השיטה המוצגת כאן משתמשת במיקרוגרף יחד עם הדמיה כמותית לחשיפת הארגון המרחבי בתוך תרבויות היונקים. הטכניקה היא קלה להקים מעבדה סטנדרטית בביולוגיה התא והוא מציע מערכת צייתן לחקור מבחנה בפריפרייה.
מטרה בסיסית בביולוגיה היא להבין כיצד מופיעים דפוסים במהלך הפיתוח. כמה קבוצות הראו כי הדפוס ניתן להשיג באופן מתורבת כאשר תאי גזע מוגבלים על מיקרודפוסים, ובכך להגדיר מודלים ניסיוניים המציעים הזדמנויות ייחודיות לזהות, באופן מתורבת, עקרונות היסוד של ביולוגי ארגון.
כאן אנו מתארים את ההטמעה שלנו של המתודולוגיה. התאמתי את הטכניקה צילום-מניפולציה כדי להפחית את הצורך בציוד מיוחד כדי להקל על הקמת השיטה במעבדה סטנדרטית ביולוגיה תא. פיתחנו גם בחינם, מקור פתוח וקל להתקין מסגרת ניתוח תמונה כדי למדוד במדויק את המיקום המוועדף של אוכלוסיות תת של תאים בתוך מושבות של צורות סטנדרטיות גדלים. שיטה זו מאפשרת לחשוף את קיומם של אירועים מסוימים גם באוכלוסיות בלתי מאורגנת לכאורה של תאים. הטכניקה מספקת תובנות כמותיים ויכולה לשמש לזיווג השפעות הסביבה (למשל, רמזים פיזיים או איתות אנדוגני), בתהליך מסוים.
במערכות היונקים, הדפוס הוא תכונה מתהווה של התנהגות קולקטיבית של תאים ולכן, דפוסים יכולים ליצור מבחנה אם רמזים מתאימים מסופקים לתאים1,2,3,4, מיכל 5 , 6. אחת הדרכים לחשוף את היכולת הפנימית של התאים לארגן את עצמו ב-“מבחנה” היא לאלץ את התאים ליצור קבוצות/מושבות של צורות וגדלים מוגדרים7,8,9,10 . טכניקה המאפשרת זאת היא מיקרומניפולציה11. מיקרומטנינג מאפשר להגדיר במדויק את המיקום שבו מולקולות המכפלה (ECM) מיופקדו על משטח. זה, בתורו מכתיב היכן התאים יכולים לדבוק ולכן שולט כיצד תאים לארגן.
מיקרומניפולציה היא טכניקה עם מספר רב של יישומים, למשל, מיקרו, מאפשרת סטנדרטיזציה של תנאים ראשוניים לפני בידול12. חשוב לעשות זאת, המיקרו-מיקרוסקופ מאפשר לשלוט בקלות בגודל, בצורה ובריווח של מושבות תאים ובמאפיין זה ניתן להשתמש כדי לתכנן ניסויים המיועדים לחקור את התגובה הקולקטיבית של התאים כדי מורפוגן או לסימנים פיזיים7 , בן שמונה , מיכל עשור , מיכל בן 13 , מיכל בן 14 , מיכל בן 15 , מיכל בן 16 , . שבע עשרה
מספר שיטות מיקרוטונינג פותחו11. טכניקות photopatterning הן אולי השיטות הקלות ביותר להקמת18. גישות אלה יש גם את היתרון של דיוק כפי שהם יכולים לשמש כדי לשלוט על הצורה של תאים בודדים18,19,20. עם זאת, הם דורשים גם ציוד יקר מיוחדים כולל מסתובב ספין, תא פלזמה ו UVO (UV-אוזון) ניקוי אשר בדרך כלל לא זמין במעבדות ביולוגיה סטנדרטית. כדי להקל על אימוץ הטכניקה, התאמתי את הפרוטוקול כדי לאפשר רק את מנורת ה-UVO. אנחנו מתחילים מתוך שקופיות פלסטיק זמין מסחרית אשר ניתן לגזור עם מספריים או עם ניקוב חור לפורמט הרצוי.
כלי חשוב אחד של מיקרודפוסים הוא היכולת לתקנן מושבות כדי להשוות בין מושבות בודדות לבין מספר משכפל. זה מאפשר לשאול לאיזה מידה היווצרות התבנית בתוך מושבות אלה הוא להיות מיוצר, ולחקור גורמים המשפיעים על החוסן של תהליך הדפוס. וחשוב מכך, הכמת של דפוסי “ממוצעים” על פני מושבות סטנדרטיות מרובות יכולים גם לחשוף את תהליכי המדידה שאחרת לא היו גלויים לעין. היתרון של היכולת לכמת את המדידה על המושבות מתוקננת תלוי ביכולת למדוד במדויק את ביטוי החלבון, באופן אידיאלי במפלס התא היחיד. עם זאת, תאים על מיקרודפוסים הם לעתים קרובות ארוזים הדוק, מה שהופך אותם קשה פלח עם דיוק גבוהה. תאים גם לעתים קרובות לארגן את עצמם בשלושה ולא בשני ממדים, וזה יכול להיות מאתגר לזהות ולשמר תלת מימדי (3D) מידע במהלך פילוח. לאחר שתאים מחולקים בהצלחה, נדרשות שיטות חישוביות לחילוץ מידע מתוך ערכות הנתונים שיתקבלו.
פיתחנו פילוח וניתוח תמונה כלי כדי לסייע להתגבר על בעיות אלה. שיטת ניתוח זו משתמשת רק בתוכנה חופשית ובקוד פתוח ואינה דורשת ידע על שורת הפקודה או על תיכנות ליישום. כדי להמחיש את השיטה כאן, אנו משתמשים גזע מעובריים של העכבר (mES) תאים אשר באופן ספונטני לבטא סמן של בידול מוקדם brachyury (tbra)21,22. בעוד שאין הסדר מרחבי גלוי לעין חזותית, השיטה מאפשרת יצירת מפה של מיקום מועדף של תאי T + במושבות. כמו כן, אנו מראים כי Tbra המ, ניגודים עם העדר לוקליזציה מועדפים של התאים המבטאים Id1, הבדיקה הישירה של חלבון מורמורגנטי העצם (BMP) בנתיב23. אנו דנים גם במגבלות הנוכחיות של השיטה וכיצד ניתן להתאים טכניקה זו למערכות נסיוניות אחרות.
כאן אנו מתארים שיטה לניתוח מתהווה בתרבויות של תאים. גישה מיקרופינינג פשוטה משמשת לסטנדרטיזציה של הצורה והגודל של מושבות התא, ואנו מציגים כלי ניתוח תמונה וסקריפטים R המאפשרים איתור וכימות של דפוסים בתוך המושבות האלה.
הצינור שאנו מציעים דומה במידה מסוימת עם שיטה שפורסמה קודם לכן31 שבו המחברים מתמקדים בתנאי התרבות, באמצעות מיקרודפוסים זמינים מסחרית, כדי לקבל היווצרות שכבת הנבט להתרבות במושבות ESC ל חקר של אירועים מוקדמים בתחומי החוץ. המטרה שלנו היא ממוקדת יותר כלפי מתן צינור הניתן להכליל לגילוי של תבנית היווצרות מבחנה שבה הארגון הקולקטיבי של התאים עשוי להיות גלוי רק לאחר ניתוח סטטיסטי. מסיבה זו, אנו מספקים זרימת עבודה חזקה התמונה המאפשרת זיהוי מדויק וניתוח של מיקום גרעיני בחלל תלת-ממדי על מושבות מרובות (ראה גם ‘ יתרון ומגבלות של שיטת זיהוי דוגמת מילוי ‘ בסעיף זה דיון). כמו כן החלטנו לפתח גישה פשוטה בתוך הבית, המציעה חלופה גמישה וזולה יותר לפתרונות מסחריים בטווח הארוך, שאנו מקווים שיהיו שימושיים לקהילה.
לבסוף, אנו מודעים לכך שבמהלך התיקון של כתב היד הזה, חבילה חדשה לניתוח המיון באופן מתורבת בדומה לסקריפטים שלנו R שוחררה32. חבילה חדשה זו מקבלת טבלאות של תכונות תא כקלט הניתן להשגה מפלטפורמות הדמיה גבוהה של תפוקה. אנו מאמינים כי הטבלה של תכונות גרעין שנוצרו בשלב 7 של הפרוטוקול שלנו יכול עקרונית לשמש כקלט לחבילה חדשה זו למרות שלא בדקנו את האפשרות הזאת בעצמנו.
הסתגלות של השיטה לסוגי תאים אחרים וגאומטריות מושבה
אנו מציגים גישה זו בהקשר של לימוד הופעתה של גורמים שעתוק מזועורי בתרבויות התאים החזקים ביותר בנוכחות של סרום. עם זאת, השיטה ניתנת להתאמה בקלות לסוגי תאים אחרים ולתרבויות ללא סרום למרות שייתכן שיהיה צורך למטב את ECM/poloxamer 407 ריכוזי (ראה טבלה 1 עבור ריכוזי נבדק ושולחן 2 עבור מדריך לפתרון בעיות). ניתן גם להתאים את השיטה לגדלים גדולים או קטנים יותר של מיקרודפוסים ולמגוון רחב של צורות בהתאם לצורכי המשתמש. עם זאת, בזמן שאתה מבסס את השיטה, חשוב להיות מודע לכך שלא כל שילובי הצורה/סוג התא הם אופטימליים. לדוגמה, רמות גבוהות של mesc express של E-קדהרין33,34 המאפשרות לתאים אלה ליצור מבנים קיבוציים המשתרעים על פני אזורים נטולי ecm. תאים אלה אינם מתבצע בקפדנות גאומטריות עם זוויות חדות או הכוללות חורים קטנים בתבנית. הודעה לדוגמה כי על הטבעת של איור 3B, התאים נמצאים בתהליך של הנכבש האזור המרכזי. בידינו, אזור מרכזי קטן יותר, לא כפה את הכוחות ליצור מושבות בצורת טבעת. לכן מומלץ מאוד לכלול מגוון של גיאומטריות בזמן עיצוב הפושאול כדי להיות מסוגל לבחון ולזהות את הגדלים והעקמומיות האופטימליים שיתאימו לסוג התא של בחירה.
גורם חשוב נוסף שיש לקחת בחשבון הוא אורך הניסוי ושיעור ההתפשטות של התאים. עבור כמה סוגי תאים מתרבים במהירות (כולל תאים pluriפוטנטי) זה יכול להיות קשה לשמור על התאים על מיקרודפוסים במשך ימים רבים (עבור mESC שלושה ימים הוא מקסימום). כמו כן, זריעת תאים על מיקרודפוסים לא תמיד מתרחשת בצורה אופטימלית עבור כל מושבה, ולכן מומלץ לזרע עודף של מושבות כדי לקבל רזרבי.
היתרון והמגבלות של שיטת זיהוי התבנית
יתרון אחד מסוים של השיטה הוא היכולת לזהות דפוסי “ממוצעים” על ידי שילוב תוצאות ניתוח תמונה ממספר מושבות שכפול (איור 5). זה יכול לחשוף את האירועים שאינם גלויים מתוך בדיקה של מושבות נפרדות. חסרון בגישה זו של ‘ חישוב ממוצע ‘ הוא שהוא עלול להחמיץ סוגים מסוימים של דפוסים חוזרים, למשל כתמים קטנים או פסים צרים. עם זאת, סוגי דפוס אלה עשויים להתגלות במקום זאת עם שילוב של גדלים שנבחרו בקפידה גודל8. כמו כן, צינור ניתוח התמונה המתואר כאן מספק נתונים כמותיים בשני תאים בודדים ורזולוציית המושבה המציעה את האפשרות לחקור את רמת ההשתנות הבין-מושבה (איור 5) או לבצע ניתוח שכנים במספר מאזניים10.
יתרון חשוב נוסף של השיטה בממוצע הוא שהוא מציע את ההזדמנות למפות את המיקום האידיאלי של סמנים רבים מבלי להיות מוגבל על ידי fluorophores זמין של ערוצי זיהוי. אכן, למרות שאנו עושים שימוש רק בשני סמנים של בידול בעבודה המוצגת כאן, היכולת לתקנן מושבות ולחלץ “ממוצעים” דפוסים מאפשר להשוות את מפות ההפצה מקבוצות שונות של מושבות יחד על מנת לחשוף את הקשרים המרחביים הללו של סמנים זה לזה.
יתר על כן, למרות ההתמקדות שלנו כאן היה ללמוד סמנים של בידול, שיטת הניתוח ניתן להרחיב כדי ללמוד תהליכים ביולוגיים אחרים שעבורם סמנים גרעיניים זמינים. לדוגמה מיקרופאנינג של קו תא המכיל מחוון מחזור תאים פלואורסצנטית35 (fucci) תאפשר ללמוד כיצד גיאומטריה רמת המושבה עלולה להשפיע על אירועי מחזור התא בקבוצה.
כיוונים לעתיד
השיטה היא קלה לניתוח תמונה תפוקה בינונית, עם זאת, רכישת תמונה אינה אוטומטית לחלוטין והוא יכול להיות הגבלת ניסויים גדולים מאוד. הסדרים קבועים של מושבות צריך לאפשר ליצור באופן מלא שגרות רכישה מלאה דומה למה שפותחה עבור תא בודד בממוצע20. עם זאת, מכיוון שגודל השדה הנדרש לדימוי המושבה גדול, ייתכן שהוא זקוק לmosaicking, ומכיוון שמושבות הן תלת-ממדיות, רצוי מאוד להפחית הן את גודל הנתונים והן את זמן הרכישה באמצעות הדמיה של מושבות רלוונטיות בלבד. לכן, מאמצים עתידיים יכולים להיות מוקדשים לפתח ‘ אינטליגנטי ‘ מיקרוסקופ מסוגל לזהות מושבות רלוונטיות ולהתאים קואורדינטות הדמיה לכל מדגם. זה לא רק להפחית את הזמן והמאמץ אלא גם למנוע הטיות המפעיל פוטנציאליים.
גם צינורות הניתוח עשויים להיות יעילים יותר על-ידי הפחתת מספר הצעדים שהמשתמש צריך לנקוט. יש לנו תוכניות לבנות מנגנון בניית צינור ולשלב R ישירות לתוך התוכנה שלנו (ראה גם בעיות בפיתאים-api 3 ו-כדוריות-rjava 1 בגשש הנושא של מאגרי הקוד שלנו [https://framagit.org/groups/pickcellslab/-/issues]). האוטומציה המלאה של הליך הניתוח תפחית את הזמן והמאמץ ותגביל את שגיאות המשתמש הפוטנציאליות.
לבסוף, אנו מודעים לכך ששיטת הניתוח שלנו עדיין לא לוכד במלואה את האופי הדינאמי של הפענוח התאי. מידע דינמי מוגבל ניתן לחילוץ על ידי בחינת סדרת זמן של תמונות תמונה8,10,36. עם זאת, להיות מסוגל להקליט את ההיסטוריה של אוכלוסיית התאים הוא מאוד רצוי אם אנחנו רוצים להבין טוב יותר איך מתגלה הסדר. מגבלה אחת היא כי מעקב מדויק של תאים בודדים באוכלוסיית תא צפופה 3D נשאר משימה מאתגרת מאוד37. שיטת זיהוי התאים שלנו משתמשת במעטפה הגרעינית ומבצעת היטב במיוחד על אוכלוסיית תאים צפופים וחופפים28. כתבים חיים של המעטפה הגרעינית הם זמינים28,38 ואחד היתרונות של הטכניקה מיקרומניפולציה היא שזה יכול לשמש כדי למנוע את התאים מחוץ לשדה הראייה במהלך הדמיה ארוכת טווח. בסך הכל, אנחנו בטוחים כי מעקב אוטומטי של תאים יהיה השגה באמצעות שילוב של כלים שהוקמו לאחרונה28,39,40 וכי זה צריך להביא תובנות חדשות לתוך היסוד עקרונות של ארגון-עצמי.
The authors have nothing to disclose.
העבודה הזאת ממומנת על ידי מלגת סר הנרי ברוך פוסט-דוקטורט (WT100133 to G.B.), מלגת בכירה מבית-הנאמנות (WT103789AIA ל-ס), וברוכים ה לאמון ברוך הבא (108906/Z/15/Z עד D.W.). אנחנו גם אסירי תודה ד ר מנואל Thery עבור עצתו על התאמת הטכניקה photopatterning.
2-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | handle in fume hood |
1× Master quartz anti-reflective chromium photomask | Toppan Photomask | Custom design | |
24-well plates | Corning | 3526 | |
4-well plates | Nunclon Delta | 176740 | |
5% Donkey Serum | Sigma | D9663 | |
Anti Nuclear pore complex | Abcam | ab24609 | Mouse monoclonal, use 1:1000 |
Anti-Id1 | Biocheck | 37-2 | Rabbit polyclonal, use 1:200 |
Anti-Lamin B1 | Abcam | ab16048 | Rabbit polyclonal, use 1:1000 |
Anti-Tbra | R&D | AF2085 | Goat ployclonal, use 1:400 |
Blocking Solution | NA | NA | 0.1% TritonX-100 0.01% Pluronic F-127 5% Donkey Serum 0.003% Sodium Azide In PBS |
CGR8 mESC | NA | NA | Reference: Mountford et al. PNAS, 1994 |
Fixation solution | NA | NA | 4% PFA diluted in washing solution |
Foetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | Serum batches must be tested to ensure compatibility with ESC maintenance |
Gelatin | Sigma | G1890 | |
Glasgow Minimum Essential Medium | Sigma | G5154 | |
Laboratory Film | VWR | 291-1212 | |
Layout Editor Software | LayoutEditor | NA | https://layouteditor.com/ |
Layout Editor Software | Klayout | NA | https://www.klayout.de/ |
L-glutamine | Gibco | 25030-024 | |
LIF | Millipore | ESG1107 | |
MEM NEAA | Gibco | 11140-035 | |
mESC Culture medium | NA | NA | GMEM 10% FCS 100 U/ml LIF 100 nM 2-mercaptoethanol 1× non-essential amino acids, 2 mM L- glutamine 1 mM sodium pyruvate |
NH4Cl 50mM | Sigma | 9718 | |
Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | CAUTION: Toxic, handle undiluted stocks in fume hood and wear protective equipment |
PBS (immunostaining) | Sigma | P4417 | Dilute in 200ml of ddH2O |
PBS (tissue culture) | Gibco | 11140-035 | |
Plastic slides | Ibidi | IB-10813 | |
Poloxamer 407 | Sigma | P2443 | |
ProLong Gold Antifade Mountant | Molecular Probes | P36930 | |
Sodium Azide | Sigma | 8591 | CAUTION: Toxic, handle in fume hood and wear protective equipment |
Sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | |
TritonX-100 | Sigma | T8532 | |
Trypsin | Gibco | 25200056 | |
UVO cleaner | Jetlight, USA | 42-220 | CAUTION: Follow manufacturer’s safety recommendations |
Washing Solution | NA | NA | 0.1% TritonX-100 0.01% Pluronic F-127 In PBS |