Menselijke blastocyst biopsie en vitrificatie
Summary
Blastocyst biopsie en vitrificatie zijn vereist voor het efficiënt uitvoeren van preimplantatie genetische testen. Een aanpak die de sequentiële opening van de zona pellucida en het ophalen van 7-8 trophectoderm cellen in dag 5-7 post-inseminatie beperkt zowel het aantal benodigde manipulaties en de blootstelling van het embryo aan suboptimale omgevingscondities.
Abstract
Blastocyst biopsie wordt uitgevoerd om een betrouwbare genetische diagnose te verkrijgen tijdens IVF-cycli met pre-implantatie genetische testen. De ideale workflow omvat dan een veilig en efficiënt vitrificatie protocol, door de doorlooptijd van de diagnostische technieken en om de geselecteerde embryo (s) over een fysiologisch endometrium over te brengen in een volgende natuurlijke cyclus. Een biopsie benadering die de sequentiële opening van de zona pellucida omvat en het opvragen van 5-10 trophectoderm cellen (idealiter 7-8) beperkt zowel het aantal benodigde manipulaties als de blootstelling van het embryo aan suboptimale omgevingscondities. Na de juiste training, de techniek was reproduceerbaar over verschillende exploitanten in termen van timing van biopsie (~ 8 min, variërend 3-22 min op basis van het aantal embryo’s tot biopsie per gerecht), definitieve diagnoses verkregen (~ 97,5%) en levende geboortecijfers na verglaasd-opgewarmde euploïde blastocyst overdracht (> 40%). De overlevingskans na biopsie, vitrificatie en opwarming was zo hoog als 99,8%. De re-expansie snelheid bij 1,5 uur van opwarming van de aarde was zo hoog als 97%, grotendeels afhankelijk van de timing tussen biopsie en vitrificatie (idealiter ≤ 30 min), blastocyst morfologische kwaliteit en de dag van de biopsie. In het algemeen is het beter om een ingeklapte blastocyst te vitrificeren; Daarom kan in niet-PGT-cycli lasergeassisteerde kunstmatige krimp worden uitgevoerd om embryo-instorting voorafgaand aan cryopreservation te induceren. Het meest veelbelovende toekomstperspectief is de niet-invasieve analyse van de IVF-cultuur media na de blastocyst-cultuur als een bron van embryonaal DNA. Deze potentiële avant-garde wordt echter nog steeds onderzocht en een betrouwbaar protocol moet nog worden gedefinieerd en gevalideerd.
Introduction
Het belangrijkste doel van de moderne menselijke embryologie is om het aantal levende geboorten per gestimuleerde cyclus te maximaliseren en kosten, tijd en inspanningen om een zwangerschap te bereiken te verminderen. Om dit doel te bereiken, moeten gevalideerde benaderingen voor embryoselectie worden gebruikt om reproductief bevoegde embryo’s te identificeren binnen een cohort die tijdens een IVF-cyclus is verkregen. Volgens de laatste bewijzen is blastocyst Culture1 in combinatie met uitgebreide chromosomale testen en verglaasd euploïde embryo transfer (et) het meest efficiënte kader om IVF-efficiëntie2te verhogen. Het is duidelijk dat een aneuploïdie test een embryonaal specimen vereist, dat op dit moment meestal wordt weergegeven uit enkele cellen die worden opgehaald uit de trophectoderm (TE), d.w.z. het gedeelte van de blastocyst dat oorsprong geeft aan de embryonale bijlagen (bijv. de placenta) tijdens de zwangerschap . Naast de karyotype analyse, kunnen ook enkelvoudige genmutaties worden beoordeeld vanuit een TE biopsie als onderdeel van een klinische strategie die bekend staat als pre-implantatie genetische tests (PGT;-A voor aneuploidies,-SR voor structurele chromosomale herschikkingen,-M voor monogene ziekten). Andere methoden van eicel/embryo biopsie zijn theorie en de laatste decennia klinisch aangenomen, namelijk polaire lichamen biopsie en blastomere biopsie. Het gebruik ervan wordt tegenwoordig echter verminderd, omdat hun procedurele nadelen (bijv. hogere werklast en risico op reproductieve impact) en diagnostische beperkingen (bijv. problemen met één cel-analyse) impliciet een voldoende evenwicht tussen kosten, Risico’s en voordelen (voor een beoordeling Zie3).
In dit document wordt een van de belangrijkste protocollen voor TE biopsie grondig beschreven, samen met de daaropvolgende verglavering, opwarming en overdrachtsprocedures vereist. De werkstroom die hier wordt geschetst is ideaal voor een drukke PGT-eenheid.
Zoals al eerder beschreven door onze groep4,5, de procedure omvat de sequentiële opening van de zona pellucida van volledig geëxpandeerde blastocysten en verwijdering van enkele te cellen (gemiddeld 7-8). Vergeleken met de dag 3 Laser-geassisteerde hatching gebaseerde blastocyst biopsie methode6, deze procedure zou kunnen verlichten het dagelijkse schema van een IVF-eenheid waar delicate procedures, zoals blastocyst biopsie en vitrificatie, moet tijdig worden uitgevoerd. Zodra de blastocyst zijn volledige expansie bereikt, kan de biopsie worden uitgevoerd door het selecteren van de TE cellen te verwijderen, waardoor het risico van herniatie van de binnenste celmassa (ICM), die anders de procedure uitdagend zou maken. In de literatuur is ook een derde Protocol van blastocyst biopsie beschreven, waarbij Laser-geassisteerde broedeieren worden uitgevoerd zodra het embryo al het blastocyst-stadium heeft bereikt, enkele uren voor de procedure5,7. Deze aanpak is echter meer tijdrovend en is vooral geschikt voor IVF-eenheden die TE biopsie uitvoeren in de handen van limitedly ervaren exploitanten en met het oog op een gematigde en lage dagelijkse werklast.
Intracytoplasmatische sperma injectie (ICSI)8 moet een geconsolideerde techniek zijn als het gaat om het uitvoeren van genetische analysen in IVF. Evenzo is een goed cultuur systeem om embryo’s veilig te oogsten in de blastocyst-fase van cruciaal belang voor de uitvoering van de biopsie strategie. Een voldoende aantal incubators, evenals het gebruik van lage zuurstofspanning zijn belangrijke voorwaarden voor dit doel, niet te compromitteren de blastocyst rate9. Tegelijkertijd is een efficiënt cryopreservatie-programma nodig om een PGT-cyclus veilig te beheren. In de afgelopen tien jaar heeft de implementatie van vitrificatie de embryo Cryo-overlevingskansen zelfs tot > 99%10,11versterkt. Dit voorzag in voldoende tijd om genetische tests uit te voeren en embryo-overdracht uit te stellen naar de volgende menstruatiecyclus, op een niet-gestimuleerd en waarschijnlijk ontvankelijker endometrium12.
Zowel de biopsie als de vitrificatie zijn veeleisende taken waarvoor strenge vaardigheden nodig zijn en de effectiviteit ervan kan variëren tussen niet-ervaren operators. Een specifieke opleidingsperiode wordt daarom bepleit voordat elke exploitant deze procedures klinisch kan uitvoeren; Bovendien moet de instandhouding van de vaardigheden van de exploitanten periodiek worden geëvalueerd door monitoring van Key Performance Indicators (KPI) voor cryopreservatie en biopsie procedures. Elke IVF-kliniek moet daartoe interne Kpi’s instellen, die de door internationale consortia gepubliceerde en/of de door de referentielaboratoria gepubliceerde uitkomsten moeten benaderen.
TE biopsie, vitrificatie-opwarming en getuige procedures zijn gevalideerde technieken in onze eenheid, die zijn gestandaardiseerd in alle betrokken operatoren zoals gerapporteerd in drie eerdere publicaties11,13,14 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Alleen goed ervaren, bekwame embryo logen die hun trainingsperiode hebben voltooid, moeten zowel TE biopsie als blastocyst vitrificatie uitvoeren. Bovendien is een getuige vereist om de procedures te monitoren en een efficiënte traceerbaarheid te garanderen tijdens i) de bewegingen van de biopsied blastocyst uit de biopsie schotel (aanvullend figuur 1) naar de post-biopsie schotel (aanvullend figuur 1 ), vervolgens op de vitrificatie plaat (aanvullend figuur 1) en ten s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AG en RM hebben de gegevens verzameld en het manuscript opgesteld. DC analyseerde de gegevens, stelde de representatieve resultaten voor, voerde de statistieken uit en reviseerde het manuscript. FMU en LR hebben een kritische bespreking van de resultaten en van het hele manuscript gegeven.
Materials
| Equipment | |||
| Cold tube rack | Biocision | XTPCR96 | |
| Electronic pipette controller | Fisher Scientific | 710931 | |
| Flexipet adjustable handle set | Cook | G18674 | Stripper holder |
| Gilson Pipetman | Gilson | 66003 | p20 |
| IVF Electronic Witness System | CooperSurgical Fertility & Genomic Solutions | RI Witness ART Management System | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TE2000-U | |
| Laminar Flow Hood | IVF TECH | Grade A air flow | |
| Laser objective | RI | Saturn 5 | |
| Microinjectors | Nikon Narishige | NT-88-V3 | |
| Mini centrifuge for PCR tubes | Eppendorf | CSLQSPIN | for 0.2ml PCR tubes |
| Stereomicroscope | Leica | Leica M80 | |
| Thermostat | Panasonic | MCO-5AC-PE | |
| Tri-gas incubator | Panasonic | MCO-5M-PE | 02/CO2 |
| Consumables | |||
| Biopsy pipette | RI | 7-71-30FB35720 | 30µm ID, flat 35°C |
| Cryolock | Cryolock | CL-R-CT | |
| CSCM complete | Irvine Scientific | 90165 | IVF culture medium supplemented with HSA |
| Embryo Transfer Catheter | Cook | G17934 | |
| Flexipet pipette | Cook | G26712 | 140µm stripping pipette tip |
| Flexipet pipette | Cook | G46020 | 300µm stripping pipette tips |
| Holding pipette | RI | 7-71-IH35/20 | 30µm ID, flat 35°C |
| Human Serum Albumin | Irvine Scientific | 9988 | |
| IVF One well dish | Falcon | 353653 | |
| Mineral Oil for embryo culture | Irvine Scientific | 9305 | |
| Modified HTF Medium | Irvine Scientific | 90126 | Hepes-Buffered medium |
| Nuclon Delta Surface | Thermofisher scientific | 176740 | IVF dish 4-well plate with sliding lid |
| Primaria Cell culture dish | Corning | 353802 | 60x15mm |
| Reproplate | Kitazato | 83016 | |
| Serological pipette | Falcon | 357551 | 10ml |
| Sterile disposable Gilson tips | Eppendorf | 0030 075.021 | 200µl |
| Tubing Kit | Provided by the genetic lab | PCR tubes (0.2mL), loading solution, biopsy washing solution | |
| Vitrification media | Kitazato | VT801 | Equilibration and vitrification solutions |
| Warming media | Kitazato | VT802 | Thawing and dilution solutions |
References
- Glujovsky, D., Farquhar, C., Quinteiro Retamar, A. M., Alvarez Sedo, C. R., Blake, D. Cleavage stage versus blastocyst stage embryo transfer in assisted reproductive technology. Cochrane Database of Systematic Reviews. (6), CD002118 (2016).
- Dahdouh, E. M., Balayla, J., Garcia-Velasco, J. A. Comprehensive chromosome screening improves embryo selection: a meta-analysis. Fertility and Sterility. 104 (6), 1503-1512 (2015).
- Cimadomo, D., et al. The Impact of Biopsy on Human Embryo Developmental Potential during Preimplantation Genetic Diagnosis. Biomedical Research International. 2016, 7193075 (2016).
- Capalbo, A., et al. Correlation between standard blastocyst morphology, euploidy and implantation: an observational study in two centers involving 956 screened blastocysts. Human Reproduction. 29 (6), 1173-1181 (2014).
- Capalbo, A., et al. Implementing PGD/PGD-A in IVF clinics: considerations for the best laboratory approach and management. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. , (2016).
- McArthur, S. J., Leigh, D., Marshall, J. T., de Boer, K. A., Jansen, R. P. Pregnancies and live births after trophectoderm biopsy and preimplantation genetic testing of human blastocysts. Fertility and Sterility. 84 (6), 1628-1636 (2005).
- Kokkali, G., et al. Birth of a healthy infant following trophectoderm biopsy from blastocysts for PGD of beta-thalassaemia major. Human Reproduction. 20 (7), 1855-1859 (2005).
- Rienzi, L., Ubaldi, F., Anniballo, R., Cerulo, G., Greco, E. Preincubation of human oocytes may improve fertilization and embryo quality after intracytoplasmic sperm injection. Human Reproduction. 13 (4), 1014-1019 (1998).
- Wale, P. L., Gardner, D. K. The effects of chemical and physical factors on mammalian embryo culture and their importance for the practice of assisted human reproduction. Human Reproduction Update. 22 (1), 2-22 (2016).
- Rienzi, L., et al. Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance. Human Reproduction Update. 23 (2), 139-155 (2017).
- Cimadomo, D., et al. Associations of blastocyst features, trophectoderm biopsy and other laboratory practice with post-warming behavior and implantation. Human Reproduction. , (2018).
- Evans, J., et al. Fresh versus frozen embryo transfer: backing clinical decisions with scientific and clinical evidence. Human Reproduction Update. 20 (6), 808-821 (2014).
- Capalbo, A., et al. Consistent and reproducible outcomes of blastocyst biopsy and aneuploidy screening across different biopsy practitioners: a multicentre study involving 2586 embryo biopsies. Human Reproduction. 31 (1), 199-208 (2016).
- Cimadomo, D., et al. Failure mode and effects analysis of witnessing protocols for ensuring traceability during PGD/PGS cycles. Reproductive Biomedicine Online. 33 (3), 360-369 (2016).
- Gardner, D. K., Schoolcraft, B., Jansen, R., Mortimer, D. . Towards Reproductive Certainty: Infertility and Genetics Beyond 1999. , 377-388 (1999).
- Cimadomo, D., et al. Inconclusive chromosomal assessment after blastocyst biopsy: prevalence, causative factors and outcomes after re-biopsy and re-vitrification. A multicenter experience. Human Reproduction. , (2018).
- de Boer, K. A., Catt, J. W., Jansen, R. P., Leigh, D., McArthur, S. Moving to blastocyst biopsy for preimplantation genetic diagnosis and single embryo transfer at Sydney IVF. Fertility and Sterility. 82 (2), 295-298 (2004).
- Capalbo, A., Rienzi, L. Mosaicism between trophectoderm and inner cell mass. Fertility and Sterility. 107 (5), 1098-1106 (2017).
- McCoy, R. C., et al. Evidence of Selection against Complex Mitotic-Origin Aneuploidy during Preimplantation Development. PLoS Genetics. 11 (10), e1005601 (2015).
- Scott, R. T., Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial. Fertility and Sterility. 100 (3), 624-630 (2013).
- Lee, H., et al. Live births after transfer of rebiopsy and revitrification of blastocyst that had “no diagnosis” following trophectoderm biopsy. Fertility and Sterility. 106 (3), e164 (2016).
- Capalbo, A., et al. Diagnostic efficacy of blastocoel fluid and spent media as sources of DNA for preimplantation genetic testing in standard clinical conditions. Fertility and Sterility. 110 (5), 870-879 (2018).
- Hammond, E. R., Shelling, A. N., Cree, L. M. Nuclear and mitochondrial DNA in blastocoele fluid and embryo culture medium: evidence and potential clinical use. Human Reproduction. 31 (8), 1653-1661 (2016).
- Vera-Rodriguez, M., et al. Origin and composition of cell-free DNA in spent medium from human embryo culture during preimplantation development. Human Reproduction. 33 (4), 745-756 (2018).
