Изоляция и количественная оценка вируса Зика из нескольких органов в мыши
Summary
Цель протокола состоит в том, чтобы продемонстрировать методы, используемые для исследования вирусных заболеваний путем изоляции и количественной оценки вируса Зика, от нескольких органов в мыши после инфекции.
Abstract
Представленные методы демонстрируют лабораторные процедуры для изоляции органов от инфицированных вирусом Зика животных и количественную оценку вирусной нагрузки. Целью процедуры является количественная оценка вирусных титрав в периферических и ЦНС областях мыши в разных точках времени после инфекции или в различных экспериментальных условиях для выявления вирусологических и иммунологических факторов, которые регулируют вирусную инфекцию зика. Продемонстрированные процедуры изоляции органов позволяют как формировать фокус-формировать количественную оценку, так и количественную оценку ПЦР вирусных титров. Методы быстрой изоляции органов предназначены для сохранения вируса титра. Вирусная количественная оценка титра путем проведения спомощьи фокус-формирования позволяет быстро оценить пропускную стоимость вируса Зика. Преимуществом фокусобразующего ассса является оценка инфекционного вируса, ограничение этого анализа является потенциалом токсичности органов, уменьшающей предел обнаружения. Вирусная оценка титра сочетается с количественным ПЦР, а с помощью рекомбинантного РНК-копировальный контроль вирусного генома в органе оценивается с низким пределом обнаружения. В целом эти методы обеспечивают точный быстрый метод высокой пропускной связи для анализа вирусных титеров Зика на периферии и ЦНС инфицированных животных вирусом Зика и могут быть применены для оценки вирусных титр в органах животных, инфицированных большинством патогенных микроорганизмов, включая вирус Денге.
Introduction
Вирус Зика (ЗИКВ) является арбовирус, который принадлежит к семейство flaviviridae, который включает в себя важные нейроинвазивные человеческие патогены, такие как вирус Powassan (POWV), японский вирус энцефалита (JEV), и вирус Западного Нила (WNV)1. После его изоляции и идентификации, периодически поступают сообщения оинфекциях, инфекциях, инфицированных людьми в Африке и Азии 2,3,4,5,и эпидемиях в Центральной и ссылка6). Тем не менее, он не был до недавнего времени, что ЗИКВ считалось причиной тяжелой болезни7. В настоящее время существуют тысячи случаев неврологических заболеваний и врожденных дефектов, связанных с инфекциями ЗИКВ. Быстрое появление ЗИКВ вызвало много вопросов, связанных с: почему наблюдается увеличение тяжести заболевания, какова иммунологическая реакция на инфекцию ЗИКВ и существуют вирусные и/или иммунные опосредованные патологии, связанные с увеличением неврологических проявления и врожденные дефекты. В настоящее время существует спешка, чтобы понять, центральной нервной системы (ЦНС), связанных с болезнью, связанной с ЗИКВ, а также необходимость быстрого тестирования эффективности противовирусных препаратов и вакцин против ЗИКВ. Именно на этом фоне мы разработали методы быстрого анализа титров ЗИКВ как на периферии, так и в ЦНС с использованием анализа фокус-образующих фокусов (FFA) с помощью анализа, формирующего фокусы ,IKV).
Малые модели животных важны для понимания прогрессирования заболевания и для ранней оценки вакцин, терапевтических препаратов и противовирусных препаратов. Мы создали небольшие модели животных для изучения арбовирусной болезни с помощью различных штаммов мыши для моделирования инфекции человека и защиты от вирусных патогенов8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Используя этот предыдущий опыт, мы начали изменять методы, используемые для оценки WNV и денге вирус, связанный флавивирус для оценки ЗИКВ титер в обоих периферических органов, а также ЦНС21,23, 24. Преимущества этих методов по сравнению с другими анализами: 1) что они сочетают в себе способность собирать как периферийные, так и cnS органов для анализа; 2) методы адаптируются для цитометрии потока, для измерения врожденных и адаптивных иммунных реакций, наряду с вирусными титерами на одном животном в том же органе; 3) техника сбора урожая адаптируется для гистологического анализа; 4) FFA зиКВ является быстрым методом высокой пропускной их возможности для анализа вирусного титра; и 5) эти методы могут быть применены для оценки вирусных титр в органах животных, инфицированных большинством патогенов25.
Protocol
Representative Results
Discussion
Инфекция ЗИКВ может вызвать неврологическое заболевание, поэтому нынешние модели животных для изучения патогенеза, иммунных реакций и защитной эффективности вакцин и противовирусных препаратов должны сосредоточиться на вирусном контроле в рамках ЦНС. Одна из проблем в фокусировке н…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Д-р Пинто финансируется за счет семенного гранта от Университета Сент-Луиса школы медицины и запуска средств из Университета Сент-Луиса школы медицины. Д-р Бриен финансируется K22AI104794 раннего следователя награду от NIH NIAID, а также семян грант от школы Университета Сент-Луиса. Для всех финансируемых лиц спонсоры не имели никакой роли в разработке, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.
Materials
| 1-bromo-3-chloropropane (BCP) | MRC gene | BP151 | |
| 10cc syringe | Thermo Fisher Scientific | BD 309642 | |
| 18G needle | Thermo Fisher Scientific | 22-557-145 | |
| 1cc TB syringe | Thermo Fisher Scientific | 14-823-16H | |
| 20cc syringe | Thermo Fisher Scientific | 05-561-66 | |
| 24 tube beadmill | Thermo Fisher Scientific | 15 340 163 | |
| 3.2 mm stainless steel beads | Thermo Fisher Scientific | NC9084634 | |
| 37C Tissue Culture incubator | Nuair | 5800 | |
| 4G2 antibody | in house | ||
| 96 well flat bottom plates | Midsci | TP92696 | |
| 96well round bottom plates | Midsci | TP92697 | |
| Basix 1.5ml eppendorf tubes | Thermo Fisher Scientific | 02-682-002 | |
| Concentrated Germicidal Bleach | Staples | 30966CT | |
| CTL S6 Analyzer | CTL | CTL S6 Universal Analyzer | |
| curved cutting scissors | Fine Science Tools | 14061-11 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose With 4500 mg/L glucose | MilliporeSigma | D5671 | |
| Ethanol (molecular biology-grade) | MilliporeSigma | e7023 | |
| Fetal Bovine Serum | MilliporeSigma | F0926-500ML | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11036-20 | |
| Glacial acetic acid | MilliporeSigma | 537020 | |
| Goat anti-mouse HRP-labeled antibody | MilliporeSigma | 8924 | |
| HEPES 1 M | MilliporeSigma | H3537-100ML | |
| Isopropanol (molecular biology-grade) | MilliporeSigma | I9516 | |
| Ketamine/Xylazine cocktail | Comparative Medicine | ||
| L-glutamine | MilliporeSigma | g7513 | |
| Magmax RNA purification kit | Thermo Fisher Scientific | AM1830 | |
| Methylcellulose | MilliporeSigma | M0512 | |
| Microcentrifuge | Ependorf | 5424R | |
| MiniCollect 0.5ml EDTA tubes | Bio-one | 450480 | |
| o-ring tubes | Thermo Fisher Scientific | 21-403-195 | |
| one step q RT-PCR mix | Thermo Fisher Scientific | 4392938 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | EMS- 15713-S | |
| Phosphate Buffered Saline | MilliporeSigma | d8537-500ml | |
| Proline multichannel pipettes | Sartorius | 72230/72240 | |
| Proline single channel pipettes | Sartorius | 728230 | |
| RNAse free water | Thermo Fisher Scientific | 10-977-023 | |
| RNAzol BD | MRC gene | RB192 | |
| Rocking Platform | Thermo Fisher Scientific | 11-676-333 | |
| RPMI 1640 | Fisher | MT10040CV | |
| Saponin | MilliporeSigma | s7900 | |
| spoon/spatula | Fine Science Tools | 10090-17 | |
| straight cutting scissors | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| Triton X-100 | MilliporeSigma | t8787 | |
| True Blue Substrate | VWR | 95059-168 | |
| Trypsin | MilliporeSigma | T3924-100ML |
References
- Lazear, H. M., Diamond, M. S. Zika Virus: New Clinical Syndromes and Its Emergence in the Western Hemisphere. Journal of Virology. 90 (10), 4864-4875 (2016).
- Simpson, D. I. Zika Virus Infection in Man. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 58, 335-338 (1964).
- Fagbami, A. Epidemiological investigations on arbovirus infections at Igbo-Ora, Nigeria. Tropical and Geographical Medicine. 29 (2), 187-191 (1977).
- McCrae, A. W., Kirya, B. G. Yellow fever and Zika virus epizootics and enzootics in Uganda. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 76 (4), 552-562 (1982).
- Rodhain, F., et al. Arbovirus infections and viral haemorrhagic fevers in Uganda: a serological survey in Karamoja district, 1984. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 83 (6), 851-854 (1984).
- Wikan, N., Smith, D. R. Zika virus: history of a newly emerging arbovirus. Lancet Infect Dis. 16 (7), e119-e126 (2016).
- . Zika virus outbreaks in the Americas. The Weekly Epidemiological Record. 90 (45), 609-610 (2015).
- Brien, J. D. . Immunological basis of age-related vulnerability to viral infection. , (2007).
- Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Nikolich-Zugich, J. West Nile virus-specific CD4 T cells exhibit direct antiviral cytokine secretion and cytotoxicity and are sufficient for antiviral protection. Journal of Immunology. 181 (12), 8568-8575 (2008).
- Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Hirsch, A., Wiley, C. A., Nikolich-Zugich, J. Key role of T cell defects in age-related vulnerability to West Nile virus. Journal of Experimental Medicine. 206 (12), 2735-2745 (2009).
- Brien, J. D., et al. Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3. Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).
- Shrestha, B., et al. The development of therapeutic antibodies that neutralize homologous and heterologous genotypes of dengue virus type 1. PLoS Pathogens. 6 (4), e1000823 (2010).
- Brien, J. D., et al. Interferon regulatory factor-1 (IRF-1) shapes both innate and CD8(+) T cell immune responses against West Nile virus infection. PLoS Pathogens. 7 (9), e1002230 (2011).
- Pinto, A. K., et al. A temporal role of type I interferon signaling in CD8+ T cell maturation during acute West Nile virus infection. PLoS Pathogens. 7 (12), e1002407 (2011).
- Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Current Protocols in Microbiology. 31, 11-15 (2013).
- Brien, J. D., et al. Protection by immunoglobulin dual-affinity retargeting antibodies against dengue virus. Journal of Virology. 87 (13), 7747-7753 (2013).
- Messaoudi, I., et al. Chikungunya virus infection results in higher and persistent viral replication in aged rhesus macaques due to defects in anti-viral immunity. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (7), e2343 (2013).
- Pinto, A. K., et al. A hydrogen peroxide-inactivated virus vaccine elicits humoral and cellular immunity and protects against lethal West Nile virus infection in aged mice. Journal of Virology. 87 (4), 1926-1936 (2013).
- Sukupolvi-Petty, S., et al. Functional analysis of antibodies against dengue virus type 4 reveals strain-dependent epitope exposure that impacts neutralization and protection. Journal of Virology. 87 (16), 8826-8842 (2013).
- Pinto, A. K., et al. Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis. PLoS Pathogens. 10 (4), e1004086 (2014).
- Pinto, A. K., et al. Defining New Therapeutics Using a More Immunocompetent Mouse Model of Antibody-Enhanced Dengue Virus Infection. MBio. 6 (5), (2015).
- Pinto, A. K., et al. Human and Murine IFIT1 Proteins Do Not Restrict Infection of Negative-Sense RNA Viruses of the Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, and Filoviridae Families. Journal of Virology. 89 (18), 9465-9476 (2015).
- Hassert, M., et al. CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection. PLoS Pathog. 14 (9), e1007237 (2018).
- Pinto, A. K., et al. Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis. PLoS Pathog. 10 (4), e1004086 (2014).
- Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Curr Protoc Microbiol. 31, (2013).
- Hassert, M., et al. CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection. PLoS Pathogens. 14 (9), e1007237 (2018).
- Fuchs, A., Pinto, A. K., Schwaeble, W. J., Diamond, M. S. The lectin pathway of complement activation contributes to protection from West Nile virus infection. Virology. 412 (1), 101-109 (2011).
- Lazear, H. M., Pinto, A. K., Vogt, M. R., Gale, M., Diamond, M. S. Beta interferon controls West Nile virus infection and pathogenesis in mice. Journal of Virology. 85 (14), 7186-7194 (2011).
