コンカナバリンによる涙腺への注射によって誘発される水性欠損性ドライアイ病のウサギモデル:薬物有効性研究への応用

すべての動物研究は、ストーニーブルック大学の機関審査委員会によって承認され、眼科および視覚研究における動物の使用に関するARVO声明に従って行われました。 1. 動物と住宅 体重2~3kgのニュージーランド・ホワイト(NZW)ウサギを獲得。 ウサギを厳しい温度(65±5 °F)と湿度(45±5%)でケージに一匹収容するコントロール。照明のオン/オフサイクルは 12 時間にする必要があります。 水と標準的なウサギのチャウへの無制限のアクセスを提供します。彼らは目に影響を与えるビタミンAを含んでいる可能性があるため、食事の豊かさを排除します。 ベースライン対策またはドライアイの誘導の前に少なくとも2週間動物を順応させる。 2. 麻酔法と安楽死 注:すべての手順は、中程度の沈下を必要とするCon A注射を除いて、軽度の沈血を必要とします。 軽度の沈血の場合は、26ゲージの針を使用して肩の上にアセプロマジン(1mg/kg)を皮下に注入する。軽度の沈血のためのエンドポイント:動物は耳葉がもはや完全に直立しないリラックスした頭部の位置を維持する。注: 適切なエンドポイントに達していない場合、アセプロマジンの追加の注入が与えられる。動物は常に目を覚まし、ひげの触れに反応し、呼吸が遅くなることは決してありません。 適度な沈食のために、まず動物に上記のようにアセプロマジンを与える。エンドポイントに到達すると(上記の注を参照)、O2フローが1 L/minに設定され、イソフルラン送達量が5%に設定されたガスマスクを使用してイソフルランを与える(図2)。 ウサギの体の調子が完全にリラックスし、耳が完全にフロッピーになるまでイソファフルランを投与します。注:動物が横に回っているとき、補正筋肉の動きは起こるべきではありません。呼吸は常に自発的なままです。 自然回復は2〜5分以内に起こる:徴候は、自発的な頭部運動および増加または正常な筋肉の緊張を含む。実験手順が中程度の沈座で完了した後、ウサギの行動が正常に戻るまで約30分間観察します。注:いずれの形態の沈血中も、眼用軟膏は必要ありません。1)軽度の沈血では、動物はまだ警戒し、瞬く間反射を維持しています。中程度の沈血では、瞬き反射の阻害は非常に短く、眼表面が危険にさらされない。2) 眼表面上の眼用軟膏の配置は、試験中に評価された構造の可視化を妨げる。 安楽死: 静脈内ペントバルビタールの過剰摂取を使用します (100 mg/kg). 3. ニチタ性膜の除去 順応期間中(通常は最初の週)に除去を行い、角膜の完全かつ正確な評価を可能にする。 右のニシタリング膜への注入注:両眼のnictating膜を取り除く場合は、1回のセッションでこれを行うのが最も簡単です。片目から始め、説明に従って進みます。説明をわかりやすくするために、この方法は右目から始まります。 適切なサイズの拘束袋にウサギを入れます。 ステップ2.1で説明したように軽度の沈降を誘発する。 マイクロピペットを使用して、右目に25 μLの防腐剤フリーリドカインを塗布します。 柔軟なワイヤー蓋鏡を瞼の間に置きます。 0.3鉗子(または同等)を使用して、その頂点で刺激膜をつかみ、角膜の上に伸ばします。 リドカイン1%、1:100,000エピネフリンを26ゲージ鋭い針を用いてニチタティング膜の基部に結膜下に注入する(図3A)。適度なブレブは、ニチタリング膜の上に形成する必要があります. 鏡を取り外します。 左のニチタ膜と同一の注入を行う。 ニチタリング膜を切断する 約5分後、蓋の鏡を右目に戻します。0.3鉗子(または類似)を使用して、頂点でnictating膜をつかみ、引き込む。 ウェストコットはさみまたは同等のシストを使用して、そのベースでnictating膜を切り落とします(図3B)。注:出血は最小限であり、通常は焼灼を必要としません。それにもかかわらず、高温電池焼灼は、追加の止止めが必要な場合に備えて、常に近くに保管されています。 鏡を取り外します。 眼に外用抗生物質軟膏(例えば、ネオマイシン、ポリミキシン、バシトラシン、ヒドロコルチゾン)を配置する。 ハーダーランド腺はそのままにしておきます。硬膜が後退すると、硬膜腺が時々見られる。注:ニチア性膜を除去した後、鼻または上の結膜領域に大きな白い塊または組織の標高が見られる場合、膜は、難解腺が自発的に脱出することを可能にし、その基に近すぎる切除された。後続の手順でこれを防ぐために、ベースに刺激膜の多くを残します。 さらに操作を行うか、眼表面アッセイが行われる前に、少なくとも1週間は眼表面を治癒させます。 4. ドライアイパラメータの測定と涙液サンプルの収集 注: DED パラメータは、スタディ プロトコルのニーズに基づいて測定します(例えば、ベースラインとその後の指定された時点で)。DEDの測定は、毎回忠実に複製するために厳密な努力で、次の順序で行われるべきです。概日変動を最小限に抑えるために、ほぼ同じ時刻(±1時間)にすべての動物をテストします。これらの測定には通常、2人の調査員のチームが必要です。 ウサギを拘束袋に入れます。軽度の沈血を誘発する。 ティアオスモルシティ22 まぶたを5~10回手動で点滅して、眼表面に涙層を均等に分配します。 下蓋を軽く引き込みます。 下部フォルニックスに沿ってパルペブラルとバルバー結膜の接合部にTearLabオスマメーターで涙をサンプリング, ちょうど切り捨てられたニキタ膜の基部に後部. 製造元の指示に従って TearLab オスモルシティ テストを使用して浸透度を測定します。 涙の破綻時間(TBUT) このアッセイのために部屋を暗くする。 まぶたの間にワイヤー蓋の鏡を置きます。 マイクロピペットを使用して、角膜表面に0.2%のフルオレセインの50μLの低下を加えます。角膜上のフルオレセインの分布が最初のドロップで得られない場合は、2回目のドロップを配置する。 即時にタイマーを開始します。 青い光の下で前角膜の涙フィルムを観察します。TBUT は、黒いドット、線、またはフルオレセインフィルムの明らかな破壊を開発するのに要する時間として定義されます (図 4)。必要に応じて、+1.50倍率を提供する外科ルーペを使用して、早期の破綻の兆候をよりよく視覚化します。最大1分間監視します。ここで定義されているブレークアップが 1 分後に発生した場合は、60 s のみの TBUT を記録します。 シルマーの涙のテスト(STT) 25 μLの防腐剤を含まないリドカインを眼表面に塗布します。 残留リドカインおよび任意の涙液を吸収するために、劣ったフォルニックスにウェック細胞外科用槍を置きます。必要に応じて、下まぶたをスポンジの近位端を覆って所定の位置に保つのを助けます(図5A)。 約30sの後、Weckスポンジを取り外します。 すぐに下蓋の中間点で角膜と手脈結膜の間のスペースにシルマーの涙のテストストリップを挿入します。 タイマーをすぐに起動します(図5B)。 5分後、ストリップの湿った部分の長さを測定します。これは STT 値です。 三重で測定を実行し、3つの測定値の平均をSTT値として報告します。 涙液サンプルの収集 ラクトフェリンなどの各種の分析物のレベルをアッテ言う涙液サンプルを採取するために、STT値が5分で記録された後、少なくとも20mmの湿潤が得られるまでストリップを所定の位置に残す。注: DED が誘発された後に十分な濡れが生じない場合は、ストリップを下側のフォルニックスに深く進めて、このエンドポイントに妥当な時間内に到達できるようにしてください。 湿ったストリップを切り、すぐに490 μLのチルドティアコレクションバッファ(4%BSA、1M NaCl、0.1%Tween-20 PBSでプロテイナーゼ阻害剤カクテル)に入れます。 サンプルは-80°Cで保存できるまで氷の上に保管し、アッセイされるまで残ります。 ローズ ベンガル染色(RBS) マイクロピペットを使用して角膜に1%の防腐剤フリーリドカインの50 μLを塗布します。 30秒後、1%のバラベンガルの25μLを眼表面に置き、まぶたを手動で点滅させ、均等に分配します。 即時にタイマーを開始します。 3.5分で、蓋の間にワイヤー蓋の鏡を置きます。 4.0分で、上の結膜と角膜の表面を撮影します(図6)。メモ:使用するカメラのタイプに合わせて調整します。標準的な設定:デジタル一眼レフカメラ、絞り優先モード(絞り13以上)、ISO 6000、100mmマクロレンズ2本の12.5mm延長チューブ、手動焦点モード、最大倍率のレンズ、およびスルー・ザ・スルー・ザ・レンズ・モードで自動設定されたマクロ/リング・フラッシュからのイルミネーション。リングフラッシュのフォーカスランプは、角膜に焦点を当てるのを助けるためにオンになっています。 1分以内に両目のすべての写真を完成させます。 スコア眼面染色NEI法23を用いて以下のように修正した。6の別々の結膜ゾーンを等級で指定しないでください。各目の優れた結膜をスコア。これは、地球を操作することなく簡単に撮影された結膜面の部分です。操作は、実際に眼表面の染色を変更する可能性があります。 涙ラクトフェリンレベルは、涙腺からの涙液産生の代理尺度である。アッセイ涙ラクトフェリンは、上記のように回収された涙液中に、製造者の指示に従って酵素結合免疫吸着アッセイ24キットを用いた。 5. ドライアイの誘導と治療 注:眼窩涙腺系の3つの部分が注入されます。 アセプロマジン0.2mg/kg皮下でウサギを鎮静させます。 眼窩周囲および頭皮領域の毛皮をせん断し、ナイルを使用して残留毛皮を完全に取り除きます。解剖学的特徴とコンカナリンAの米国ガイド注入のより良い視覚化のために完全に滑らかな肌を残します (図7). 上述のように中等度の沈座を誘発する。 上涙腺(PSLG)のパルペブラル部分の注入メモ:最初にPSLGのインジェクションを実行します。 マイクロピペットで適切な眼25μLの防腐剤フリーリドカイン1%を塗布します。 上まぶたをエベトし、腺のパルペブラル部分を示す突起が見られるまで後方眼窩に穏やかな内側圧を加える。PSLGは、上蓋の後部(時間)部分に小さな球根高として現れます。注: 学習プロセス中に腺組織を表示するには、領域に 5% のフルオレセインを適用します (図 8A)。球根PSLGから涙が流れているのが見えます。蛍光管の適用はCon Aの管理のために必要ではない;腺組織を示すために、それは、イラストレーションの目的のためにのみ行われます。 細歯の鉗子と27ゲージの注射器注射器の針を使用して、直結型アプローチを使用して腺を直接貫通する。針を組織に2mm進め、0.1 mLの体積で500μgのコンAを注入します(図8B)。注: この注射は時々痛みを伴うことがあります。.必要に応じて、この注射が完了するまで動物をイソファフルランの下に保管してください。 眼上涙腺の注入(OSLG)注: OSLG は、連続して続けて続きます。 内側圧を地球に適用し、OSLG が後面の強制から突き出ます(必要に応じて解剖学については ref25を参照)。後部の振動から OSLG の突起を使用して、内側の圧力を地球に適用します (図 9、赤い矢印) 。プロチューブは、後の強制を見つけるための総局在化として機能します。 頭蓋骨の骨の開口部が感じられるまで、先端を閉じた湾曲した鉗子を使用して領域をインデントします。これは、突起下の前/後方向を持つスリット状になります。 鉗子を使ってささやかな圧力をかけ、皮膚にくぼみを残し、針の配置の目印となる(図10A)。 インデントマークの上に皮膚に垂直な針(27ゲージ、5/8インチ針のツベルクリンジ)を挿入し(図10B)〜1/4インチをインシュアに挿入し、注射部位と骨状軌道リムの中間点を目指して後方および外部に針を方向に向けます。注:インシカルが針で正確に標的にされていない場合、頭蓋骨はその進歩を妨げ、 針のハブに達したら、1000 μgのコンAを0.2 mLの体積でゆっくりと注入します(図10C)。 PSLG と OSLG の両方の注入を 2-3 分以内に完了します。 イソファフルランのセドレーションから動物を取り除きます(まだ行われていない場合)。下垂体腺(ILG)の注射は、通常、さらなる沈着なしで完了することができる。 下涙腺の注射 横から動物を見る。ILGの目立ちは、軌道の下側の前部に沿って見ることができます(図11A)。 ILG腺の表面部分が頬骨上の表面的な(より外部の)休息場所から軌道上のより内側の位置に移行する皮膚上の外科的マーキングペンまたは適切な永久的なマーカーを使用して垂直線を引く。これは通常、前肢に劣っています(図11A)。 皮膚上のこの線を横切って垂直に保持された米国のプローブを掃引することによって、頬骨の端を特定します。ILG遷移は、腺の像が明らかに外接する(ザイゴマティック骨の超エコー線が画像の腺の下端に沿って見られる)から、認識可能な内側の境界のないものに変化する場合に起こる(ザイゴマティック骨エコーはもはや存在しない)。. 米国の画面がこの変化を示すときに、スキンに描かれた線に対するハンドピースの相対位置を観察します。これは、Con Aを与える必要がある「注射部位」です。 射状アーチの骨の内側のポイントでCon Aを腺に入れるように注射の深さを制御します。 注入の深さを次のように決定する:必要な注入深度を、ザイゴマティックボーンの深さ(超EchoIc)+1mmに設定します。 針を「注射部位」〜12mmの腺に挿入し、体外の露出した針の長さ(外科用キャリパーで測定)が5.8.6で計算された差と等しくなるまでゆっくりと引き出す(図12)。0.2 mLで1000μgのコンAを注入します。注:腺のカプセルが穿孔され、単に針で押されないようにするために、針は、その撤退が始まる前に、〜12mmまたはハブにほぼ挿入する必要があります。 米国を繰り返して、注射の成功を確認します。ILG は、特徴的な低響空間を示すはずです (図 1)。注:ILG注射は、動物26によって最もよく許容されるものであり、したがって、最後に行われます。 10分以内に両眼のすべての腺を注入するために全体の手順を完了します。これには、手順の能力の達成が必要になります。注:2眼窩涙腺への注射の単一のセットは、1〜2週間持続する急性DEDを誘発します。 より長い期間のDEDの場合、7日ごとに上記とまったく同じようにCon Aを注入します。このような注射が正常に行われている 6 まで。 6. 手続き後のケア Con Aの注射後、少なくとも10〜20分間、または麻酔効果が消耗するまで、拘束袋に入っている動物を監視します。 彼らは胸骨の回復を維持するために十分な意識を取り戻すまで、動物を放置しないでください。完全に回復するまで、それらを個々のケージに戻さないで下します。 処置後の痛みは通常軽度であり、48時間未満続く。必要に応じて、皮下ケトロラック(5 mg/kg)の単回投与を与える。より激しい痛みのために、皮下ブプレノルフィンを8時間ごとに0.1mg/kg与える。