Mikroenjeksiyon ile 3Boyutlu Doku Kaynaklı İnsan Organoid Kültür Sistemlerinde Cryptosporidium Enfeksiyonunun İncelanması
Summary
Biz cryptosporidium parvum tarafından insan bağırsak ve hava yolu organoidleri enfeksiyonu incelemek için ookistler hazırlamak ve sporozoitler arındırmak için protokoller açıklar. Parazitlerin bağırsak organoid lümenine mikroenjeksiyon ve organoidlerin immünboyamı ile ilgili prosedürleri gösteriyoruz. Son olarak, organoidlerden üretilen ookistlerin izolasyonu tarif.
Abstract
Cryptosporidium parvum insan ishal hastalığının başlıca nedenlerinden biridir. Parazitin patolojisini anlamak ve etkili ilaçlar geliştirmek için konaktaki koşulları özetleyen bir in vitro kültür sistemine ihtiyaç vardır. Kökenleri dokulara yakından benzeyen organoidler, konak-parazit etkileşimlerini incelemek için idealdir. Organoidler, erişkin kök hücrelerden elde edilen ve herhangi bir genetik sapma veya dönüşüme maruz kalmadan uzun süre kültürde yetişen üç boyutlu (3D) doku kaynaklı yapılardır. Hem apikal hem de bazolateral yüzeylerde polariteyi iyi tanımlamıştır. Organoidler ilaç testi, biyo bankacılık ve hastalık modelleme ve konak-mikrop etkileşim çalışmalarında çeşitli uygulamalara sahiptir. Burada insan bağırsak ve hava yolu organoidleri enfekte cryptosporidium oocysts ve sporozoitler hazırlamak için nasıl bir adım-adım protokol sıyoruz. Daha sonra mikroenjeksiyon un mikropların organoid lümene enjekte edilmesinde nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz. Organoidlerin konak-mikrop etkileşimi çalışmaları için kullanılabilen üç ana yöntem vardır: mikroenjeksiyon, mekanik kesme ve kaplama, ve monolayers yaparak. Mikroenjeksiyon, 3B yapının bakımını sağlar ve parazit hacimlerinin hassas kontrolünü ve mikroplar için doğrudan apikal yan kontak sağlar. Biz görüntüleme veya ookist üretimi için organoidlerin optimal büyüme için ayrıntıları sağlar. Son olarak, biz de nasıl yeni oluşturulan ookistler daha aşağı işleme ve analiz için organoid izole edilebilir göstermek.
Introduction
Cryptosporidium enfeksiyonunun tedavisi ve önlenmesi için ilaç veya aşıların geliştirilmesi, insanlardaki in vivo durumunu tam olarak taklit eden in vitro sistemlerin eksikliği nedeniyle engellenmiştir1,2. Şu anda mevcut sistemlerin çoğu ya sadece kısa süreli enfeksiyon (<5 gün) izin veya parazit 3 tam yaşam döngüsünü desteklemiyor3,4. Parazitin tam gelişimini sağlayan diğer sistemler, insanlardaki fizyolojik durumu sadakatle özetlemeyen ölümsüzleştirilmiş hücre hatlarına veya kanser hücresi hatlarına dayanır5,6,7 . Organoidler veya ‘mini organlar’ çeşitli doku spesifik büyüme faktörleri ile desteklenen bir ekstrasellüler matris yetiştirilen 3D doku türetilmiş yapılardır. Organoidler çeşitli organ ve dokulardan geliştirilmiştir. Genetik olarak stabildirler ve kökenlerindeki organların işlevlerinin çoğunu yeniden özetlerler ve kültürde uzun süre korunabilirler. Biz cryptosporidium ile insan bağırsak ve akciğer organoidleri enfekte etmek için bir yöntem geliştirdik bağırsak ve solunum cryptosporidiosis ile ilgili konak-parazit etkileşimleri çalışması için doğru bir in vitro modeli sağlar8 ,9,10,11,12,13. Diğer yayınlanan kültür modellerinin aksine, organoid sistem gerçek hayattaki ev sahibi parazit etkileşimlerini temsil eder, yaşam döngüsünün tamamlanmasına izin verir, böylece parazit yaşam döngüsünün tüm aşamaları incelenebilir ve parazit yayılımını sürdürür 28 güne kadar10.
Cryptosporidium parvum, solunum ve bağırsak hastalıklarının epitelyumuna bulaştıran ve uzun süreli ishal hastalığına neden olan apikompleks bir parazittir. Dirençli çevre aşaması, kontamine gıda ve su14bulunan ookist, olduğunu. Bir kez yutulan veya solunan, ookist ekstistler ve epitel hücrelerine eklemek dört sporozoitler bültenleri. Sporozoitler konak hücreleri üzerinde süzülür ve konak hücre reseptörlerini meşgul, ama parazit tam hücre işgal etmez, ve onu yutmak için konak hücre ikna etmek için görünür15. Hücre içi ama ekstrasitoplazmik bir bölmede içselleştirilen parazit, hücrenin apikal yüzeyinde kalır ve parasitoforik vakuol içinde çoğalır. Bu eşeysiz üreme iki tur uğrar- merogony denilen bir süreç. Merogony sırasında, tip I merontlar yeni hücreleri istila etmek için yayımlanan sekiz merozoitler içeren geliştirmek. Bu merozoitler dört merozoit içeren tip II merontlar geliştirmek için yeni hücreler işgal. Bu merozoitler, serbest bırakıldığında, hücreleri enfekte ve macrogamonts ve microgamonts gelişir. Mikrogametler serbest bırakılır ve ookistlere dönüşen zigotlar üreten makrogametleri döllerler. Olgun ookistler daha sonra lümen içine serbest bırakılır. Oocysts ya ince duvarlı olan hemen epitel reinfect için ekstst, ya da bir sonraki konak14enfekte etmek için çevreye salınan kalın duvarlı . Cryptosporidium yaşam döngüsünün tüm aşamaları daha önce grup10tarafından geliştirilen organoid kültür sisteminde tanımlanmıştır.
İnsan organoidler sadakatle insan dokularıçoğaltmakberi 9,11,13, ve Cryptosporidiumtüm çoğaltıcı aşamaları desteklemek10, onlar çalışmak için ideal doku kültür sistemi Cryptosporidium biyolojisi ve ev sahibi parazit etkileşimleri. Burada hem Cryptosporidium ookistler hem de ekstisli sporozoitlerle organoidlere bulaşmaya ve bu doku kültür sisteminde üretilen yeni ookistlerin izole edilmesine yönelik prosedürleri açıklıyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bağırsak ve hava yolu organoidlerinde Cryptosporidium parazitkültürü, konak-parazit etkileşimlerini incelemek için doğru bir model sağlar10 ama aynı zamanda birçok uygulama vardır. Örneğin, genetik olarak modifiye Cryptosporidium parazitlerinin seçilmesi ve yayılması için mevcut yöntemler, in vivo enfeksiyon için gerekli modifikasyonlara sahip parazitlerin izolasyonuna izin vermeyen fareler19’da geçiş gerektirir. Cryptosporidium</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Deborah A. Schaefer Hayvan ve Karşılaştırmalı Biyomedikal Bilimler Okulu, University of Agriculture and Life Sciences, University of Arizona, Tucson, AZ, ABD ookist üretim ve analiz ile bize yardımcı olduğu için müteşekkiriz. Ayrıca Franceschi Mikroskobu ve Görüntüleme Merkezi ve Washington State Üniversitesi’nde D.L. Mullendore’ye TEM hazırlığı ve izole organoid ookistlerin görüntülenmesi için teşekkür ederiz.
D.D. Hollanda Bilimsel Araştırma Örgütü’nden (NWO-ALW, 016.Veni.171.015) VENI bursu almaktadır. I.H. Hollanda Bilimsel Araştırma Örgütü’nden (NWO-ALW, 863.14.002) ve Avrupa Komisyonu’ndan Marie Curie bursları tarafından desteklenmiştir (Öneri 330571 FP7-PEOPLE-2012-IIF). Bu sonuçlara yol açan araştırma, 67013 sayılı ERC İleri Hibe Anlaşması uyarınca Avrupa Araştırma Konseyi’nden ve R21 AT009174 kapsamında NIH NIAIH’den RMO’ya kaynak almıştır. Bu çalışma, kısmen Hollanda Kanser Derneği tarafından finanse edilen ve Hollanda Kanser Derneği’nin bir bağışı ile finanse edilen Oncode Enstitüsü’nün bir parçasıdır.
Materials
| Basement membrane extract (extracellular matrix) | amsbio | 3533-010-02 | |
| Crypt-a-Glo antibody (Oocyst specific antibody) | Waterborne, Inc | A400FLR-1X | Final Concentration = Use 2-3 drops/slide |
| Crypto-Grab IgM coated Magnetic beads | Waterborne, Inc | IMS400-20 | |
| Dynamag 15 rack | Thermofisher Scientific | 12301D | |
| Dynamag 2 rack | Thermofisher Scientific | 12321D | |
| EMD Millipore Isopore Polycarbonate Membrane Filters- 3µm | EMD-Millipore | TSTP02500 | |
| Fast green dye | SIGMA | F7252-5G | |
| Femtojet 4i Microinjector | Eppendorf | 5252000013 | |
| Glass capillaries of 1 mm diameter | WPI | TW100F-4 | |
| Matrigel (extracellular matrix) | Corning | 356237 | |
| Microfuge tube 1.5ml | Eppendorf | T9661-1000EA | |
| Micro-loader tips | Eppendorf | 612-7933 | |
| Micropipette puller P-97 | Shutter instrument | P-97 | |
| Normal donkey Serum | Bio-Rad | C06SB | |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | |
| Sodium hypoclorite (use 5%) | Clorox | 50371478 | |
| Super stick slides | Waterborne, Inc | S100-3 | |
| Swinnex-25 47mm Polycarbonate filter holder | EMD-Millipore | SX0002500 | |
| Taurocholic acid sodium salt hydrate | SIGMA | T4009-5G | |
| Tween-20 | Merck | 8221840500 | |
| Vectashield mounting agent | Vector Labs | H-1000 | |
| Vortex Genie 2 | Scientific industries, Inc | SI0236 | |
| Adv+++ (DMEM+Penstrep+Glutamax+Hepes) | Final amount | ||
| DMEM | Invitrogen | 12634-010 | 500ml |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | 5ml of stock in 500ml DMEM |
| Glutamax | Gibco | 35050038 | 5ml of stock in 500ml DMEM |
| Hepes | Gibco | 15630056 | 5ml of stock in 500ml DMEM |
| INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OME (Expansion media) | Final concentration | ||
| A83-01 | Tocris | 2939-50mg | 0.5µM |
| Adv+++ | make upto 100 ml | ||
| B27 | Invitrogen | 17504044 | 1X |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | 50ng/mL |
| Gastrin | Tocris | 3006-1mg | 10 nM |
| NAC | Sigma | A9125-25G | 1.25mM |
| NIC | Sigma | N0636-100G | 10mM |
| Noggin CM | In house* | 10% | |
| P38 inhibitor (SB202190) | Sigma | S7076-25 mg | 10µM |
| PGE2 | Tocris | 2296/10 | 10 nM |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | 1ml/500ml media |
| RSpoI CM | In house* | 20% | |
| Wnt3a CM | In house* | 50% | |
| In house* – cell lines will be provided upon request | |||
| INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OMD (Differentiation media) | To differentiate organoids, expanding small intestinal organoids were grown in a Wnt-rich medium for six to seven days after splitting, and then grown in a differentiation medium (withdrawal of Wnt, nicotinamide, SB202190, in a differentiation medium (withdrawal of Wnt, nicotinamide, SB202190, prostaglandin E2 from a Wnt-rich medium or OME) | ||
| LUNG ORGANOID MEDIA- LOM (Differentiation media) | Final concentration | ||
| Adv+++ | make upto 100 ml | ||
| ALK-I A83-01 | Tocris | 2939-50mg | 500nM |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | 0.0763888889 |
| FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 100ng/ml |
| FGF-7 | Peprotech | 100-19 | 25ng/ml |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9125-25G | 1.25mM |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | 5mM |
| Noggin UPE | U-Protein Express | Contact company directly | 10% |
| p38 MAPK-I | Sigma | S7076-25 mg | 1µM |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | 1:500 |
| RhoKI Y-27632 | Abmole Bioscience | M1817_100 mg | 2.5µm |
| Rspo UPE | U-Protein Express | Contact company directly | 10% |
| Reducing buffer (for resuspension of oocysts and sporozoites for injection) | Final concentration | ||
| L-Glutathione reduced | Sigma | G4251-10MG | 0.5 μg/μl of OME/OMD/LOM |
| Betaine | Sigma | 61962 | 0.5 μg/μl of OME/OMD/LOM |
| L-Cysteine | Sigma | 168149-2.5G | 0.5 μg/μl of OME/OMD/LOM |
| Linoleic acid | Sigma | L1376-10MG | 6.8 μg/ml of OME/OMD /LOM |
| Taurine | Sigma | T0625-10MG | 0.5 μg/μl of OME/OMD/LOM |
| Blocking buffer (for immunoflourescence staining) | Final concentration | ||
| Donkey/Goat serum | Bio-Rad | C06SB | 2% |
| PBS | Thermo-Fisher | 70011044 | Make upto 100ml |
| Tween 20 | Merck | P1379 | 0.1% |
| List of Antibodies used | |||
| Alexa 568 goat anti-rabbit | Invitrogen | A-11011 | Dilution-1:500; RRID: AB_143157 |
| Crypt-a-Glo Comprehensive Kit- Fluorescein-labeled antibody Crypto-Glo | Waterborne, Inc | A400FLK | Dilution- 1:200 |
| Crypta-Grab IMS Beads- Magnetic beads coated in monoclonal antibody reactive | Waterborne, Inc | IMS400-20 | Dilution-1:500 |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | D1306 | Dilution-1:1000; RRID : AB_2629482 |
| Phalloidin-Alexa 674 | Invitrogen | A22287 | Dilution-1:1000; RRID: AB_2620155 |
| Rabbit anti-gp15 antibody generated by R. M. O’Connor (co-author). | Upon request | Upon request | Dilution-1:500 |
| Sporo-Glo | Waterborne, Inc | A600FLR-1X | Dilution- 1:200 |
References
- Checkley, W., et al. A review of the global burden, novel diagnostics, therapeutics, and vaccine targets for Cryptosporidium. The Lancet Infectious Diseases. 15 (1), 85-94 (2015).
- Bones, A. J., et al. Past and future trends of Cryptosporidium in vitro research. Experimental Parasitology. 196, 28-37 (2018).
- Muller, J., Hemphill, A. In vitro culture systems for the study of apicomplexan parasites in farm animals. International Journal for Parasitology. 43 (2), 115-124 (2013).
- Karanis, P., Aldeyarbi, H. M. Evolution of Cryptosporidium in vitro culture. International Journal for Parasitology. 41 (12), 1231-1242 (2011).
- Morada, M., et al. Continuous culture of Cryptosporidium parvum using hollow fiber technology. International Journal for Parasitology. 46 (1), 21-29 (2016).
- DeCicco RePass, M. A., et al. Novel Bioengineered Three-Dimensional Human Intestinal Model for Long-Term Infection of Cryptosporidium parvum. Infection and Immunity. 85 (3), (2017).
- Miller, C. N., et al. A cell culture platform for Cryptosporidium that enables long-term cultivation and new tools for the systematic investigation of its biology. International Journal for Parasitology. 48 (3-4), 197-201 (2018).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modelling. bioRxiv. , (2018).
- Dutta, D., Clevers, H. Organoid culture systems to study host-pathogen interactions. Current Opinion in Immunology. 48, 15-22 (2017).
- Heo, I., et al. Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids. Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- O’Hara, S. P., Chen, X. M. The cell biology of Cryptosporidium infection. Microbes and Infection. 13 (8-9), 721-730 (2011).
- Lendner, M., Daugschies, A. Cryptosporidium infections: molecular advances. Parasitology. 141 (11), 1511-1532 (2014).
- Feng, H., Nie, W., Sheoran, A., Zhang, Q., Tzipori, S. Bile acids enhance invasiveness of Cryptosporidium spp. into cultured cells. Infection and Immunity. 74 (6), 3342-3346 (2006).
- O’Connor, R. M., Kim, K., Khan, F., Ward, H. Expression of Cpgp40/15 in Toxoplasma gondii: a surrogate system for the study of Cryptosporidium glycoprotein antigens. Infection and Immunity. 71, 6027-6034 (2003).
- Wilke, G., et al. Monoclonal Antibodies to Intracellular Stages of Cryptosporidium parvum Define Life Cycle Progression In Vitro. mSphere. 3 (3), (2018).
- Vinayak, S., et al. Genetic modification of the diarrhoeal pathogen Cryptosporidium parvum. Nature. 523 (7561), 477-480 (2015).
- Dijkstra, K. K., et al. Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids. Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).
