vasta gamma di forme in base alle esigenze dell’utente. Tuttavia, mentre si stabilisce il metodo, è importante essere consapevoli del fatto che non tutte le combinazioni di forma/tipo di cella sono ottimali. Ad esempio, mESC esprime alti livelli di E-cadherin33,34 consentendo a queste cellule di formare strutture collettive che si estendono su aree prive di ECM. Queste celle non seguono rigorosamente le geometrie con angoli acuti o che includono piccoli fori nel modello. Si noti, ad esempio, che sull’anello della figura 3B, le celle sono in fase di colonizzazione dell’area centrale. Nelle nostre mani una zona centrale più piccola non ha costretto mESC a formare colonie ad anello. Si consiglia quindi di includere una varietà di geometrie durante la progettazione della fotomaschera per poter testare e identificare le dimensioni e le curve ottimali che saranno adatte al tipo di cella scelta.
Un altro fattore importante da prendere in considerazione è la lunghezza dell’esperimento e il tasso di proliferazione delle cellule. Per alcuni tipi di cellule che proliferano rapidamente (comprese le cellule pluripotenti) può essere difficile mantenere le cellule su micromodelli per molti giorni (Per mESC tre giorni è un massimo). Inoltre, la semina di cellule su micromodelli non sempre avviene in modo ottimale per ogni colonia, quindi è consigliabile seminare un eccesso di colonie per avere pezzi di ricambio.
Vantaggio e limitazioni del metodo di rilevamento dei pattern
Un particolare vantaggio del metodo è la capacità di rilevare modelli “medi” combinando i risultati dell’analisi delle immagini da più colonie di replica (Figura 5). Questo può rivelare eventi di patterning che non sono evidenti dall’ispezione di singole colonie. Uno svantaggio di questo approccio di “media” è che può mancare alcuni tipi di modelli ripetitivi, ad esempio piccole macchie o strisce strette. Tuttavia, questi tipi di pattern possono invece essere rivelati con una combinazione di dimensioni del modello scelte con cura8. Inoltre, la pipeline di analisi delle immagini qui descritta fornisce dati quantitativi sia a singola cellula che a risoluzione della colonia che offrono la possibilità di studiare il livello di variabilità tra le composizioni (Figura5) o di eseguire l’analisi dei vicini a più bilance10.
Un altro importante vantaggio del metodo di media è che offre l’opportunità di mappare la posizione preferenziale di molti marcatori senza essere limitato da fluorofori disponibili dei canali di rilevamento. Infatti, anche se ci avvalemo solo di due marcatori di differenziazione nel lavoro qui presentato, la capacità di standardizzare le colonie ed estrarre modelli “mediati” consente di confrontare insieme le mappe di distribuzione di diverse serie di colonie per per rivelare le relazioni spaziali generalizzate dei marcatori l’uno all’altro.
Inoltre, anche se il nostro obiettivo è stato quello di studiare i marcatori di differenziazione, il metodo di analisi può essere esteso per studiare altri processi biologici per i quali sono disponibili marcatori nucleari. Ad esempio, la microdoratura di una linea cellulare contenente un indicatore del ciclo cellulare dell’ubiquitazione a fluorescenza a fluorescenza35 (FUCCI) consentirebbe di studiare in che modo la geometria a livello di colonia può influenzare gli eventi del ciclo cellulare nel gruppo.
Indicazioni future
Il metodo è suscettibile di analisi delle immagini a media velocità effettiva, tuttavia, l’acquisizione di immagini non è attualmente completamente automatizzata e può diventare limitante per esperimenti di grandi dimensioni. Le disposizioni regolari delle colonie dovrebbero rendere possibile creare routine di acquisizione completamente automatizzate simili a quelle sviluppate per una singola cellula mediadi 20. Tuttavia, poiché le dimensioni del campo necessario per immaginare una colonia sono grandi, probabilmente richiedono mosaici, e poiché le colonie sono tridimensionali, è altamente auspicabile ridurre sia le dimensioni del set di dati che il tempo di acquisizione mediante l’imaging solo di colonie pertinenti. Pertanto, gli sforzi futuri potrebbero essere dedicati a sviluppare un microscopio “intelligente” in grado di identificare le colonie rilevanti e adattare le coordinate di imaging per ogni campione. Ciò non solo ridurrà i tempi e gli sforzi, ma previene anche potenziali distorsioni dell’operatore.
Le pipeline di analisi possono anche essere rese più efficienti riducendo il numero di passaggi che l’utente deve eseguire. Abbiamo in programma di costruire un meccanismo di costruzione di tubazioni e di integrare R direttamente nel nostro software (vedi anche problemi pickcells-api-3 e pickcells-rjava1 nel tracker di problemi dei nostri repository di codice [https://framagit.org/groups/pickcellslab/-/issues]). La completa automazione della procedura di analisi ridurrà i tempi e gli sforzi e limiterà i potenziali errori degli utenti.
Infine, notiamo che il nostro metodo di analisi non cattura ancora completamente la natura dinamica del patterning cellulare. Alcune informazioni dinamiche limitate possono essere estratte esaminando una serie temporale di immagini istantanee8,10,36. Tuttavia, essere in grado di registrare la storia della popolazione cellulare è altamente auspicabile se vogliamo capire meglio come emerge il modello. Una limitazione è che il tracciamento accurato delle singole cellule in una popolazione di cellule dense 3D rimane un compito molto impegnativo37. Il nostro metodo di rilevamento cellulare utilizza l’involucro nucleare e si comporta particolarmente bene su popolazioni cellulari dense e sovrapposte28. I giornalisti vivi dell’involucro nucleare sono prontamente disponibili28,38 e uno dei vantaggi della tecnica di micropatterning è che può essere utilizzato per impedire alle cellule di muoversi al di fuori del campo visivo durante l’imaging a lungo termine. Nel complesso, siamo fiduciosi che il monitoraggio automatizzato delle celle sarà realizzabile utilizzando una combinazione di strumenti di recente creazione28,39,40 e che questo dovrebbe portare nuove intuizioni nel fondamentale principi di auto-organizzazione.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato finanziato da una borsa di studio post-dottorato di Sir Henry Wellcome (da WT100133 a G.B.), da una Wellcome Trust Senior Fellowship (da WT103789AIA a S.L.), e da una borsa di dottorato del Wellcome Trust (108906 / 15 / s . Siamo anche grati al dottor Manuel Thery per i suoi consigli sull’adattamento della tecnica di fotomodellazione.
2-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | handle in fume hood |
1× Master quartz anti-reflective chromium photomask | Toppan Photomask | Custom design | |
24-well plates | Corning | 3526 | |
4-well plates | Nunclon Delta | 176740 | |
5% Donkey Serum | Sigma | D9663 | |
Anti Nuclear pore complex | Abcam | ab24609 | Mouse monoclonal, use 1:1000 |
Anti-Id1 | Biocheck | 37-2 | Rabbit polyclonal, use 1:200 |
Anti-Lamin B1 | Abcam | ab16048 | Rabbit polyclonal, use 1:1000 |
Anti-Tbra | R&D | AF2085 | Goat ployclonal, use 1:400 |
Blocking Solution | NA | NA | 0.1% TritonX-100 0.01% Pluronic F-127 5% Donkey Serum 0.003% Sodium Azide In PBS |
CGR8 mESC | NA | NA | Reference: Mountford et al. PNAS, 1994 |
Fixation solution | NA | NA | 4% PFA diluted in washing solution |
Foetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | Serum batches must be tested to ensure compatibility with ESC maintenance |
Gelatin | Sigma | G1890 | |
Glasgow Minimum Essential Medium | Sigma | G5154 | |
Laboratory Film | VWR | 291-1212 | |
Layout Editor Software | LayoutEditor | NA | https://layouteditor.com/ |
Layout Editor Software | Klayout | NA | https://www.klayout.de/ |
L-glutamine | Gibco | 25030-024 | |
LIF | Millipore | ESG1107 | |
MEM NEAA | Gibco | 11140-035 | |
mESC Culture medium | NA | NA | GMEM 10% FCS 100 U/ml LIF 100 nM 2-mercaptoethanol 1× non-essential amino acids, 2 mM L- glutamine 1 mM sodium pyruvate |
NH4Cl 50mM | Sigma | 9718 | |
Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | CAUTION: Toxic, handle undiluted stocks in fume hood and wear protective equipment |
PBS (immunostaining) | Sigma | P4417 | Dilute in 200ml of ddH2O |
PBS (tissue culture) | Gibco | 11140-035 | |
Plastic slides | Ibidi | IB-10813 | |
Poloxamer 407 | Sigma | P2443 | |
ProLong Gold Antifade Mountant | Molecular Probes | P36930 | |
Sodium Azide | Sigma | 8591 | CAUTION: Toxic, handle in fume hood and wear protective equipment |
Sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | |
TritonX-100 | Sigma | T8532 | |
Trypsin | Gibco | 25200056 | |
UVO cleaner | Jetlight, USA | 42-220 | CAUTION: Follow manufacturer’s safety recommendations |
Washing Solution | NA | NA | 0.1% TritonX-100 0.01% Pluronic F-127 In PBS |