De hier gepresenteerde methode maakt gebruik van micropatterning samen met kwantitatieve beeldvorming om de ruimtelijke ordening binnen de zoogdier culturen te onthullen. De techniek is gemakkelijk vast te stellen in een standaard laboratorium voor celbiologie en biedt een Tractable systeem om patronen in vitro te bestuderen.
Een fundamenteel doel in de biologie is om te begrijpen hoe patronen ontstaan tijdens de ontwikkeling. Verschillende groepen hebben aangetoond dat patronen in vitro kunnen worden bereikt wanneer stamcellen ruimtelijk beperkt zijn tot micro patronen, waardoor experimentele modellen worden opgezet die unieke mogelijkheden bieden om in vitro de fundamentele principes van biologische Organisatie.
Hier beschrijven we onze eigen implementatie van de methodologie. We hebben een foto-patterning techniek aangepast om de noodzaak van gespecialiseerde apparatuur te reduceren, zodat het gemakkelijker wordt om de methode in een standaard cel biologie laboratorium te vestigen. We ontwikkelden ook een gratis, open-source en eenvoudig te installeren beeldanalyse kader om de preferentiële positionering van subpopulaties van cellen binnen kolonies van standaard vormen en-maten nauwkeurig te meten. Deze methode maakt het mogelijk om het bestaan van patronen gebeurtenissen te onthullen, zelfs in schijnbaar ongeorganiseerde populaties van cellen. De techniek biedt kwantitatieve inzichten en kan worden gebruikt voor het ontkoppelen van invloeden van de omgeving (bijv. fysieke signalen of endogene signalering), op een bepaald patroon proces.
In zoogdier systemen is patronen een emergente eigenschap van het collectief gedrag van cellen en zo kunnen patronen in vitro worden vormgegeven, indien passende aanwijzingen aan de cellen1,2,3,4, 5 , 6. een manier om het intrinsieke vermogen van de cellen te onthullen om in vitro zelf te organiseren, is door de cellen te dwingen groepen/kolonies te vormen van een gedefinieerde vormen en maten7,8,9,10 . Een techniek die dit mogelijk maakt is micropatterning11. Micropatterning maakt het mogelijk om de locatie waar extracellulaire matrix (ECM) moleculen op een oppervlak worden afgezet nauwkeurig te definiëren. Dit, op zijn beurt dicleert waar de cellen kunnen hechten en daarom bepaalt hoe cellen ruimtelijk organiseren.
Micropatterning is een techniek met tal van toepassingen, bijvoorbeeld micropatterning maakt standaardisatie van initiële omstandigheden voorafgaand aan differentiatie12mogelijk. Belangrijk is dat micropatterning het mogelijk maakt om eenvoudig de grootte, vorm en afstand van celkolonies te beheersen en deze eigenschap kan worden gebruikt om experimenten uit te werken die gericht zijn op het ondervragen van de collectieve respons van de cellen op morfogen of op fysieke signalen7 , 8 , 10 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17.
Er zijn verschillende micropatterning methoden ontwikkeld11. Photopatterning technieken zijn misschien wel de eenvoudigste methoden om18te vestigen. Deze benaderingen hebben ook het voordeel van precisie, omdat ze kunnen worden gebruikt om de vorm van enkele cellen18,19,20te beheersen. Ze vereisen echter ook dure gespecialiseerde apparatuur, waaronder een spin coater, een plasma kamer en een UVO (UV-ozon) reiniger die over het algemeen niet direct beschikbaar zijn in standaard biologie laboratoria. Om het aannemen van de techniek te vergemakkelijken, hebben we het protocol aangepast om alleen de UVO-lamp te vereisen. We starten met de in de handel verkrijgbare plastic dia’s die met een schaar kunnen worden gesneden of met een perforator naar het gewenste formaat.
Een belangrijk nut van micropatterns is de mogelijkheid om kolonies te standaardiseren om individuele kolonies over meerdere replicaten te vergelijken. Dit maakt het mogelijk om te vragen in hoeverre de patroonvorming binnen deze kolonies reproduceerbaar is, en om factoren te onderzoeken die de robuustheid van het patronen proces beïnvloeden. Belangrijk is dat de kwantificering van “gemiddelde” patronen in meerdere gestandaardiseerde kolonies ook patroon processen kan onthullen die anders niet zouden blijken. Het voordeel van het kunnen kwantificeren van patronen op gestandaardiseerde kolonies is afhankelijk van de mogelijkheid om de eiwit expressie nauwkeurig te meten, idealiter op het niveau van één cel. Cellen op micro patronen zijn echter vaak strak verpakt, waardoor ze moeilijk te segmenteren zijn met hoge nauwkeurigheid. Cellen organiseren zich ook vaak in drie in plaats van twee dimensies en het kan lastig zijn om driedimensionale (3D) informatie tijdens segmentatie te detecteren en te behouden. Zodra de cellen met succes zijn gesegmenteerd, zijn er rekenmethoden nodig voor het extraheren van patronen uit de resulterende gegevenssets.
We hebben segmentatie-en beeldanalyse tools ontwikkeld om deze problemen te helpen overwinnen. Deze analysemethode maakt alleen gebruik van gratis en open-source software en vereist geen kennis van Command Line of programmering om te implementeren. Om de methode hier te illustreren, gebruiken we muizen embryonale stam (mES) cellen die spontaan een marker van vroege differentiatie brachyury (tbra)21,22uitdrukken. Hoewel geen schijnbare ruimtelijke ordening visueel detecteerbaar is, maakt de methode het mogelijk om een kaart te maken van de preferentiële positionering van T + cellen in kolonies. We tonen ook aan dat Tbra-patronen contrasteert met het ontbreken van een voorkeurs lokalisatie van de cellen die Id1 uitdrukken, een directe uitlezen van het botmorfogenetische eiwit (BMP)-traject23. We bespreken ook de huidige beperkingen van de methode en hoe deze techniek kan worden aangepast aan andere experimentele systemen.
Hier beschrijven we een methode voor het analyseren van emergente patronen in culturen van cellen. Een vereenvoudigde micropatterning benadering wordt gebruikt voor het standaardiseren van de vorm en grootte van celkolonies, en we presenteren beeldanalyse tools en R-scripts die de detectie en kwantificering van patronen binnen deze kolonies mogelijk maken.
De pijpleiding die wij voorstellen is in zekere mate vergelijkbaar met een eerder gepubliceerde methode31 , waarbij de auteurs zich richten op de cultuuromstandigheden, met behulp van commercieel verkrijgbare micro patronen, om reproduceerbare kiem lagen vorming te verkrijgen in ESC-kolonies voor de studie van vroege gastrulatie-Events in vitro. Ons doel is meer gericht op het leveren van een generaliseerbare pijpleiding voor de ontdekking van patroonvorming in vitro, waar de collectieve organisatie van de cellen pas zichtbaar kan worden na statistische analyse. Daarom bieden we een robuuste beeldanalyse-workflow die de nauwkeurige identificatie en analyse van de nucleaire positie in de 3D-ruimte over meerdere kolonies mogelijk maakt (Zie ook de sectie ‘ voordeel en beperkingen van de patroon detectiemethode ‘ van deze discussie). We hebben ook besloten om een eenvoudige in-House micropatterning aanpak te ontwikkelen die een flexibeler en goedkoper alternatief biedt voor commercieel beschikbare oplossingen op de lange termijn, wat hopelijk nuttig zal zijn voor de Gemeenschap.
Ten slotte merken we op dat tijdens de herziening van dit manuscript, een nieuw pakket voor de analyse van patronen in vitro vergelijkbaar met onze R-scripts is uitgebracht32. Dit nieuwe pakket accepteert tabellen van celfuncties als invoer die kunnen worden verkregen van high-throughput Imaging platforms. Wij zijn van mening dat de tabel van kernen-functies die in stap 7 van ons protocol zijn gegenereerd in principe als input voor dit nieuwe pakket kan dienen, hoewel we deze mogelijkheid zelf niet hebben getest.
Aanpassingsvermogen van de methode voor andere celtypen en kolonie geometrieën
We presenteren deze aanpak in de context van het bestuderen van de opkomst van mesodermale transcriptiefactoren in culturen van pluripotente cellen in de aanwezigheid van serum. De methode is echter gemakkelijk aanpasbaar aan andere celtypes en aan serum vrije culturen, hoewel het nodig kan zijn om de concentraties ECM/poloxamer 407 te optimaliseren (Zie tabel 1 voor geteste concentraties en tabel 2 voor een gids voor probleemoplossing). De methode kan ook worden aangepast aan grotere of kleinere maten van micro patronen en aan een breed scala aan vormen op basis van de behoeften van de gebruiker. Bij het vaststellen van de methode is het echter belangrijk om te beseffen dat niet alle combinaties van vorm/celtype optimaal zijn. Bijvoorbeeld, MESC Express hoge niveaus van E-cadherin33,34 waardoor deze cellen te vormen van collectieve structuren spanning gebieden die verstoken zijn van ECM. Deze cellen volgen niet strikt geometrieën met scherpe hoeken of die kleine gaten in het patroon bevatten. Let op bijvoorbeeld dat op de ring van Figuur 3b, de cellen zijn in het proces van het koloniseren van het centrale gebied. In onze handen heeft een kleiner centraal gebied het mESC niet dwingen om ringvormige kolonies te vormen. Het wordt daarom ten zeerste aanbevolen om een verscheidenheid aan geometrieën op te nemen tijdens het ontwerpen van de photomask om de optimale maten en krommingen te kunnen testen en te identificeren die geschikt zijn voor het celtype keuze.
Een andere belangrijke factor om rekening mee te houden is de lengte van het experiment en de proliferatie van de cellen. Voor sommige snel prolifererende celtypen (inclusief pluripotente cellen) kan het moeilijk zijn om cellen op micropatterns gedurende vele dagen te onderhouden (voor mESC drie dagen is een maximum). Ook is het zaaien van cellen op micro patronen niet altijd optimaal voor elke kolonie, dus het is raadzaam om een overmaat aan kolonies te zaaien om reserveonderdelen te krijgen.
Voordeel en beperkingen van de patroon detectiemethode
Een bijzonder voordeel van de methode is de mogelijkheid om “gemiddelde” patronen te detecteren door het combineren van beeldanalyse resultaten van meerdere replicaten (Figuur 5). Dit kan patronen onthullen die niet blijken uit de inspectie van individuele kolonies. Een nadeel van deze ‘ Middelings ‘-aanpak is dat het bepaalde soorten repetitieve patronen kan missen, bijvoorbeeld kleine vlekken of smalle strepen. Echter, deze soorten patroon kan in plaats daarvan worden onthuld met een combinatie van zorgvuldig gekozen patroon maten8. De pijplijn voorbeeld analyse die hier wordt beschreven, biedt ook kwantitatieve gegevens op zowel single cell-als Colony-resoluties die de mogelijkheid bieden om het niveau van Inter-kolonie variabiliteit te onderzoeken (Figuur 5) of om neighbor-analyse uit te voeren op meerdere Weegschaal10.
Een ander belangrijk voordeel van de gemiddeldenmethode is dat het de mogelijkheid biedt om de preferentiële locatie van veel markers in kaart te laten komen zonder te worden beperkt door beschikbare fluor Foren van detectie kanalen. Inderdaad, hoewel we gebruik maken van slechts twee markers van differentiatie in het hier gepresenteerde werk, maakt het vermogen om kolonies te standaardiseren en “gemiddelde” patronen te extraheren het mogelijk om de distributie kaarten van verschillende verzamelingen van kolonies samen te vergelijken in volgorde om de gegeneraliseerde ruimtelijke relaties van markers aan elkaar te onthullen.
Bovendien, hoewel onze focus hier is geweest om markers van differentiatie te bestuderen, kan de analysemethode worden uitgebreid om andere biologische processen te bestuderen waarvoor nucleaire markers beschikbaar zijn. Bijvoorbeeld micropatterning van een cellijn die een fluorescentie-celcyclus indicator35 (fucci) bevat, zou het mogelijk maken om te bestuderen hoe de geometrie van het kolonie niveau de celcyclus gebeurtenissen in de groep kan beïnvloeden.
Toekomstige richtingen
De methode is geschikt voor middellange doorvoer beeldanalyse, echter, Image Acquisition is momenteel niet volledig geautomatiseerd en kan worden beperkt voor zeer grote experimenten. De reguliere regelingen van kolonies moeten het mogelijk maken om volledig geautomatiseerde overname routines te creëren die vergelijkbaar zijn met wat is ontwikkeld voor het gemiddelde van de enkelvoudige cel20. Echter, omdat de grootte van het veld dat nodig is om een kolonie te beeld is groot, mogelijk vereisen mosaicking, en omdat kolonies zijn driedimensionaal, het is zeer wenselijk om zowel dataset grootte en acquisitie tijd te verminderen door het Imaging alleen relevante kolonies. Daarom kunnen toekomstige inspanningen worden besteed aan het ontwikkelen van een ‘ intelligente ‘ Microscoop die relevante kolonies kan identificeren en de beeld coördinaten aan elk monster aanpast. Dit zal niet alleen verminderen tijd en moeite, maar ook voorkomen dat potentiële operator biases.
De analyse pijplijnen kunnen ook efficiënter worden gemaakt door het aantal stappen te verminderen dat de gebruiker moet nemen. We hebben plannen om een mechanisme voor het bouwen van pijpleidingen te bouwen en R rechtstreeks in onze software te integreren (Zie ook problemen met pickcells-API # 3 en pickcells-rjava # 1 in de issue tracker van onze code repositories [https://framagit.org/groups/pickcellslab/-/issues]). De volledige automatisering van de analyseprocedure zal tijd en moeite verminderen en potentiële gebruikers fouten beperken.
Tot slot merken we op dat onze analysemethode het dynamische karakter van cellulair patroon nog niet volledig vastlegt. Sommige beperkte dynamische informatie kan worden geëxtraheerd door het onderzoeken van een tijdreeks van momentopnamen van afbeeldingen8,10,36. Echter, de mogelijkheid om de geschiedenis van de celpopulatie op te nemen is zeer wenselijk als we willen beter begrijpen hoe patronen ontstaat. Een beperking is dat het nauwkeurig volgen van afzonderlijke cellen in een 3D-dichte celpopulatie nog steeds een zeer uitdagende taak is37. Onze cel detectiemethode maakt gebruik van de nucleaire envelop en presteert bijzonder goed op dichte en overlappende celpopulaties28. Live verslaggevers van de nucleaire envelop zijn gemakkelijk beschikbaar28,38 en een voordeel van de micropatterning techniek is dat het kan worden gebruikt om te voorkomen dat de cellen verplaatsen buiten het gezichtsveld tijdens de lange termijn beeldvorming. Over het algemeen zijn we ervan overtuigd dat het geautomatiseerd volgen van cellen haalbaar is met behulp van een combinatie van recent opgerichte tools28,39,40 en dat dit nieuwe inzichten moet opleveren in de fundamentele principes van zelforganisatie.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gefinancierd door een Sir Henry Wellcome post-doctoraats Fellowship (WT100133 to G.B.), een Wellcome Trust Senior Fellowship (WT103789AIA tot S.L.), en een Wellcome Trust PhD studentship to (108906/Z/15/Z tot D.W.). We zijn ook Dr. Manuel Thery dankbaar voor zijn advies over de aanpassing van de photopatterning-techniek.
2-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | handle in fume hood |
1× Master quartz anti-reflective chromium photomask | Toppan Photomask | Custom design | |
24-well plates | Corning | 3526 | |
4-well plates | Nunclon Delta | 176740 | |
5% Donkey Serum | Sigma | D9663 | |
Anti Nuclear pore complex | Abcam | ab24609 | Mouse monoclonal, use 1:1000 |
Anti-Id1 | Biocheck | 37-2 | Rabbit polyclonal, use 1:200 |
Anti-Lamin B1 | Abcam | ab16048 | Rabbit polyclonal, use 1:1000 |
Anti-Tbra | R&D | AF2085 | Goat ployclonal, use 1:400 |
Blocking Solution | NA | NA | 0.1% TritonX-100 0.01% Pluronic F-127 5% Donkey Serum 0.003% Sodium Azide In PBS |
CGR8 mESC | NA | NA | Reference: Mountford et al. PNAS, 1994 |
Fixation solution | NA | NA | 4% PFA diluted in washing solution |
Foetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | Serum batches must be tested to ensure compatibility with ESC maintenance |
Gelatin | Sigma | G1890 | |
Glasgow Minimum Essential Medium | Sigma | G5154 | |
Laboratory Film | VWR | 291-1212 | |
Layout Editor Software | LayoutEditor | NA | https://layouteditor.com/ |
Layout Editor Software | Klayout | NA | https://www.klayout.de/ |
L-glutamine | Gibco | 25030-024 | |
LIF | Millipore | ESG1107 | |
MEM NEAA | Gibco | 11140-035 | |
mESC Culture medium | NA | NA | GMEM 10% FCS 100 U/ml LIF 100 nM 2-mercaptoethanol 1× non-essential amino acids, 2 mM L- glutamine 1 mM sodium pyruvate |
NH4Cl 50mM | Sigma | 9718 | |
Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | CAUTION: Toxic, handle undiluted stocks in fume hood and wear protective equipment |
PBS (immunostaining) | Sigma | P4417 | Dilute in 200ml of ddH2O |
PBS (tissue culture) | Gibco | 11140-035 | |
Plastic slides | Ibidi | IB-10813 | |
Poloxamer 407 | Sigma | P2443 | |
ProLong Gold Antifade Mountant | Molecular Probes | P36930 | |
Sodium Azide | Sigma | 8591 | CAUTION: Toxic, handle in fume hood and wear protective equipment |
Sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | |
TritonX-100 | Sigma | T8532 | |
Trypsin | Gibco | 25200056 | |
UVO cleaner | Jetlight, USA | 42-220 | CAUTION: Follow manufacturer’s safety recommendations |
Washing Solution | NA | NA | 0.1% TritonX-100 0.01% Pluronic F-127 In PBS |